Name: In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-04-28T12:30:00
Duration: 2 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy at JoVE.com

कैल्शियम इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली ज़ेबराफ़िश लाइनें ज़ेबराफ़िश सेंटर फॉर डिजीज मॉडलिंग (जेडसीडीएम), कोरिया द्वारा प्रदान की गई थीं। इस शोध को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473) द्वारा समर्थित किया गया था।

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae

<ol>
	<li>Choi, T. -. Y., Choi, T. -. I., Lee, Y. -. R., Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+an+animal+model+for+biomedical+research.">Zebrafish as an animal model for biomedical research.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).</li><li>Ahrens, M. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+functional+and+developmental+imaging+with+isotropic+spatial+resolution.">Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).</li><li>Ahrens, M. B., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+imaging+in+small+brains.">Large-scale imaging in small brains.</a> Current Opinion in Neurobiology. 32, 78-86 (2015).</li><li>Yoon, Y. -. 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(69), e4196 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , (2000).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+cell+stress+and+death+using+conventional+UV+laser+confocal+microscopy.">Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+casper+mutant+and+1-pheny-2-thiourea+treated+adult+zebrafish.">Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish.</a> Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+neural+network+approximation+of+robust+PCA+for+automated+analysis+of+calcium+imaging+data.">Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data.</a> Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , 595-604 (2021).</li><li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+microscopy+through+virtual+refocusing+using+a+recursive+light+propagation+network.">Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network.</a> Medical Image Analysis. 82, 102600 (2022).</li><li>Eom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+unbiased+prediction+enables+accurate+denoising+of+voltage+imaging+data.">Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Johnston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish.">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51065 (2013).</li><li>Sofroniew, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=napari:+a+multi-dimensional+image+viewer+for+Python.">napari: a multi-dimensional image viewer for Python.</a> Zenodo. , 3555620 (2022).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li><li>Voleti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+volumetric+microscopy+of+in+vivo+dynamics+and+large-scale+samples+with+SCAPE+2.0.">Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0.</a> Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).</li></ol>

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक विस्तारित अवधि (जैसे, 1 घंटे से अधिक) में लार्वा ज़ेब्राफिश के विवो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग और अधिग्रहित संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम बनाता है।
सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग हैं। नमूना एम्बेडिंग के दौरान, बुलबुला गठन को रोकना और एगारोस जेल में धूल से बचना महत्वपूर्ण है। यदि जेल में हवा के बुलबुले और धूल होती है, तो छवि की गुणवत्ता गंभीर रूप से खराब हो सकती है। फोर्सप्स का उपयोग करके नमूने की स्थिति रखते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नमूना क्षैतिज और लंबवत दोनों स्तर पर है। अन्यथा, माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र के भीतर रुचि के क्षेत्र शामिल नहीं हो सकते हैं। इसके अलावा, इस पोजिशनिंग को इसकी सतह को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अगारोस जेल के जमने से पहले थोड़े समय की खिड़की के भीतर किया जाना चाहिए, क्योंकि इस तरह की क्षति छवि की गुणवत्ता से समझौता करती है।
एक और बड़ी चुनौती उन छवियों में गति से बचना है जो अगारोस जेल (चित्रा 6) के अधूरे जमने और ज़ेबराफिश के लकवाकरण से आते हैं। जब अंडे के पानी को एगोर्से जेल के पूर्ण जमने से पहले नमूने में जोड़ा जाता है, तो मछली धीरे-धीरे पार्श्व और अक्षीय दोनों रूप से चलती है, जो समय-श्रृंखला छवियों में नमूना बहाव के रूप में प्रकट होती है (चित्रा 6 ए)। यदि पक्षाघात की खुराक अपर्याप्त है या प्रभाव की अवधि समाप्त हो जाती है, तो नमूना स्थानांतरित करने का प्रयास कर सकता है, जो समय-चूक छवियों में तेजी से हिलने के रूप में दिखाई देता है।
गति कलाकृतियों के बिना उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए उपरोक्त चरणों के महत्व के बावजूद, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल 15,16,17,18,19 प्रयोगात्मक प्रक्रिया का केवल एक संक्षिप्त अवलोकन प्रदान करते हैं, जिसमें इन विवरणों की कमी है। उदाहरण के लिए, स्थिरीकरण प्रोटोकॉल11 के बिना अधिग्रहित छवियां पर्याप्त गति कलाकृतियों से ग्रस्त हैं जो डाउनस्ट्रीम छवि विश्लेषण को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। आवश्यक घटकों को एकीकृत करके, जैसे कि एगारोस जेल ठोसकरण और नमूना पैरालिज़ेशन, हमारा प्रोटोकॉल गति कलाकृतियों को कम करते हुए अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता में स्थिरता को काफी बढ़ाता है।
सारांश में, लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क के विवो इमेजिंग में एक अनुकूलित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। मस्तिष्क गतिविधि और संरचना के विवो इमेजिंग में इस प्रोटोकॉल की वैधता और प्रजनन क्षमता की पुष्टि कई सेटिंग्स 14,18,29,30,31 में की गई है। वर्तमान वर्कफ़्लो लार्वा ज़ेबराफ़िश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग पर केंद्रित है, लेकिन इसे आसानी से लार्वा ज़ेबराफ़िश35,36 के अन्य अंगों की इमेजिंग के लिए लागू किया जा सकता है।

लार्वा चरण में इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता, इसके तेजी से विकास, इसकी कम रखरखाव लागत और विविध आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता 1,2,3,4 के कारण जेब्राफिश (डेनियो रेरियो) को व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में एक मॉडल कशेरुक जानवर के रूप में अपनाया गया है। विशेष रूप से,जैविक घटनाओं 5,6,7,8,9 के आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ संयुक्त लार्वा की ऑप्टिकल पारदर्शिता पूरे मस्तिष्क स्तर 10,11,12,13,14 पर न्यूरोनल गतिविधि और संरचना दोनों को चित्रित करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करती है।. हालांकि, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन का समर्थन करने वाले माइक्रोस्कोप के साथ भी, अधिग्रहित छवियां आवश्यक रूप से एकल-सेल स्तर पर जानकारी को बनाए नहीं रखती हैं; नमूना माउंटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अगारोस जेल द्वारा पेश किए गए विचलन के कारण ऑप्टिकल छवि की गुणवत्ता खराब हो सकती है, मछली को एक कोण पर रखा जा सकता है, इस प्रकार रुचि के क्षेत्र माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र में पूरी तरह से निहित नहीं हैं, और मछली रिकॉर्डिंग के दौरान आगे बढ़ सकती है, जिससे छवियों में गति कलाकृतियां हो सकती हैं या छवियों से सटीक संकेत निष्कर्षण में बाधा उत्पन्न हो सकती है।
इस प्रकार, न्यूनतम शोर और गति के साथ उच्च गुणवत्ता वाले छवि डेटा प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। दुर्भाग्य से, विवो 15,16,17,18,19 में लार्वा ज़ेबराफिश के पूरे मस्तिष्क की इमेजिंग के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल केवल संक्षेप में प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, विवरण के पर्याप्त हिस्से छोड़ते हैं, जैसे कि अगारोस ठोसकरण, सटीक माउंटिंग तकनीक, और प्रत्येक प्रयोगवादी तक बल का उपयोग करके नमूना स्थिति। इसके अलावा, अगारोस एकाग्रता और स्थिरीकरण विधियों 10,11,14,15,16,17,18,19 में विसंगतियां इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान मछली आंदोलन से उत्पन्न चुनौतियों का कारण बन सकती हैं।
यहां, त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। चित्रा 1 प्रोटोकॉल का एक ग्राफिकल अवलोकन प्रदान करता है: नमूना तैयारी और स्थिरीकरण, नमूना एम्बेडिंग, छवि अधिग्रहण और इमेजिंग के बाद विज़ुअलाइज़ेशन। विवो में लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग एक वाणिज्यिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रदर्शित की जाती है। यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और डिजाइन के आधार पर कुछ संवेदी उत्तेजनाओं या व्यवहार संदर्भों के साथ मस्तिष्क इमेजिंग के लिए चिकित्सकों द्वारा तैयार किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>SciLab</td>
			<td>SL.Tub3513</td>
			<td>To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16&#215; 0.8NA water dipping objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI75 LWD 16&#215;W</td>
			<td>Objective lens for whole-brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>200 &#956;M of 1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>To prepare egg water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>SciLab</td>
			<td>SL.Pip3032</td>
			<td>To transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.6 g sea salt in 10 L deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Karl Hammacher GmbH</td>
			<td>HSO 010-10</td>
			<td>Forceps used for sample positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td>2% (wt/vol) agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napari</td>
			<td>Napari</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To visualize microscopy images in 3-D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1918-10MG</td>
			<td>0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>11035</td>
			<td>Petri dish used for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 55 mm</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>11050</td>
			<td>To prepare zebrafish larvae after screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Confocal microscope for whole-brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883-500G</td>
			<td>Sea salt used for preparing egg water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo whole-brain imaging of zebrafish larvae using three-dimensional fluorescence microscopy

एक कशेरुक मॉडल जानवर के रूप में, लार्वा ज़ेबराफ़िश का व्यापक रूप से तंत्रिका विज्ञान में उपयोग किया जाता है और सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर पूरे मस्तिष्क की गतिविधि की निगरानी करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। यहां, हम तीन-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क इमेजिंग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें नमूना तैयारी और स्थिरीकरण, नमूना एम्बेडिंग, छवि अधिग्रहण और इमेजिंग के बाद विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है। वर्तमान प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और कस्टम-डिज़ाइन किए गए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 1 घंटे से अधिक समय तक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की संरचना और न्यूरोनल गतिविधि की विवो इमेजिंग में सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर भी चर्चा की गई है, जिसमें नमूना चढ़ाना और स्थिति, अगारोस जेल में बुलबुला गठन और धूल को रोकना, और अगारोस जेल के अपूर्ण जमने और मछली के लकवाकरण के कारण छवियों में गति से बचना शामिल है। प्रोटोकॉल को कई सेटिंग्स में मान्य और पुष्टि की गई है। इस प्रोटोकॉल को लार्वा ज़ेबराफिश के अन्य अंगों की इमेजिंग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

लार्वा ज़ेब्राफिश दिमाग की संरचना और न्यूरोनल गतिविधि कैल्शियम संकेतक पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए (टीजी (एचयूसी: जीएएल 4) व्यक्त करती है; Tg (UAS: GCaMP7a))20,21,22 एक कैस्पर (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)34 पृष्ठभूमि के साथ वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके 3-4 d.p.f. पर चित्रित किया गया था।
वॉल्यूमेट्रिक संरचनात्मक इमेजिंग के लिए, नमूना को 16x 0.8 एनए वाटर डिपिंग ऑब्जेक्टिव लेंस से लैस एक वाणिज्यिक बिंदु-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके चित्रित किया गया था। संरचनात्मक और कार्यात्मक इमेजिंग दोनों के लिए एक 488 एनएम उत्तेजना लेजर का उपयोग किया गया था। फ्रेम दर, छवि रिज़ॉल्यूशन, पिक्सेल आकार और अक्षीय चरण आकार क्रमशः 0.25 हर्ट्ज, 2048 x 2048, 0.34 μm, और 1.225 μm थे। छवि अधिग्रहण में लगभग 1 घंटे और 20 मिनट लगे। अधिग्रहित छवि के वॉल्यूमेट्रिक क्षेत्र ने अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क और हिंडब्रेन के मस्तिष्क क्षेत्रों को कवर किया (चित्रा 4 ए)। 4 डी.पी.एफ. लार्वा जेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क में मेडुला ओबोंगाटा, अनुमस्तिष्क प्लेट, ऑप्टिक टेक्टम, हैबेनुला और पृष्ठीय टेलेन्सेफ्लोन के न्यूरोनल सेल शरीर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों (चित्रा 4 बी) में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे। उपरोक्त प्रोटोकॉल (चित्रा 4 सी और वीडियो 1) का पालन करके नापारी27 का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों का 3-डी प्रतिपादन किया गया था।
2-डी में कार्यात्मक इमेजिंग के लिए, नमूना को उसी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके चित्रित किया गया था, जो 16x 0.8 एनए वाटर डिपिंग ऑब्जेक्टिव लेंस से लैस था। फ्रेम दर, छवि रिज़ॉल्यूशन और पिक्सेल आकार क्रमशः 2 हर्ट्ज, 512 x 256 और 1.5 μm थे। न्यूरोनल सेल बॉडी पृष्ठभूमि और सुपरइम्पोज्ड न्यूरोनल गतिविधि (चित्रा 5 ए, बी) दोनों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे।
3-डी कार्यात्मक इमेजिंग के लिए, एक कस्टम-डिज़ाइन 3-डी माइक्रोस्कोपी सिस्टम18 का उपयोग किया गया था, जो विवो इमेजिंग में 1,040 μm × 400 μm × 235 μm और 1.7 μm और 5.4 μm के पार्श्व और अक्षीय रिज़ॉल्यूशन के क्षेत्र के साथ पूरे लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क की न्यूरोनल गतिविधि को प्रदर्शित करने में सक्षम था। इमेजिंग दर 4.2 वॉल्यूम प्रति सेकंड तक थी। संरचनात्मक इमेजिंग डेटा प्रस्तुत करने के समान, नापारी का उपयोग पूरे मस्तिष्क कैल्शियम इमेजिंग डेटा (चित्रा 5 सी और वीडियो 2) के 3-डी प्रतिपादन के लिए किया गया था।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig01.jpg"> चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का अवलोकन। ज़ेबराफ़िश नमूना तैयारी और पक्षाघात (चरण 1)। 2% (wt / vol) Agarose जेल तैयारी (चरण 2)। नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग (चरण 3)। छवि अधिग्रहण (चरण 4)। छवि प्रसंस्करण और संरचना और न्यूरोनल गतिविधि की कल्पना (चरण 5-7)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig02.jpg"> चित्रा 2: पूरे मस्तिष्क इमेजिंग तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया । (ए) अंडे के पानी से भरे पेट्री डिश में पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए व्यक्त करने वाले ज़ेब्राफिश के नमूने की जांच की गई। (बी) नमूना माउंटिंग और पोजिशनिंग के लिए आवश्यक उपकरण और सामग्री। (1) 37 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक; (2) 2% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) एगारोस जेल; (3) 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब; (4) अंडे का पानी; (5) 0.25 मिलीग्राम / एमएल पैंक्यूरोनियम ब्रोमाइड समाधान; (6) पेट्री डिश; (7) बल; (8) स्थानांतरण पिपेट। (सी) लकवाग्रस्त नमूने की स्टीरियोमाइक्रोस्कोप छवि। काला तीर नमूने के दिल को इंगित करता है। (डी) 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नमूना एक पिपेट का उपयोग करके स्थानांतरित किया जाता है। इनसेट बॉक्स किए गए क्षेत्र का एक बढ़ा हुआ दृश्य दिखाता है। (ई) नमूना (काला तीर) को पेट्री डिश के केंद्र में बल का उपयोग करके रखा जाता है। (एफ) नमूना बल का उपयोग करके संरेखित किया गया है। (जी) एक गलत संरेखित एम्बेडेड नमूने का एक उदाहरण। (एच) एक संरेखित एम्बेडेड नमूने का एक उदाहरण। (I) नमूना छवि अधिग्रहण के लिए उद्देश्य लेंस के तहत एक माइक्रोस्कोप चरण पर रखा गया है। स्केल बार: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig03.jpg"> चित्रा 3: लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क छवियों का दृश्य। (ए) पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश (4 डीपीएफ) मस्तिष्क की एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि का 3-डी प्रतिपादन। नापारी, एक पायथन वातावरण में एक ओपन-सोर्स बहु-आयामी छवि दर्शक, प्रतिपादन के लिए उपयोग किया गया था। नापारी विंडो में परत नियंत्रण (लाल बॉक्स), एक परत सूची (पीला बॉक्स), एक कैनवास (नीला बॉक्स), और एक एनीमेशन विज़ार्ड (हरा बॉक्स) शामिल है। (बी) एनीमेशन प्रस्तुत करने के लिए कई दर्शक सेटिंग्स वाले कुंजी फ्रेम जोड़े जाते हैं। (सी) लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूरोनल गतिविधि की 2-डी टाइम-लैप्स इमेजिंग की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि। छवि को पृष्ठभूमि (बाएं) और न्यूरोनल गतिविधि (मध्य) में विघटित किया जाता है, फिर ओवरलेड (दाएं)। स्केल बार: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig04.jpg"> चित्रा 4: लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की इमेजिंग संरचना। (ए) पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश (4 डीपीएफ) मस्तिष्क की एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी)। शीर्ष: पार्श्व एमआईपी। नीचे: अक्षीय एमआईपी। प्रत्येक सीमा में फोरब्रेन (लाल), मिडब्रेन (पीला), और हिंडब्रेन (नीला) होता है। (बी) मस्तिष्क की वॉल्यूमेट्रिक छवि से कई गहराई पर कुल 10 अक्षीय स्लाइस (z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, ऊपर से नीचे तक गिना जाता है; z = 0 μm मस्तिष्क की ऊपरी सतह को इंगित करता है)। प्रत्येक सफेद बॉक्स मस्तिष्क के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है (मेडुला ओबोंगाटा, अनुमस्तिष्क प्लेट, ऑप्टिक टेक्टम, हेबेनुला और पृष्ठीय टेलेसेफ्लोन)। (सी) नापारी का उपयोग करके पूरा मस्तिष्क प्रदान किया गया। स्केल बार: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig05.jpg"> चित्रा 5: लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क की इमेजिंग न्यूरोनल गतिविधि। (ए) एक लार्वा ज़ेबराफिश (4 डी.पी.एफ.) मस्तिष्क में न्यूरोनल गतिविधि की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए व्यक्त करती है। स्केल बार: 100 μm. (B) A में बॉक्स किए गए क्षेत्र का बढ़ा हुआ दृश्य कई समय बिंदुओं पर ऑप्टिक टेक्टम में न्यूरोनल गतिविधि को दर्शाता है। (सी) लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में पूरे मस्तिष्क की न्यूरोनल गतिविधि का 3-डी प्रतिपादन एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए माइक्रोस्कोप (बाएं: टी = 133 एस; दाएं: टी = 901 एस) का उपयोग करके प्राप्त किया गया है। न्यूरोनल गतिविधि को स्थैतिक पृष्ठभूमि पर सुपरइम्पोज किया जाता है। स्केल बार: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig06.jpg"> चित्रा 6: नमूना बहाव के साथ और बिना टाइम-लैप्स इमेजिंग। (ए) नमूना बहाव के साथ पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश मस्तिष्क की टाइम-लैप्स इमेजिंग। अगारोस जेल (चरण 3.6-3.7) के जमने से पहले अंडे का पानी नमूने में जोड़ा गया था। मछली पार्श्व और अक्षीय दिशाओं में चली गई। (बी) नमूना बहाव के बिना लार्वा ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की टाइम-लैप्स इमेजिंग। अगारोस जेल (चरण 3.6-3.7) के जमने के बाद अंडे का पानी नमूने में जोड़ा गया था। स्केल बार: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
वीडियो 1: पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा जेब्राफिश (4 डी.पी.एफ.) मस्तिष्क की संपूर्ण मस्तिष्क संरचना का 3-डी प्रतिपादन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/Video1.zip" target="_blank">कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>
वीडियो 2: पैन-न्यूरोनल जीसीएएमपी 7 ए को व्यक्त करने वाले लार्वा ज़ेबराफिश (4 डी.पी.एफ.) मस्तिष्क में पूरे मस्तिष्क की न्यूरोनल गतिविधि का 3-डी प्रतिपादन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/Video2.zip" target="_blank">कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>

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In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE 

यहां प्रस्तुत किया गया है तीन आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लार्वा ज़ेबराफिश के विवो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रयोगात्मक प्रक्रिया में नमूना तैयारी, छवि अधिग्रहण और विज़ुअलाइज़ेशन शामिल हैं।

विवो में त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ज़ेब्राफिश लार्वा की संपूर्ण मस्तिष्क इमेजिंग

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

हम एक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ पूरे मस्तिष्क की न्यूरोएक्टिविटी को रिकॉर्ड और विश्लेषण करने के लिए ऑप्टिकल प्रतिरक्षा प्रणाली और कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम विकसित कर रहे हैं। प्रयोगशाला मछली अनुसंधान के लिए एक आदर्श मॉडल जानवर है। प्रत्येक ऑप्टिकल पारदर्शिता और विविध आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता के लिए धन्यवाद नमूना माउंटिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अगारोस जेल द्वारा पेश किए गए विचलन के कारण ऑप्टिकल छवि की गुणवत्ता खराब हो सकती है, और रिकॉर्डिंग के दौरान मछली छवियों में गति कलाकृतियों का कारण बन सकती है या छवियों से सटीकता संकेत निष्कर्षण को बाधित कर सकती है।सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक प्रक्रिया का केवल एक संक्षिप्त अवलोकन प्रदान करते हैं, विवरण के पर्याप्त हिस्सों को जीवित करते हैं, जैसे कि एगारोस ठोसकरण, सटीक माउंटिंग तकनीक और सरल स्थिति। इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले छवि डेटा प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। न्यूनतम शोर और गति के साथ।हमारा प्रोटोकॉल एक अनुकूलित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल एक विस्तारित अवधि में विवो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग और अधिग्रहित इमेजिंग डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम बनाता है। वर्कफ़्लो पूरे मस्तिष्क इमेजिंग पर केंद्रित है, लेकिन इसे आसानी से हमारे ज़ेबरा मछली के अन्य अंगों की इमेजिंग के लिए लागू किया जा सकता है।हमारा लक्ष्य तंत्रिका गणना के अंतर्निहित सिद्धांतों को उजागर करना है। इसके लिए हम एक पाइपलाइन पर काम करना जारी रखेंगे जिसमें व्यवस्थित मस्तिष्क मानचित्रण के लिए तंत्रिका गतिविधि और संरचना और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के बड़े पैमाने पर इमेजिंग शामिल है।