Name: Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-02T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality at JoVE.com

Raz Zarivach wird von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef und Arie Moran werden von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 2047/20). Wir danken Daniel Gitler und seiner Gruppe an der Ben-Gurion-Universität für die Zusammenarbeit, Unterstützung und Expertise.

1. Zelltransfektion
<ol><li>Kultur HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 bis zum Zusammenfluss auf einer 10 cm großen Platte (8,8 x 106 Gesamtzellen).</li>
	<li>Legen Sie ein 13-mm-Deckglas in jede der Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Verdünnen Sie 0,44 x 106...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

<ol>
	<li>Lindskog, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+carbonic+anhydrase.">Structure and mechanism of carbonic anhydrase.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).</li><li>Rutherford, J. C., Bird, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal-responsive+transcription+factors+that+regulate+iron,+zinc,+and+copper+homeostasis+in+eukaryotic+cells.">Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells.</a> Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).</li><li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+Biochemistry:+From+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life.">Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).</li><li>Kimura, T., Kambe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+metallothionein+and+ZIP+and+ZnT+transporters:+An+overview+and+perspective.">The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).</li><li>Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+ZIP+and+ZnT+zinc+transporters+in+human+health+and+diseases.">Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).</li><li>Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological,+biochemical,+and+molecular+roles+of+zinc+transporters+in+zinc+homeostasis+and+metabolism.">The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism.</a> Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).</li><li>Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporters+as+potential+therapeutic+targets:+An+updated+review.">Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).</li><li>Kambe, T., Taylor, K. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+zinc+transporter+protein-1+(ZnT-1)+in+the+brain+of+subjects+with+mild+cognitive+impairment,+early,+and+late-stage+Alzheimer's+disease.">Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease.</a> Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).</li><li>Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+zinc+transporter+proteins+ZnT-1,+ZnT-4+and+ZnT-6+in+preclinical+Alzheimer's+disease+brain.">Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain.</a> Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).</li><li>Tsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+zinc+transporter+gene,+ZnT-1,+is+induced+after+transient+forebrain+ischemia+in+the+gerbil.">Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).</li><li>Palmiter, R. d., Findley, S. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+mammalian+zinc+transporter+that+confers+resistance+to+zinc.">Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc.</a> The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).</li><li>Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+overview+of+the+zinc+transporters+in+the+cation+diffusion+facilitator+family.">A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).</li><li>Shapiro, S. S., Wilk, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+variance+test+for+normality+(complete+samples).">An analysis of variance test for normality (complete samples).</a> Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).</li><li>Mann, H. B., Whitney, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+a+test+of+whether+one+of+two+random+variables+is+stochastically+larger+than+the+other.">On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).</li><li>Darling, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov,+Cramer-von+Mises+tests.">The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).</li><li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium.">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li><li>Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+zinc+in+living+cells.:+A+new+generation+of+sensitive+and+selective+fluorescent+probes.">Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes.</a> Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).</li><li>Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mitochondrial+fluorescent+zinc+sensor.">A new mitochondrial fluorescent zinc sensor.</a> Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).</li><li>Hessels, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eZinCh-2:+A+versatile,+genetically+encoded+FRET+sensor+for+cytosolic+and+intraorganelle+Zn2++imaging.">eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging.</a> ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).</li><li>S&#225;nchez-Mart&#237;n, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsphere-based+real-time+calcium+sensing.">Microsphere-based real-time calcium sensing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).</li><li>Namdarghanbari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+of+the+zinc+sensor+FluoZin-3+with+Zn7-metallothionein:+Inquiry+into+the+existence+of+a+proposed+weak+binding+site.">Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).</li><li>Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+intracellular+free+calcium+and+zinc+using+fura-2FF+and+FluoZin-3.">Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3.</a> Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).</li></ol>

Die oben beschriebene Methode ermöglicht die direkte Messung der intrazellulären Zinkkonzentration mit hoher zeitlicher Auflösung. Im Vergleich zu anderen Methoden kann diese Methode, bei der Veränderungen des intrazellulärenZn2+ überwacht werden, das Hintergrundrauschen erheblich verringern. Darüber hinaus eliminiert die Selektivität des Farbstoffs für Zink mögliche Kreuzwechselwirkungen mit anderen Metallkationen18,19. Schließlich ermögli...

Zink ist ein essentielles Spurenelement im zellulären Milieu. Es enthält ein Drittel aller Proteine und ist an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, wie z. B. Katalyse1, Transkription2 und Strukturmotive3. Obwohl sie redoxinert sind, sind hohe Zinkkonzentrationen für die Zelle toxisch, weshalb kein Säugetierorganismus ohne das Vorhandensein von Mechanismen zur Regulierung der Zinkhomöostase überlebt hat. Bei Säugetieren sind drei Mechanismen für diesen Prozess verantwortlich: (1) Metallothionine, das sind zytosolische Cystein-reiche Proteine, die Zink mit hoher Affinität binden und so einen Überschuss an freiem zytosolischem Zink verhindern4; (2) Zrt/Irt-ähnliche Proteine (ZIPs), bei denen es sich um Zinktransporter handelt, die für den Zinkeinstrom in das Zytosol durch die Plasmamembran oder aus intrazellulären Organellen verantwortlich sind 4,5,6,7,8; und (3) ZnTs, die eine Säugetier-Untergruppe der ubiquitären Familie der Kationen-Diffusions-Facilitatoren (CDF) sind und Zinktransporter sind, da sie Zink aus dem Zytosol über die Plasmamembran oder in die intrazellulären Organellen extrudieren 4,5,6,7,8,9. Aufgrund der Bedeutung von Zink für den Zellstoffwechsel ist es wichtig, die zelluläre Zinkdynamik zu verstehen.
Bisherige Methoden zur Beurteilung der Zinkdynamik beruhten auf der Bewertung der Expressionsniveaus von mRNA unter verschiedenen Zinkbedingungen, indem sie mit zellulären Zinkmessungen von fixierten Geweben oder Zellen korreliertwurden 10,11,12. Zu diesen Methoden gehören der chemische Nachweis und die immunhistochemische Färbung. Diese Methoden liefern jedoch nur indirekte Messungen und bestimmen somit nur eine Offline-Korrelation zwischen der intrazellulären Zinkkonzentration und der Expression von Zinktransportern. Folglich können diese Methoden keine Parameter ableiten, die eine hohe zeitliche Auflösung erfordern.
Für eine direktere Messung desZn2+ -Transports werden radioaktive Isotope von Zink13 verwendet. Diese Methode beruht auf der Messung von radioaktiv markiertem Zn2+ , um den Zinktransport und seine Kinetik zu überwachen. Aufgrund der Bedeutung von Zink für die zelluläre Homöostase regulieren jedoch mehrere zelluläre Prozesse die intrazelluläre Zinkkonzentration. Dazu gehören die extrazelluläre Bindung und mehrere Transportsysteme, die zusammenarbeiten, um eine strenge Kontrolle über den intrazellulärenZn2+ -Spiegel aufrechtzuerhalten. Durch die Kombination dieser Prozesse entsteht ein erhebliches Hintergrundrauschen, das es schwierig macht, einzelne zinkbezogene Transportfunktionen zu testen.
Dieser Artikel demonstriert eine Methode zur direkten Überwachung der Zinktransportrate durch Messung der intrazellulären Konzentration von freiem Zink mit einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3. Der Farbstoff hat eine hohe Spezifität fürZn2+ und geringe Interferenzen durch andere zweiwertige Kationen, wie z. B. Kalzium. Darüber hinaus gelangt es in seiner Esterform durch nichtionische Diffusion in die Zellen und wird dann aufgrund der Aktivität der intrazellulären Diesterase gefangen. Daher korreliert seine Fluoreszenz in erster Linie mit der Konzentration des freien zytosolischen Zinks. Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransporter 1 (ZnT1), einem Mitglied der ZnT-Familie, zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm coverslips</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>111530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm cover slides</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>101050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>bioWorld</td>
			<td>22070008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Glentham Life Science</td>
			<td>GC6947</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#8217;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH</td>
			<td>Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-55-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F24195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 0.8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HEPES10</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo 5.5 sCMOS camera</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DC-152Q-FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>163823</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrithione</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3261</td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>W4 64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>190305</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 120 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31665</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mammalian zinc transporters using an in vitro zinc transport assay

Übergangsmetalle wieZn2+-Ionen müssen aufgrund ihrer zellulären Toxizität streng reguliert werden. Bisher wurde die Aktivität von Zn2+-Transportern indirekt gemessen, indem das Expressionsniveau des Transporters unter verschiedenen Konzentrationen vonZn2+ bestimmt wurde. Dies geschah mit Hilfe der Immunhistochemie, der Messung von mRNA im Gewebe oder der Bestimmung des zellulärenZn2+-Spiegels. Mit der Entwicklung intrazellulärerZn2+-Sensoren werden die Aktivitäten von Zinktransportern derzeit hauptsächlich durch die Korrelation von Veränderungen des intrazellulären Zn 2+, die mit fluoreszierenden Sonden nachgewiesen werden, mit der Expression der Zn2+-Transporter bestimmt. Doch auch heute noch beobachten nur wenige Labore die dynamischen Veränderungen des intrazellulärenZn2+ und messen damit direkt die Aktivität von Zinktransportern. Ein Teil des Problems besteht darin, dass von den 10 Zinktransportern der ZnT-Familie, mit Ausnahme von ZnT10 (transportiert Mangan), nur Zinktransporter 1 (ZnT1) an der Plasmamembran lokalisiert ist. Daher ist es schwierig, die Transportaktivität mit Änderungen der intrazellulärenZn2+-Konzentration in Verbindung zu bringen. Dieser Artikel beschreibt einen direkten Weg zur Bestimmung der Zinktransportkinetik mit einem Assay, der auf einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3, basiert. Dieser Farbstoff wird in seiner Esterform in Säugetierzellen geladen und dann aufgrund der zellulären Diesteraseaktivität im Zytosol gefangen. Die Zellen werden mit Zn2+ beladen, indem dasZn2+-Ionophor Pyrithion verwendet wird. Die ZnT1-Aktivität wird aus dem linearen Teil der Fluoreszenzreduktion nach der Zellauswaschung beurteilt. Die gemessene Fluoreszenz bei einer Anregung von 470 nm und einer Emission von 520 nm ist proportional zum freien intrazellulären Zn2+. Die Auswahl der Zellen, die ZnT1 exprimieren, die mit dem mCherry-Fluorophor markiert sind, ermöglicht es, nur die Zellen zu überwachen, die den Transporter exprimieren. Dieser Assay wird verwendet, um den Beitrag verschiedener Domänen des ZnT1-Proteins zum Transportmechanismus von humanem ZnT1 zu untersuchen, einem eukaryotischen Transmembranprotein, das überschüssiges Zink aus der Zelle extrudiert.

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

ZnT1 ist ein Zinktransporter von Säugetieren, der sich auf der Zellplasmamembran13 befindet. Es ist ein Mitglied der Familie der Kationendiffusions-Facilitatatoren (CDF), die Zink aus dem Zytosol in das extrazelluläre Millieu extrudieren14. ZnT1 hat eine Zwei-Domänen-Architektur: die Transmembrandomäne, die die Ionen durch die Membran transportiert, und eine C-terminale Domäne14. Im Gegensatz zu anderen bekannten CDF-Proteinen besitzt ZnT1 eine ...

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Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Die Messung des Zinktransports hat sich aufgrund der schwachen kausalen Verbindungen zur Proteinfunktion und der geringen zeitlichen Auflösung als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Überwachung der Zn2+-Extrusion aus lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung eines Zn2+-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der eine direkte Messung desZn2+-Ausflusses ermöglicht.

Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

Meine Forschung konzentriert sich auf die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransportern in Säugetieren, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Regulationsmechanismus. Aufgrund der Bedeutung von Zinkionen für die Zellfunktion ist es schwierig, eine genaue Messung der zellulären Zinkdynamik zu erhalten. Unser Protokoll adressiert das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis und die geringe zeitliche Auflösung der Zinkdynamik.Diese Methode ermöglicht es, den Zinkeinstrom durch die Zellmembran mit hoher zeitlicher Auflösung und deutlich weniger Hintergrundrauschen und Kreuzwechselwirkungen durch andere zweiwertige Kationen zu testen. Wir fanden heraus, dass die unstrukturierte Verlängerung des Säugetiertransporters ZnT1 um eine C-terminale Domäne nicht an der Zinktransportfunktion beteiligt ist. Dies ermöglicht es den Forschern, sich auf andere Domänen des ZnT1-Proteins für die Regulierung des Zinktransports zu konzentrieren.