Name: Cistrome Analysis in Mouse Muscle Stem Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cistrome Analysis in Mouse Muscle Stem Cells at JoVE.com

Vi tackar Anastasia Bannwarth för utmärkt teknisk assistans. Vi tackar IGBMC:s djurhusanläggning, cellodlingen, Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrike), avbildningen, elektronmikroskopin, flödescytometrin och GenomEast-plattformen, en medlem av konsortiet "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).
Detta arbete från det tvärvetenskapliga tematiska institutet IMCBio, som en del av ITI-programmet 2021-2028 vid Strasbourgs universitet, CNRS och Inserm, stöddes av IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) och av SFRI-STRAT'US-projektet (ANR 20-SFRI-0012) och EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) inom ramen för det franska programmet Investments for the Future. Ytterligare finansiering tillhandahölls av INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategiska program 24376 (till D.D.), INSERM young research grant (till D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, och en fransk statlig fond som förvaltas av ANR inom ramen för ramprogrammet Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. stöddes av programmet CDFA-07-22 från Université franco-allemande och Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, och K.G. av Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Möss hölls i ett ackrediterat djurstall, i enlighet med nationella riktlinjer för djurvård (Europeiska kommissionens direktiv 86/609/EEG; Franskt dekret nr 87-848) om användning av försöksdjur för forskning. Planerade manipulationer lämnades in till den etiska kommittén (Com'Eth, Strasbourg, Frankrike) och till det franska forskningsministeriet (MESR) för etisk utvärdering och godkännande enligt 2010/63/EU-direktivet under APAFIS-nummer #22281.
1. Beredning av cellsuspension...

Satellite Cell Isolation from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle:+a+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes.">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li><li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells.">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).</li><li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation.">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li><li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+function,+self-renewal,+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche.">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li><li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation.">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li><li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells.">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li><li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue.">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 20 (1), 139 (2018).</li><li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles:+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques.">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li><li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network.">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).</li><li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers.">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling.">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&amp;RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools2:+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis.">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li><li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Atlas+2021+update:+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq,+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data.">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+human+islet+isolation+utilizing+recombinant+collagenase.">Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase.</a> Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).</li><li>Nikolic, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets.">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+myoblastoma+cell+differentiation+and+proliferation+is+stimulated+by+androgens+and+associated+with+a+modulation+of+myostatin+and+Pax7+expression.">C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).</li><li>Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+for+modulation+of+the+nuclear+receptor+superfamily.">Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).</li><li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription.">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li><li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age.">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li><li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).</li><li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle.">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li><li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield,+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets.">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li><li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques.">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li><li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa.">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li></ol>

Den aktuella studien redovisar en standardiserad, tillförlitlig och lättanvänd metod för isolering och odling av mussatellitceller, samt bedömning av transkriptionsreglering med CUT&RUN-metoden.
Detta protokoll omfattar flera kritiska steg. Den första är muskelstörningar och fibersmältning för att säkerställa ett stort antal insamlade celler. Trots den ökade enzymkoncentrationen erhölls fler levande celler än med hjälp av protokoll 1. Satellitceller uttrycker ett specifikt mön...

Tvärstrimmiga skelettmuskler utgör i genomsnitt 40 % av vikten av den totala människokroppen1. Muskelfibrer uppvisar en anmärkningsvärd förmåga till regenerering vid skada, vilket beskrivs av sammansmältningen av nybildade myocyter och genereringen av nya myofibrer som ersätter de skadade2. År 1961 rapporterade Alexander Mauro en population av mononukleära celler som han kallade satellitceller3. Dessa stamceller uttrycker transkriptionsfaktorn parad box 7 (PAX7) och är belägna mellan den basala laminan och sarkolemma av muskelfibrer4. De rapporterades uttrycka kluster av differentiering 34 (CD34; en hematopoetisk, endotelial stamcellsmarkör och mesenkymal stamcellsmarkör), integrin alfa 7 (ITGA7; en markör för glatt muskulatur, hjärt- och skelettmuskulatur), såväl som C-X-C-kemokinreceptorn typ 4 (CXCR4; en lymfocyt-, hematopoetisk och satellitcellmarkör)5. Under basala förhållanden befinner sig satellitceller i en viss mikromiljö som håller dem i ett vilande tillstånd6. Vid muskelskador aktiveras de, förökar sig och genomgår myogenes7. Men eftersom de bara bidrar till en mindre del av det totala antalet muskelceller är deras genomomfattande analyser särskilt utmanande, särskilt under fysiologiska miljöer (<1 % av det totala antalet celler).
Olika metoder för kromatinisolering från satellitceller har beskrivits, vilka involverar kromatinimmunprecipitering följt av massiv parallell sekvensering (ChIP-seq) eller klyvning under targets och tagmentation (CUT&Tag) experiment. Ändå har dessa två tekniker några betydande begränsningar som förblir oemotsagda. Faktum är att ChIP-seq kräver en stor mängd utgångsmaterial för att generera tillräckligt med kromatin, varav en stor del går förlorad under ultraljudsbehandlingen. CUT&Tag är mer lämpligt för lågt cellantal, men genererar fler klyvningsställen utanför målet än ChIP-seq på grund av Tn5-transposasaktiviteten. Dessutom, eftersom detta enzym har en hög affinitet för öppna kromatinregioner, kan CUT&Tag-metoden företrädesvis användas för att analysera histonmodifieringar eller transkriptionsfaktorer associerade med aktivt transkriberade regioner i genomet, istället för tystat heterokromatin 8,9.
Här presenteras ett detaljerat protokoll som gör det möjligt att isolera musmuskelsatellitceller med FACS för klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN)10,11-analys. De olika stegen involverar mekanisk störning av vävnad, cellsortering och isolering av kärnor. Metodens effektivitet, när det gäller beredning av en livskraftig cellsuspension, demonstrerades genom att utföra CUT&RUN-analys för kovalenta histonmodifieringar och transkriptionsfaktorer. Kvaliteten på isolerade celler gör den beskrivna metoden särskilt attraktiv för att framställa kromatin som fångar det ursprungliga genomiska beläggningstillståndet troget, och är sannolikt lämplig för att fånga kromosomkonformationen i kombination med storskalig sekvensering på specifika loci (4C-seq) eller på genomomfattande nivåer (Hi-C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2080422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtube</td>
			<td>Star Lab</td>
			<td>S1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tubes</td>
			<td>CORNING-FALCON</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AR</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab108341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0341-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0451-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CXCR4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DMD</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-H3K27ac</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-H3K4me2</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ITGA7</td>
			<td>MBL</td>
			<td>k0046-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PAX7</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>AB_528428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TER119</td>
			<td>BD Pharmingen TM</td>
			<td>553673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>86057-3</td>
			<td>BioMag&#174;Plus Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0011</td>
			<td>Centrifuge 5415 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5805000010</td>
			<td>Centrifuge 5804 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>171080</td>
			<td>Syst&#232;me Nunc&#8482; Lab-Tek&#8482; Chamber Slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning agent</td>
			<td>Sigma&#160;&#160;</td>
			<td>SLBQ7780V</td>
			<td>RNaseZAPTM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, type I&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17100017</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td>5 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag&#8482;-2 Aimant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD FACSAria&#8482; Fusion Flow Cytometer</td>
			<td>23-14816-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genome browser&#160;</td>
			<td>IGV</td>
			<td></td>
			<td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning&#174;&#160;</td>
			<td>354277</td>
			<td>Matrigel hESC qualified matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>Image J&#174;</td>
			<td></td>
			<td>V 1.8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>PARAFILM&#174; M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase LT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propyl gallate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer&#160;</td>
			<td>Illumina Hiseq 4000</td>
			<td>SY-401-4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Bioblock Scientific polytest 20</td>
			<td>18724</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient protocol for cut&amp;run analysis of facs-isolated mouse satellite cells

Genomomfattande analyser med små cellpopulationer är ett stort hinder för studier, särskilt inom stamcellsområdet. Detta arbete beskriver ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av satellitceller från extremitetsmuskeln, en vävnad med ett högt innehåll av strukturella proteiner. Dissekerade extremitetsmuskler från vuxna möss stördes mekaniskt genom malning i medium kompletterat med dispase och kollagenas typ I. Vid matsmältningen filtrerades homogenatet genom cellsilar och cellerna suspenderades i FACS-buffert. Viabiliteten bestämdes med fixerbar viabilitetsfläck och immunfärgade satellitceller isolerades med FACS. Celler lyserades med Triton X-100 och frigjorda kärnor bands till konanavalin A magnetiska pärlor. Kärn-/pärlkomplex inkuberades med antikroppar mot transkriptionsfaktorn eller histonmodifieringar av intresse. Efter tvätt inkuberades kärn-/pärlkomplex med protein A-mikrokocknukleas, och kromatinklyvning initierades med CaCl2. Efter DNA-extraktion genererades och sekvenserades bibliotek, och profilerna för genomomfattande transkriptionsfaktorbindning och kovalenta histonmodifieringar erhölls genom bioinformatisk analys. De toppar som erhölls för de olika histonmarkeringarna visade att bindningshändelserna var specifika för satellitceller. Dessutom avslöjade känd motivanalys att transkriptionsfaktorn var bunden till kromatin via dess kognata responselement. Detta protokoll är därför anpassat för att studera genreglering i vuxna mösss muskelsatellitceller.

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Satellitceller från musskelettmuskler isolerades genom att kombinera protokollen från Gunther et al. (nedan protokoll 1)12 och från Liu et al.23 (nedan kallat protokoll 2). Eftersom icke-smälta muskelfibrer observerades efter matsmältning vid användning av den koncentration av kollagenas och dispase som föreslogs i protokoll 1, ökades mängden enzymer för att förbättra muskelfiberdissociationen, som beskrivs i steg 1.2.1 och 1.2.3. Som anges i protokoll 2 utsatte...

Watch this Scientific Journal Video about Cistrome Analysis in Mouse Muscle Stem Cells at JoVE.com

Cistrome Analysis in Mouse Muscle Stem Cells (Video) | JoVE

Här presenteras ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av muskelsatellitceller i musextremiteter anpassade för studier av transkriptionsreglering i muskelfibrer genom klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN).

Ett effektivt protokoll för CUT&amp;RUN-analys av FACS-isolerade mussatellitceller

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Sedan mer än 20 år är vårt labb intresserat av nukleära receptorers patofysiologiska roll. För att dechiffrera deras in vivo-funktion konstruerade vi en musmodell som tillåter rumslig och tidsmässig kontroll av deras uttryck. Parallellt utvecklade vi banbrytande tekniker för att undersöka deras molekylära funktion i musvävnader.Vårt vetenskapliga intresse ledde oss nyligen till att bestämma sekosteroid- och steroidreceptorsignalering i olika vävnader, inklusive skelettmuskulatur. Vi har nyligen visat att androgenreceptorn i myofibrer som differentierar celler i skelettmuskulaturen är avgörande för deras kontraktila och metaboliska funktioner. Våra senaste fynd ger en djupare förståelse för skelettmuskulaturens patofysiologiska dynamik som är avgörande för att utveckla effektiva behandlingar för muskelrelaterade sjukdomar.Vi utvecklade detta protokoll för att kunna utföra cistromanalys på muskelstamceller in vivo. Alla tidigare protokoll använde in vitro-modaler, vilket helt frikopplar undersökningen från en hel organismkontext. Förutom att vara billigt och tidseffektivt, ger detta protokoll en effektiv experimentell miljö för att studera transkriptionsfaktorrekrytering och kromatinlandskap i skelettmuskelstamceller.Kromatin framställt av detta protokoll har gett den första genomomfattande analysen av AR-cistrom i satellitceller och kommer att underlätta framtida studier av genreglering. Vårt framtida mål skulle bland annat vara att utvidga dessa undersökningar till andra oxosteroidreceptorer och utforska deras specifika medregulatorer i de olika celltyper som är involverade i regenereringsprocessen i skelettmuskulaturen.