Name: In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-04-28T12:30:00
Duration: 2 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Sebrafisklinjene som ble brukt til kalsiumavbildning ble levert av Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Korea. Denne forskningen ble støttet av National Research Foundation of Korea (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).

Alle sebrafiskforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i KAIST (KA2021-125). Totalt 12 voksne sebrafisk med pannevronalt uttrykk av kalsiumindikatoren GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)] på en casper [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)] bakgrunn ble brukt til avl. Denne gruppen besto av åtte kvinner og fire hanner, med aldre varierende fra 3 til 12 måneder. Avbildningsforsøk ble utført på sebrafisk hos larver 3-4 dager etter befruktning (d.p.f.), et stadium hvor kjønn ikke kan bestemmes.
1. Tilberedning av sebrafiskprøve
<ol><li>Samle embryoer etter avl av voksen fisk av en ønsket transgen linje, for eksempel Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22, i en petriskål fylt med eggevann (se materialfortegnelse). Plasser embryoene i en inkubator ved 28 °C og øk dem til 3-4 d.p.f. larver23,24,25.<ol><li>Hvis sebrafiskbakgrunnen ikke er albino, for å hemme en dannelse av pigmentering, overfør embryoene 24 timer etter befruktning (h.p.f.) til petriskålen fylt med eggevann som inneholder 200 μM 1-fenyl 2-tiourea (PTU; se materialtabell)25,26. Hver 24. h, overfør fisken til en ny tallerken med ferskt eggvann som inneholder 200 μM PTU. MERK: Sebrafisken opprettholdes under standardforhold ved 28 °C og en 14:10 h lys:mørk syklus. PTU-behandlingen er kjent for å påvirke oppførselen og tyreoideafunksjonen til larvesebrafisk27,28. Derfor er det viktig å bruke PTU med forsiktighet og å nøye kontrollere for potensielle forstyrrende faktorer i eventuelle eksperimenter.</li>
	</ol></li>
	<li>For å finne prøven som uttrykker fluorescerende proteiner av interesse (f.eks. Pan-neuronal GCaMP7a), screener prøven under et epi-fluorescensmikroskop og velger en prøve med et lyst uttrykk.</li>
	<li>Forbered den valgte 3-4 d.p.f. sebrafiskprøven i petriskålen fylt med eggevann (figur 2A). MERK: For å registrere spontan nevronaktivitet, anbefales det å bruke prøver i alderen 80-100 h.p.f., da nivået av spontan aktivitet er lavt før 80 h.p.f. og pigmenteringsutvikling, selv med kaspbakgrunn, kan forringe bildekvaliteten etter 100 h.p.f.</li>
	<li>Tilbered en 0,25 mg/ml pankuroniumbromidoppløsning 14,19,29,30,31 ved å tilsette 1 ml av en 2,5 mg/ml stamoppløsning (se materialfortegnelse) til 10 ml eggevannet. Aliquot pankuroniumbromidoppløsningen i 1,5 ml mikrosentrifugerør.</li>
	<li>Overfør den forhåndsscreenede prøven til petriskålen ved hjelp av en overføringspipette. MERK: Prøv å overføre et minimumsvolum eggevann med prøven.</li>
	<li>Overfør 0,1 ml av pankuroniumbromidoppløsningen til petriskålen for lammelse. MERK: Pankuroniumbromid har en potensiell dempende effekt på nevral aktivitet hos sebrafisk32. Det er viktig å vurdere konsentrasjonen og varigheten av eksponering for pankuroniumbromid nøye.</li>
</ol>2. 2% (vekt/vol) agarosegelpreparat
<ol><li>Slå på en varmeblokk og sett måltemperaturen til 37 °C. Vent til enheten varmes opp og likevektes ved innstilt temperatur.</li>
	<li>Løs opp 0,2 g agarosepulver med lavt smeltepunkt (se materialfortegnelse) i 10 ml eggvann.</li>
	<li>Varm agaroseoppløsningen i en mikrobølgeovn og bland den ved risting og vortexing til agarosen er helt oppløst.</li>
	<li>Aliquot agarosegelen i 1,5 ml mikrosentrifugerør og lagre mikrosentrifugerørene på varmeblokken (figur 2B). MERK: Sjekk om boblene i agarosegelen har forsvunnet.</li>
</ol>3. Prøvemontering og posisjonering
<ol><li>Sjekk prøven under et stereomikroskop for å verifisere at larvenes bevegelse har stoppet og for å evaluere prøvens helse visuelt ved å sjekke hjerterytmen (figur 2C). Hvis hjerteslaget er for sakte, kast prøven. MERK: Hvis hjerteslaget til fisken som avbildes er for sakte (f.eks. under 60 slag per minutt), er det kanskje ikke mulig å utføre langtidsbilder. For å vurdere fiskens velvære kan hjertefrekvensen kontrolleres visuelt ved å sammenligne den med andre fisk i samme petriskål. Dette vil bidra til at fisken som avbildes er frisk og stabil nok for avbildningsprosedyren.</li>
	<li>Bruk overføringspipetten til å plassere en enkelt larvesebrafisk i agarosegelen i 1,5 ml mikrosentrifugerøret (figur 2D). MERK: Sørg for å kaste pipetten etter overføring av prøven.</li>
	<li>Hell agarosegelen i petriskålen for å lage et 1-2 mm strøk. Overfør prøven i mikrosentrifugerørene til petriskålen ved hjelp av overføringspipetten, slik at larven plasseres i midten av fatet. MERK: Hvis det er støv og bobler i agarosegelen, fjern dem med overføringspipetten.</li>
	<li>Bruk tang til å plassere prøven i ønsket retning slik at hodet og halen er flate (figur 2E).</li>
	<li>Roter prøven med tang slik at begge øynene er i vater (figur 2F). MERK: Justeringsprosedyrer (posisjon og rotasjon) bør fullføres før agarosegelen begynner å stivne.</li>
	<li>Etter justeringen, vent til agarosegelen har størknet (figur 2G,H). MERK: Ventetiden for agarosegelen å størkne kan variere fra 5-10 minutter, avhengig av volumet og størrelsen på gelen.</li>
	<li>Etter størkning av agarosegelen, fyll petriskålen med eggvann og legg petriskålen med den innebygde prøven på mikroskopstadiet (figur 2I).</li>
</ol>4. Oppkjøp av bilder
<ol><li>Slå på mikroskopsystemet (f.eks. lasere, konfokalkontrollere, mikroskop og datamaskin, se materialfortegnelse) og kontroller at hele systemet fungerer.</li>
	<li>Velg en objektivlinse med lav forstørrelse og finn prøven i midten av synsfeltet.</li>
	<li>Velg en objektivlinse med vannfordypning eller vanndypping med riktig forstørrelse (f.eks. 16x 0,8 numerisk blenderåpning (NA) vanndyppelinse, se materialfortegnelse). Gjør finjusteringer i synsfeltet.</li>
	<li>Still inn bildeparametrene (f.eks. bildestørrelse, lasereffekt, eksponeringstid, antall bilder) ved hjelp av programvare for bildeopptak. MERK: Angi bildeparameterne for å oppnå best mulig resultat for spesifikke behov (se oppsettet for bildeopptak i delen representative resultater). Hvis bildet er mettet, reduserer du lasereffekten.</li>
	<li>Finn hjernen til prøven ved å flytte scenen og bestemme tykkelsen ved hjelp av live view-modus i programvaren ved å endre fokalplanene manuelt opp og ned. Angi volumets nedre og øvre grenser. MERK: Sørg for at hele hjernen er inneholdt i synsfeltet langs både lateral og aksial retning.</li>
	<li>Sett en z-trinnstørrelse med tanke på mikroskopets aksiale oppløsning. MERK: Den optimale z-trinnstørrelsen for avbildning av larvesebrafiskhjernen avhenger av avbildningsmodaliteten og oppløsningen til mikroskopet. Som et eksempel ble en z-trinnstørrelse på 5 μm brukt med tanke på tykkelsen på lysarket og den gjennomsnittlige diameteren til cellelegemene10.</li>
	<li>Fortsett med bildeoppkjøpet for det angitte synsfeltet.<ol><li>For volumetrisk strukturell avbildning, skaff deg et 3-D-bilde (x, y, z) av hele hjernen ved å endre fokalplanene og få 2-D-bilder av hvert z-plan sekvensielt.</li>
		<li>For funksjonell avbildning av et enkelt z-plan, ta tidsseriebilder (x,y,t) av hjernens nevronaktivitet i en viss dybde.</li>
		<li>For volumetrisk funksjonell avbildning, skaff deg et 4-D-bilde (x, y, z, t) av nevronaktiviteten i hele hjernen ved å skaffe 3-D-bilder sekvensielt. MERK: Angi antall rammer med tanke på datamaskinens tilgjengelige minnestørrelse. En innsamlingstid på mindre enn 1 time anbefales på grunn av varigheten av effekten av pankuroniumbromid.</li>
	</ol></li>
	<li>Når du har hentet bilder, lagrer du resultatene og registrerer bildeparameterne (f.eks. pikselstørrelse, z-trinnstørrelse, bildefrekvens, lasereffekt) for bildeanalyse.</li>
	<li>Eksporter bildene i et passende format for datagjengivelse og bildeanalyse. MERK: Det anbefales å eksportere bilder i formatformat for kodede bildefiler (TIF). TIF støtter tapsfri bildekomprimering og er kompatibel med de fleste bildebehandlingsprogrammer og programmeringsspråk. I tillegg støtter TIF-formatet inkludering av metadata, for eksempel oppkjøpsparametere, bildeoppløsning og annen relevant informasjon som kan hjelpe til med datatolkning og reproduserbarhet.</li>
</ol>5. Oppsett for visualiseringer ved hjelp av napari
MERK: napari er en åpen kildekode flerdimensjonal bildeviser i et Python-miljø med grafikkbehandlingsenhet (GPU)-basert gjengivelse33. Den napari-animasjon plugin gir en programmatisk etablering av filmer. Bruk av Fiji, et bildebehandlingsprogram med åpen kildekode, anbefales for generell bildebehandling, for eksempel filtrering og geometrisk transformasjon (se materialfortegnelse). Kildekoden som brukes til visualiseringen ved hjelp av napari er tilgjengelig på GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).
<ol><li>Installer napari og napari-animasjon ved hjelp av enten pip eller conda. Etter installasjonen oppretter du en ny jupyter-notatbokfil. MERK: Å kjøre med jupyter notebook, som er et interaktivt verktøy for Python, anbefales over Python-skriptet.</li>
	<li>Importer napari og napari-animasjon.</li>
</ol>6. Visualisere strukturer ved hjelp av napari
<ol><li>For å visualisere bilder og lage filmer av den gjengitte sebrafiskhjernen, last inn 3D-bildet (x,y,z) og åpne napari-vinduet. Koble til plugin-modulen for napari-animasjon (figur 3A).</li>
	<li>Angi parametere som grenser for voksestørrelse, fargekart og kontrast i lagkontrollene.</li>
	<li>Juster visningsinnstillingene (f.eks. perspektiv, vinkler) på lerretet.</li>
	<li>Hvis du vil ta det gjengitte bildet, trykker du på opptaksknappen i animasjonsveiviseren.</li>
	<li>Hvis du vil generere filmer av det gjengitte volumet, endrer du visningsinnstillingene og legger til nøkkelbilder (figur 3B).</li>
	<li>Når du har lagt til nøkkelbilder, angir du antall delbilder (trinn) mellom nøkkelbilder i animasjonsveiviseren. Lagre den gjengitte animasjonen.</li>
</ol>7. Bildebehandling og visualisering av nevronaktivitet ved hjelp av napari
MERK: For å visualisere tidsseriebilder av nevronaktivitet som overlagte bilder av statisk bakgrunn og aktivitet, må en dekomponeringsalgoritme brukes på råbildene. Bruk en MATLAB-implementering av en dekomponeringsalgoritme kalt BEAR24. MATLAB-versjonen av BEAR er tilgjengelig på GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).
<ol><li>For å dekomponere den statiske bakgrunnen og nevronaktiviteten, bruk BEAR på de rå tidsseriebildene (x,y,t eller x,y,z,t). Etter dekomponeringen, lagre bildene av bakgrunnen og nevronaktiviteten som TIF-filer (figur 3C).</li>
	<li>Last inn bakgrunns- og nevronaktivitetsbildene og åpne napari-vinduet. Koble napari-animasjon plugin.</li>
	<li>Bruk et grått fargekart for bakgrunnsbilder og et populært fargekart for bilder av nevronaktivitet (figur 3C).</li>
	<li>Angi parametere som grenser for tetthet og kontrast i lagkontrollene.</li>
	<li>For å generere filmer av nevronaktivitet, endre seerinnstillingene og legg til nøkkelbilder for å gjengi animasjonen.</li>
	<li>Når du har lagt til nøkkelbilder, angir du antall delbilder (trinn) mellom nøkkelbilder i animasjonsveiviseren. Lagre den gjengitte animasjonen.</li>
</ol>

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae

<ol>
	<li>Choi, T. -. Y., Choi, T. -. I., Lee, Y. -. R., Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+an+animal+model+for+biomedical+research.">Zebrafish as an animal model for biomedical research.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).</li><li>Ahrens, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+neuronal+dynamics+during+motor+adaptation+in+zebrafish.">Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish.</a> Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).</li><li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+selective+plane+illumination+microscopy.">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).</li><li>Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prey+capture+behavior+evoked+by+simple+visual+stimuli+in+larval+zebrafish.">Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+multidimensional+directed+evolution+approach+applied+to+fluorescent+voltage+reporters.">A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters.</a> Nature Chemical Biology. 14 (4), 352-360 (2018).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Looger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+GCaMP+calcium+indicators+for+imaging+neural+populations.">Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations.</a> Biorxiv. , (2021).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy.">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11 (7), 727-730 (2014).</li><li>Chhetri, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+functional+and+developmental+imaging+with+isotropic+spatial+resolution.">Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).</li><li>Ahrens, M. B., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+imaging+in+small+brains.">Large-scale imaging in small brains.</a> Current Opinion in Neurobiology. 32, 78-86 (2015).</li><li>Yoon, Y. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+decomposition+light-field+microscopy+for+high+speed+imaging+of+neuronal+activity.">Sparse decomposition light-field microscopy for high speed imaging of neuronal activity.</a> Optica. 7 (10), 1457-1468 (2020).</li><li>Randlett, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+activity+mapping+onto+a+zebrafish+brain+atlas.">Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas.</a> Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+whole+brain+imaging+of+neural+activity+in+freely+behaving+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Rapid whole brain imaging of neural activity in freely behaving larval zebrafish (Danio rerio).</a> eLife. 6, e28158 (2017).</li><li>Bruzzone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+brain+functional+recordings+at+cellular+resolution+in+zebrafish+larvae+with+3D+scanning+multiphoton+microscopy.">Whole brain functional recordings at cellular resolution in zebrafish larvae with 3D scanning multiphoton microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11048 (2021).</li><li>Cho, E. -. S., Han, S., Lee, K. -. H., Kim, C. -. H., Yoon, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3DM:+deep+decomposition+and+deconvolution+microscopy+for+rapid+neural+activity+imaging.">3DM: deep decomposition and deconvolution microscopy for rapid neural activity imaging.</a> Optics Express. 29 (20), 32700-32711 (2021).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+volumetric+dynamics+at+high+speed+in+mouse+and+zebrafish+brain+with+confocal+light+field+microscopy.">Imaging volumetric dynamics at high speed in mouse and zebrafish brain with confocal light field microscopy.</a> NatureBiotechnology. 39 (1), 74-83 (2021).</li><li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception.">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Current Biology. 23 (4), 307-311 (2013).</li><li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Park, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+upstream+elements+in+the+HuC+promoter+leads+to+the+establishment+of+transgenic+zebrafish+with+fluorescent+neurons.">Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons.</a> Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , (2000).</li><li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+cell+stress+and+death+using+conventional+UV+laser+confocal+microscopy.">Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).</li><li>Antinucci, P., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crystal-clear+zebrafish+for+in+vivo+imaging.">A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 6, 29490 (2016).</li><li>Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+casper+mutant+and+1-pheny-2-thiourea+treated+adult+zebrafish.">Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish.</a> Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Han, S., Cho, E. -. S., Park, I., Shin, K., Yoon, Y. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+neural+network+approximation+of+robust+PCA+for+automated+analysis+of+calcium+imaging+data.">Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data.</a> Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , 595-604 (2021).</li><li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+fluorescence+microscopy+through+virtual+refocusing+using+a+recursive+light+propagation+network.">Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network.</a> Medical Image Analysis. 82, 102600 (2022).</li><li>Eom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+unbiased+prediction+enables+accurate+denoising+of+voltage+imaging+data.">Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Johnston, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish.">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51065 (2013).</li><li>Sofroniew, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=napari:+a+multi-dimensional+image+viewer+for+Python.">napari: a multi-dimensional image viewer for Python.</a> Zenodo. , 3555620 (2022).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li><li>Voleti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+volumetric+microscopy+of+in+vivo+dynamics+and+large-scale+samples+with+SCAPE+2.0.">Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0.</a> Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).</li></ol>

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Den nåværende protokollen muliggjør in vivo helhjerneavbildning av sebrafisk over en lengre periode (f.eks. lengre enn 1 time) og visualiseringer av de innhentede strukturelle og funksjonelle bildedataene.
De mest kritiske trinnene er prøvemontering og posisjonering. Under prøveinnbygging er det avgjørende å forhindre bobledannelse og unngå støv i agarosegelen. Hvis geleen inneholder luftbobler og støv, kan bildekvaliteten bli alvorlig forringet. Når du plasserer prøven med tang, er det viktig å sikre at prøven er i vater både horisontalt og vertikalt. Ellers kan interesseområdene ikke være innenfor mikroskopets synsfelt. I tillegg bør denne posisjoneringen gjøres innen et kort tidsvindu før størkning av agarosegelen for å unngå å forårsake skade på overflaten, da slike skader kompromitterer bildekvaliteten.
En annen stor utfordring er å unngå bevegelse i bilder som kommer fra ufullstendig størkning av agarosegelen (figur 6) og lammelse av sebrafisken. Når eggevann tilsettes prøven før fullstendig størkning av agorsegelen, beveger fisken seg sakte både lateralt og aksialt, noe som manifesterer seg som prøvedrift i tidsseriebildene (figur 6A). Hvis dosen av lammelser er utilstrekkelig eller varigheten av effekten avsluttes, kan prøven forsøke å bevege seg, noe som vises som rask rykninger i time-lapse-bildene.
Til tross for viktigheten av de nevnte trinnene for å anskaffe bilder av høy kvalitet uten bevegelsesartefakter, gir offentlig tilgjengelige protokoller 15,16,17,18,19 bare en kort oversikt over den eksperimentelle prosedyren, og mangler disse detaljene. For eksempel lider de oppkjøpte bildene uten immobiliseringsprotokoller11 av betydelige bevegelsesartefakter som gjør nedstrøms bildeanalyse utfordrende. Ved å integrere essensielle komponenter, som agarosegelstørkning og prøvelammelse, forbedrer protokollen vår konsistensen i kvaliteten på oppkjøpte bilder betydelig, samtidig som bevegelsesartefakter minimeres.
Oppsummert beskrives en optimalisert og reproduserbar eksperimentell prosedyre for in vivo avbildning av sebrafiskhjernen til larver. Gyldigheten og reproduserbarheten av denne protokollen for in vivo avbildning av hjerneaktivitet og struktur er bekreftet i flere innstillinger 14,18,29,30,31. Den nåværende arbeidsflyten fokuserte på avbildning av larvesebrafisk i hele hjernen, men den kan enkelt brukes til avbildning av andre organer av larvesebrafisk35,36.

Sebrafisk (Danio rerio) har blitt mye brukt som et modellvirveldyr i nevrovitenskap, på grunn av sin optiske gjennomsiktighet på larvestadiet, den raske utviklingen, de lave vedlikeholdskostnadene og tilgjengeligheten av ulike genetiske verktøy 1,2,3,4. Spesielt gir larvenes optiske gjennomsiktighet kombinert med genetisk kodede fluorescerende reportere av biologiske hendelser 5,6,7,8,9 en unik mulighet til å avbilde både nevronaktivitet og struktur på helhjernenivå 10,11,12,13,14 . Men selv med et mikroskop som støtter cellulær oppløsning, beholder de oppkjøpte bildene ikke nødvendigvis informasjonen på enkeltcellenivå; Den optiske bildekvaliteten kan bli forringet på grunn av aberrasjonen introdusert av agarosegelen som brukes til prøvemontering, fisken kan monteres i en vinkel, slik at interesseområdene ikke er helt innenfor mikroskopets synsfelt, og fisken kan bevege seg under opptaket, forårsake bevegelsesartefakter i bildene eller hindre nøyaktig signalutvinning fra bildene.
Dermed er det nødvendig med en effektiv og reproduserbar protokoll for å skaffe bildedata av høy kvalitet med minimal støy og bevegelse. Dessverre beskriver offentlig tilgjengelige protokoller for avbildning av en hel hjerne av larvesebrafisk in vivo 15,16,17,18,19 bare kort prosedyren, og etterlater betydelige deler av detaljene, som agarosestørkning, presise monteringsteknikker og prøveposisjonering ved hjelp av tang, opp til hver eksperimentalist. I tillegg kan inkonsekvenser i agarosekonsentrasjon og immobiliseringsmetoder 10,11,14,15,16,17,18,19 føre til utfordringer som følge av fiskens bevegelse under avbildningsprosessen.
Her gis en detaljert protokoll for helhjerneavbildning av larvesebrafisk ved bruk av tredimensjonal fluorescensmikroskopi. Figur 1 gir en grafisk oversikt over protokollen: prøvepreparering og immobilisering, prøveinnebygging, bildeopptak og visualisering etter avbildning. Den strukturelle og funksjonelle avbildningen av larvesebrafiskhjernen in vivo er demonstrert ved hjelp av et kommersielt konfokalmikroskop og et spesialdesignet fluorescensmikroskop. Denne protokollen kan skreddersys av utøvere for hjerneavbildning med visse sensoriske stimuli eller atferdskontekster, avhengig av eksperimentelle behov og design.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>SciLab</td>
			<td>SL.Tub3513</td>
			<td>To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16&#215; 0.8NA water dipping objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI75 LWD 16&#215;W</td>
			<td>Objective lens for whole-brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629-10G</td>
			<td>200 &#956;M of 1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>To prepare egg water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>SciLab</td>
			<td>SL.Pip3032</td>
			<td>To transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>0.6 g sea salt in 10 L deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Karl Hammacher GmbH</td>
			<td>HSO 010-10</td>
			<td>Forceps used for sample positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td>2% (wt/vol) agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napari</td>
			<td>Napari</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To visualize microscopy images in 3-D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancuronium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1918-10MG</td>
			<td>0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>11035</td>
			<td>Petri dish used for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 55 mm</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>11050</td>
			<td>To prepare zebrafish larvae after screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Confocal microscope for whole-brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883-500G</td>
			<td>Sea salt used for preparing egg water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo whole-brain imaging of zebrafish larvae using three-dimensional fluorescence microscopy

Som et virveldyrmodelldyr er larvesebrafisk mye brukt i nevrovitenskap og gir en unik mulighet til å overvåke helhjerneaktivitet ved cellulær oppløsning. Her gir vi en optimalisert protokoll for å utføre helhjerneavbildning av sebrafisk ved hjelp av tredimensjonal fluorescensmikroskopi, inkludert prøvepreparering og immobilisering, prøveinnbygging, bildeinnsamling og visualisering etter avbildning. Den nåværende protokollen muliggjør in vivo-avbildning av strukturen og nevronaktiviteten til en larvesebrafiskhjerne ved en cellulær oppløsning i over 1 time ved bruk av konfokalmikroskopi og spesialdesignet fluorescensmikroskopi. De kritiske trinnene i protokollen diskuteres også, inkludert prøvemontering og posisjonering, forebygging av bobledannelse og støv i agarosegelen, og unngå bevegelse i bilder forårsaket av ufullstendig størkning av agarosegelen og lammelse av fisken. Protokollen er validert og bekreftet i flere innstillinger. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for avbildning av andre organer av en larvesebrafisk.

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

Strukturen og nevronaktiviteten til larvesebrafiskhjernene som uttrykker kalsiumindikator pannevronal GCaMP7a (Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 med en casper (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 bakgrunn ble avbildet ved 3-4 d.p.f. ved å følge den beskrevne protokollen.
For volumetrisk strukturell avbildning ble prøven avbildet ved hjelp av et kommersielt punktskanning konfokalmikroskopisystem utstyrt med en 16x 0.8 NA vanndyppeobjektivlinse. En 488 nm eksitasjonslaser ble brukt til både strukturell og funksjonell avbildning. Bildefrekvens, bildeoppløsning, pikselstørrelse og aksial trinnstørrelse var henholdsvis 0,25 Hz, 2048 x 2048, 0,34 μm og 1,225 μm. Bildeopptaket tok ca. 1 t og 20 min. Det volumetriske synsfeltet til det ervervede bildet dekket hjerneområdene i forhjernen, midthjernen og bakhjernen (figur 4A). Nevronale cellelegemer i medulla oblongata, lillehjerneplate, optisk tektum, habenula og dorsalt telencephalon i hele hjernen hos 4 d.p.f. larvesebrafisk var tydelig synlige på konfokalmikroskopibildene (figur 4B). 3D-gjengivelsen av konfokalmikroskopibildene ble utført ved hjelp av napari27 ved å følge den nevnte protokollen (figur 4C og video 1).
For funksjonell avbildning i 2-D ble prøven avbildet ved hjelp av det samme konfokale mikroskopisystemet, utstyrt med en 16x 0.8 NA vanndyppeobjektivlinse. Bildefrekvens, bildeoppløsning og pikselstørrelse var henholdsvis 2 Hz, 512 x 256 og 1,5 μm. De nevrale cellelegemene var tydelig synlige både i bakgrunnen og den overlagrede nevronaktiviteten (figur 5A,B).
For 3-D funksjonell avbildning ble et spesialdesignet 3-D-mikroskopisystem18 brukt, som var i stand til in vivo-avbildning av nevronaktiviteten til en hel larvesebrafiskhjerne med et synsfelt på 1,040 μm × 400 μm × 235 μm og laterale og aksiale oppløsninger på henholdsvis 1,7 μm og 5,4 μm. Bildefrekvensen var opptil 4,2 volumer per sekund. I likhet med å gjengi strukturelle bildedata, ble napari brukt til 3-D-gjengivelse av kalsiumavbildningsdata for hele hjernen (figur 5C og Video 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig01.jpg"> Figur 1: Oversikt over eksperimentell prosedyre. Klargjøring av sebrafiskprøver og lammelse (trinn 1). Preparatet med 2 % (vekt/vol) agarosegel (trinn 2). Prøvemontering og posisjonering (trinn 3). Bildeopptak (trinn 4). Bildebehandling og visualisering av struktur og nevronaktivitet (trinn 5-7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig02.jpg"> Figur 2: Eksperimentell prosedyre for fremstilling av helhjerneavbildning . (A) Screenet sebrafiskprøve som uttrykker pannevronal GCaMP7a i en petriskål fylt med eggevann. (B) Utstyr og materiale som kreves for prøvemontering og posisjonering. (1) Varmeblokk ved 37 °C; (2) 2% (vekt/vol) agarosegel; (3) 1,5 ml mikrosentrifuge rør; (4) egg vann; (5) 0,25 mg/ml pankuroniumbromidoppløsning; (6) Petri parabolen; (7) tang; (8) Overfør pipette. (C) Stereomikroskopbilde av den lammede prøven. Den svarte pilen peker mot hjertet av prøven. (D) Prøven i mikrosentrifugerøret på 1,5 ml overføres ved hjelp av en pipette. Innfellingen viser en forstørret visning av boksområdet. (E) Prøven (svart pil) plasseres i midten av petriskålen ved hjelp av tang. (F) Prøven er justert ved hjelp av tang. (G) Et eksempel på en feiljustert innebygd prøve. (H) Et eksempel på en justert innebygd prøve. (I) Prøven er plassert på et mikroskopstadium under objektivlinsen for bildeopptak. Skala bar: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig03.jpg"> Figur 3: Visualisering av hjernebilder av larvesebrafisk. (A) 3D-gjengivelsen av et konfokalmikroskopibilde av en larvesebrafisk (4 d.p.f) hjerne som uttrykker pan-nevronal GCaMP7a. napari, en åpen kildekode flerdimensjonal bildeviser i et Python-miljø, ble brukt til gjengivelsen. Napari-vinduet består av lagkontroller (rød boks), en lagliste (gul boks), et lerret (blå boks) og en animasjonsveiviser (grønn boks). (B) Nøkkelbilder med flere visningsinnstillinger legges til for gjengivelse av en animasjon. (C) Konfokalmikroskopibilde av 2-D time-lapse-avbildning av nevronaktiviteten i larvesebrafiskhjernen. Bildet dekomponeres til bakgrunnen (venstre) og nevronaktiviteten (midten), deretter overlappet (høyre). Skala bar: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig04.jpg"> Figur 4: Avbildningsstruktur av en larvesebrafiskhjerne. (A) Maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) av et konfokalmikroskopibilde av en larvesebrafisk (4 d.p.f.) hjerne som uttrykker pannevronal GCaMP7a. Øverst: MIP. Nederst: aksial MIP. Hver grense inneholder forhjernen (rød), midthjernen (gul) og bakhjernen (blå). (B) Totalt 10 aksiale skiver på flere dybder fra et volumetrisk bilde av hjernen (ved z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, regnet oppover fra topp til bunn; z = 0 μm indikerer den øverste overflaten av hjernen). Hver hvite boks representerer hjerneområdet (medulla oblongata, cerebellar plate, optisk tektum, habenula og dorsal telencephalon). (C) Hele hjernen gjengitt ved hjelp av napari. Skala bar: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig05.jpg"> Figur 5: Avbildning av nevronaktivitet i en larvesebrafiskhjerne. (A) Konfokalmikroskopibilde av nevronaktivitet i en larvesebrafisk (4 d.p.f.) hjerne som uttrykker pannevronal GCaMP7a. Skala bar: 100 μm. (B) Forstørret visning av det boksede området i A som viser nevronaktiviteten i optisk tektum på flere tidspunkter. Skala bar: 20 μm. (C) 3-D-gjengivelsen av hele hjernens nevronaktivitet i larvesebrafiskhjernen ervervet ved hjelp av et spesialdesignet mikroskop (venstre: t = 133 s; høyre: t = 901 s). Den neuronale aktiviteten legges på statisk bakgrunn. Skala bar: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65218/65218fig06.jpg"> Figur 6: Time-lapse-avbildning med og uten prøvedrift. (A) Time-lapse-avbildning av larvesebrafiskhjernen som uttrykker pannevronal GCaMP7a med prøvedrift. Eggvann ble tilsatt prøven før størkning av agarosegelen (trinn 3.6-3.7). Fisken beveget seg i lateral og aksial retning. (B) Time-lapse-avbildning av en larvesebrafiskhjerne uten prøvedrift. Eggvann ble tilsatt prøven etter størkning av agarosegelen (trinn 3.6-3.7). Skala bar: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/65218fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Video 1: 3D-gjengivelse av hele hjernestrukturen til en larvesebrafisk (4 d.p.f.) hjerne som uttrykker pan-nevronal GCaMP7a. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/Video1.zip" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 2: 3D-gjengivelse av nevronaktivitet i hele hjernen i en larvesebrafisk (4 d.p.f.) hjerne som uttrykker pannevronal GCaMP7a. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65218/Video2.zip" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy at JoVE.com

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE 

Her presenteres en protokoll for in vivo helhjerneavbildning av sebrafisk av larvefisk ved bruk av tredimensjonal fluorescensmikroskopi. Den eksperimentelle prosedyren inkluderer prøvepreparering, bildeinnsamling og visualisering.

In vivo Helhjerneavbildning av sebrafisklarver ved hjelp av tredimensjonal fluorescensmikroskopi

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

Vi utvikler optiske immunsystemer og beregningsalgoritmer for å registrere og analysere nevroaktiviteten til hele hjernen med en høy romlig og tidsmessig oppløsning. Laboratoriefisk er et ideelt modelldyr for forskning. Takket være hver optisk gjennomsiktighet og tilgjengeligheten av ulike genetiske verktøy Den optiske bildekvaliteten kan bli forringet på grunn av aberrasjonen introdusert av agarosegelen som brukes til prøvemontering, og fisken kan bevege seg under opptaket og forårsake bevegelsesartefakter i bildene eller hindre nøyaktighetssignalutvinning fra bildene.Offentlig tilgjengelige protokoller gir bare en kort oversikt over den eksperimentelle prosedyren, og lever betydelige deler av detaljene, for eksempel agarosestørkning, presise monteringsteknikker og enkel posisjonering. Derfor er det nødvendig med en effektiv og reproduserbar protokoll for å skaffe bildedata av høy kvalitet. Med minimal støy og bevegelse.Vår protokoll gir en optimalisert og reproduserbar eksperimentell prosedyre. Denne protokollen muliggjør in vivo helhjerneavbildning over en lengre periode og visualiseringer av de innhentede bildedataene. Arbeidsflyten fokuserte på avbildning av hele hjernen, men den kan enkelt brukes til å avbilde andre organer av mye av sebrafisken vår.Vårt mål er å avdekke de underliggende prinsippene for nevrale beregninger. For det vil vi fortsette å jobbe med en rørledning som involverer storskala avbildning av nevral aktivitet og struktur og beregningsanalyse av slike for systematisk hjernekartlegging.