Name: The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-04-07T12:10:00
Duration: 2 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (C) til TT (tilskuddsnummer JP17K07495 og JP20K06751). Vi takker professor Mineko Kengaku for bruk av utstyr for langtidsavbildning (LCV100; Olympus).

Alle museforsøk ble godkjent av Suntory Animal Ethics Committee (APRV000561), og alle dyr ble vedlikeholdt i henhold til komiteens retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr. En standard WT-stamme av Mus musculus (C57BL6/J) ble brukt. Både hann- og hunnmus fra 10 uker til 20 ukers alder ble brukt. Musene ble avlivet med CO2 - kvelning.
1. Isolering av tynntarmen
<ol><li>Excise tynntarmen, inkludert tolvfingertarmen og den proksimale halvdelen av jejunum, med laboratoriesaks.</li>
	<li>Overfør vevet til en petriskål, og skyll tynntarmen med 5 ml kald PBS-ABx (PBS + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%]) i en 5 ml sprøyte for å fjerne lysinnholdet.</li>
	<li>Klipp vevet åpent på langs med laboratoriesaks, og vask manuelt med kald PBS-ABx mens du rister. MERK: Ved å skrape ut villi med et lysbilde, kan villus forurensning reduseres12.</li>
	<li>Samle ca. 5 mm x 5 mm biter av tarmsegmentet ved hjelp av laboratoriesaks. Overfør fragmentene til et 50 ml rør med pinsett, og tilsett 25 ml kald PBS-ABx.</li>
	<li>Vask fragmentene ved å røre frem og tilbake 10x med 25 ml kald PBS-ABx for å fjerne tarminnholdet i 50 ml røret.</li>
</ol>2. Kryptering isolasjon
<ol><li>Inkuber bitene i PBS-ABx inneholdende 2 mM EDTA i 30 minutter på is uten risting.</li>
	<li>For enkel størkning av den ekstracellulære matriksen (ECM), inkuber en 24-brønns plate i en 37 ° C vevskulturinkubator på forhånd.</li>
	<li>Aspirer EDTA-løsningen fra cellekultursystemet med en vakuumpumpe, tilsett 25 ml frisk, kald PBS-ABx, og rist deretter bitene kraftig opp og ned for hånd 30x-40x for å frigjøre kryptvilluskompleksene. MERK: De separerte kryptene og villi kan kontrolleres ved mikroskopisk observasjon av en 25 μL dråpe fra suspensjonen ved 4x forstørrelse.</li>
	<li>Deretter filtrerer du suspensjonen gjennom en 70 μm sil en gang.</li>
	<li>Sentrifuger suspensjonen ved 390 × g i 3 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Resuspender kryptpelleten i 20 ml sorbitol DMEM (avansert DMEM / F12 + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%] + føtal bovint serum [1%] + sorbitol [2%]) med pipettering, og overfør kryptsuspensjonen til to nye 15 ml rør for oppdeling i to 10 ml løsninger til sentrifuge ved lav hastighet. MERK: Den store cellemassen og celler / rusk kan separeres ved hjelp av sentrifugering med lav hastighet. Den store cellemassen er i pelleten, og celler/rusk er i supernatanten.</li>
	<li>Sentrifuger de to kryptopphengene ved 80 × g i 3 minutter ved 4 °C, og aspirer deretter supernatanten forsiktig. NOTAT: Siden pelletsdannelsen er svak, må du ikke aspirere for mye. La det være 2 ml supernatant i hver tube.</li>
	<li>Tilsett 10 ml sorbitol DMEM til hvert rør igjen. Sentrifuger suspensjonen ved 80 × g i 3 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Etter å ha aspirert supernatanten, etterlatt 2 ml supernatant i hvert rør, tilsett 10 ml sorbitol DMEM for resuspensjon, og sentrifuger kryptsuspensjonen ved 80 × g i de siste 3 minuttene ved 4 °C.</li>
	<li>Etter å ha aspirert supernatanten og etterlatt 2 ml supernatant i hvert rør, tilsett 10 ml komplett DMEM (avansert DMEM/F12 + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%] + føtalt bovint serum [1%]) for resuspensjon av pelleten ved å pipettere opp og ned, og la den stå i 1 min. MERK: Vent i 1 min for å få de flytende kryptene effektivt.</li>
	<li>Etter 1 min, samle hver 10 ml suspensjon for totalt 20 ml, og filtrer en gang med en 70 μm cellesil for å rense kryptene.</li>
	<li>Før du sådde i hovedsak rene krypter, tell antall krypter i den filtrerte komplette DMEM, og sentrifuge deretter ved 290 × g i 3 minutter ved 4 °C.<ol><li>Drypp 25 μL dråper i en 6 cm tallerken på tre punkter. Telle antall krypter under et mikroskop ved 4x forstørrelse, og beregne konsentrasjonen av krypter per 25 μL dråpe.</li>
	</ol></li>
	<li>Suspender 100 krypter med 40 μL ECM per brønn. Pipett opp og ned 5x-10x for å oppnå en homogen suspensjon av krypter i ECM, og frø deretter i en 37 °C forvarmet 24-brønnsplate. MERK: Hold alltid ECM på is for å unngå polymerisering. Pipett forsiktig for å unngå å lage luftbobler i ECM.</li>
	<li>Inkuber 24-brønnsplaten i 15 minutter i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator for polymerisasjon av ECM.</li>
	<li>Til slutt, dekk ECM med 500 μL kulturmedium som inneholder musepidermal vekstfaktor (EGF), rekombinant mus R-spondin 1 og rekombinant mus Noggin ved romtemperatur. Den endelige konsentrasjonen av materialer per brønn er som følger: penicillin-streptomycin (1%), 50 U / ml hver; gentamicin (0,5%), 25 μg / ml; EGF, 20 ng / ml; Noggin, 100 ng / ml; R-spondin 1, 500 ng / ml; L-glutamin, 2 mM.</li>
	<li>Start kryptkulturen ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator. MERK: For dyrkningsmediet for organoider i en 24-brønnsplate, se tabell 1.</li>
	<li>Utfør langsiktig levende bildebehandling for å observere organoid morfogenese med et opptak time-lapse-bildemikroskop utstyrt med et 20x mål hver 3. time i opptil 7 dager. Få serielle z-stablede bilder ved z-trinn på 1 μm (1 μm x fem trinn).</li>
	<li>Bytt medium annenhver dag.</li>
</ol>3. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
<ol><li>Isoler krypter fra musene (se avsnitt 2).</li>
	<li>Behandle de isolerte kryptene med 2 ml trypsin i 30 minutter ved 37 °C.</li>
	<li>Stopp reaksjonen med 10 ml PBS, og pass deretter gjennom en 20 μm cellesil.</li>
	<li>Sentrifuger oppløsningen ved 390 × g i 3 minutter ved 4 °C, og resuspender med 100 mikroliter fullstendig DMEM.</li>
	<li>Tilsett anti-EphB2 APC-konjugert antistoff (1/50), og inkuber i 30 minutter på is.</li>
	<li>Vask cellene 3x med PBS, og tilsett til slutt 7-amino-actinomycin D (7-AAD) (1/100).</li>
	<li>Sorter de fargede cellene via FACS.<ol><li>Juster områdets skaleringsfaktor, og sorter etter cellestørrelse (fremoverpunkt, FSC-A) kontra granularitet (sidepunkt, SSC-A).</li>
		<li>Sorter 7-AAD negative og positive celler for levedyktighet med lasersettet ved en bølgelengde på 488 nm og 50 mV effekt.</li>
		<li>Avgrens portene for å sortere EphB2-høye (EphB2høye), EphB2-medium (EphB2 med), EphB2-lave (EphB2lave) og EphB2-negative (EphB2neg) cellermed lasersettet ved en bølgelengde på 640 nm og 100 mV effekt.</li>
	</ol></li>
	<li>Start EphB2høycellekultur ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.</li>
</ol>4. Enkeltcelledyrkede organoider
<ol><li>Utfør celleisolasjonsmetoden i henhold til graderte EphB2-overflatenivåer11, og oppnå deretter fire forskjellige populasjoner (høy, middels, lav og negativ).</li>
	<li>Oppsamle, pellet med sentrifugering ved 390 × g i 3 minutter ved 4 °C, og legg inn de enkeltsorterte EphB2-høycellene i ECM ved pipettering, etterfulgt av såing på en 24-brønnsplate (100 singleter/40 μL ECM/brønn).</li>
	<li>Som i trinn 2.14, la ECM polymerisere og dekke ECM med et kulturmedium som inneholder en Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer (10 μM) de første 2 dagene for å opprettholde EphB2høye celler. MERK: ROCK-hemmeren er effektiv mot anoikis.</li>
	<li>Kontroller cellene manuelt ved hjelp av et invertert mikroskop ved 40x forstørrelse, og observer levedyktige organoider med sfæroiddannelse og kryptfremspring.</li>
</ol>

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Seidlitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gastric+cancer+modelling+using+organoids.">Human gastric cancer modelling using organoids.</a> Gut. 68 (2), 207-217 (2019).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+and+application+of+3D-organoid+technology.">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li><li>Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+versus+enzymatic+isolation+of+stromal+vascular+fraction+cells+from+adipose+tissue.">Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue.</a> Springerplus. 4 (1), 713 (2015).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+trends+and+perspectives+in+the+function+of+non-neuronal+acetylcholine+in+crypt-villus+organoids+in+mice.">New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-catenin+and+TCF+mediate+cell+positioning+in+the+intestinal+epithelium+by+controlling+the+expression+of+EphB/ephrinB.">&#946;-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB.</a> Cell. 111 (2), 251-263 (2002).</li><li>Baghdadi, M. B., Kim, T. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mouse+intestinal+organoid+culture+with+conditioned+media+isolated+from+mucosal+enteric+glial+cells.">Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells.</a> STAR Protocols. 3 (2), 101351 (2022).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-neuronal+acetylcholine+as+an+endogenous+regulator+of+proliferation+and+differentiation+of+Lgr5-positive+stem+cells+in+mice.">Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice.</a> FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).</li><li>Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+intestinal+stem+cells:+Critical+drivers+of+epithelial+homeostasis+and+regeneration.">Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).</li><li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury.">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li><li>Miyoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a+potentiates+TGF-&#946;+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury.">Wnt5a potentiates TGF-&#946; signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li><li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells.">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li><li>Merlos-Su&#225;rez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+stem+cell+signature+identifies+colorectal+cancer+stem+cells+and+predicts+disease+relapse.">The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).</li><li>Mao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB2+as+a+therapeutic+antibody+drug+target+for+the+treatment+of+colorectal+cancer.">EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer.</a> Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+receptor+M3+contributes+to+intestinal+stem+cell+maintenance+via+EphB/ephrin-B+signaling.">Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling.</a> Life Science Alliance. 4 (9), e202000962 (2021).</li><li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+colon+stem+cells+using+surface+expression+of+PTK7.">Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Schulte, L., Hohwieler, M., M&#252;ller, M., Klaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+novel+complementary+model+to+dissect+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease.</a> Stem Cells International. 2019, 8010645 (2019).</li><li>Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+regulation+of+intestinal+stem+cell+differentiation+and+epithelial+monolayer+function.">Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6313 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Denne protokollen beskriver en metode for konsekvent isolering av små tarmkrypter og den påfølgende kulturen av 3D-organoider. For å forbedre kryptfrigivelseshastigheten ble det etablert en mekanisk isolasjonsmetode som involverte kraftig risting etter behandling med EDTA. Mediesammensetningen er forskjellig fra den opprinnelige protokollen til Sato et al.7. Det opprinnelige mediet er relativt kostbart. Det er derfor vist et dyrkningsmedium og tilpassede medier for små tarmorganoider som inneholder farmakologiske hemmere, rekombinante vekstfaktorer og/eller betingede medier i tabell 1. Wnt3A og N-acetylcystein er ikke inkludert i dyrkningsmediet i denne protokollen. Som Paneth-celler uttrykker Wnt3, produserer cellene Wnt3 og støtter ISC-vedlikehold. I tillegg, i løpet av kryptisolasjon, brukes ikke det betingede mediet. Den organoide modellen er dynamisk og har cellulær og strukturell heterogenitet (Paneth-celler, enterocytter, begerceller, enteroendokrine celler, tuftceller og ISC-er). Derfor kan disse organoidene brukes i stor skala for å studere grunnleggende spørsmål om organoidbiologi.
EphB2-gradienten opprettholder ISC-stamme og proliferasjon langs krypt-villus-aksen i den voksne tynntarmen18. Fordelen med å lage organoider fra en enkelt EphB2-celle sammenlignet med isolerte krypter er relatert til å forstå biologien til murine ISC, da ISC-er spiller nøkkelroller i ulike humane tarmlidelser. Enkle EphB2høyuttrykkende ISC-er kan dyrkes for å danne organoider på samme måte som utviklingen av organoider fra enkle Lgr5-uttrykkende ISC-er. Det viktigste trinnet er å nøyaktig dele cellene i fire grupper (EphB2høy, EphB2med, EphB2lav og EphB2neg) i henhold til EphB2-uttrykket i kryptene ved hjelp av FACS. Forward versus side scatter (FSC vs. SSC) plott brukes ofte til å identifisere celler av interesse basert på deres størrelse og granularitet. FSC indikerer cellestørrelsen, og SSC relaterer seg til kompleksiteten eller granulariteten til cellen i P0-porten (figur 2A). I dette arbeidet ble cellene som falt innenfor den definerte porten (P0) senere analysert for levedyktighet. Deretter ble deres levedyktighet bestemt i henhold til de negative og positive populasjonene av 7-AAD fluorescenssignaler. Grensen mellom de 7-AAD-negative og -positive cellene ble strengt bestemt for å få de negative med minimal positiv celleforurensning. EphB2-portene ble grovt sett basert på EphB2-gradert uttrykk. 
For å bekrefte at de fire gruppene var nøyaktig delt, ble mRNA-uttrykket av utvalgte gener analysert. mRNA-nivåene av ISC-markører er høye i EphB2høye celler20. I tillegg er mRNA-nivåene av stamcellespesifikke markører relativt høye i EphB2med celler20. Imidlertid er EphB2-eksdepression i EphB2low og EphB2neg cells lav eller negativ sammenlignet med EphB2høy og EphB2med celler20. De foregående tiltakene bør iverksettes for å sikre anrikning avhøycellepopulasjonen av EphB2 før plating. Imidlertid kan organoid vekst på mindre enn 6% fra EphB2høye celler skyldes død av stamceller under kulturprosessen, ikke kraftig risting under kryptisolasjonen. Det er vist at anvendelsen av en selektiv Rho-assosiert kinase (ROCK)-hemmer på humane embryonale stamceller reduserer dissosiasjonsindusert apoptosemarkant 22. Således, som en teknisk endring, er det verdt å prøve å legge til ROCK-hemmeren ved en høyere konsentrasjon og med en lengre inkubasjon for å forbedre levedyktigheten.
Wnt3A-utskillende Paneth-celler ved siden av ISC-er gir viktig støtte til ISC-ene8. Faktisk viser ISC-Paneth-celledubletter en sterkt økt organoiddannende kapasitet sammenlignet med enkle ISC-er8. Videre har tilsetning av Wnt3A i konsentrasjonen på 100 ng / ml for de første 3 dagene av kultur vist seg å øke organoiddannende kapasitet8. Således, som en annen teknisk endring, kan tilsetning av eksogen Wnt3A forbedre organoiddannende kapasitet av enkelt EphB2høyuttrykkende ISC-er.
Sammenlignet med in vivo-tilnærminger, kan organoider lett brukes til genetisk manipulasjon, analyse av malignitetsfenotyper og medikamentscreening20,23. En kombinasjon av EDTA-kelering og en mekanisk isolasjonsmetode er effektiv, reproduserbar og tidseffektiv for å lage små tarmorganoider fra krypter og kan lett følges av laboratoriepersonell uten avansert erfaring. Dermed kan tillegg av den mekaniske isolasjonen med kraftig risting etter behandling med EDTA effektivt etablere murine tynntarmsorganoider ex vivo og gi et potensielt verktøy for organoiddyrking og sykdomsmodellering av andre voksne epitelvev.
Intestinale epitelceller er polariserte og orienterte med den apikale siden rettet mot lumen. Imidlertid er den apikale siden som vender mot lumen av 3D-organoider i deres indre. Dermed forhindrer denne organisasjonen tilgang til den apikale siden, noe som er et problem når man studerer effekten av luminalkomponenter, som næringsstoffer, mikrober og metabolitter på epitelceller. For å omgå denne ulempen er det utviklet en kultur av organoide celler som 2D-monolag24. Når det gjelder fremtidige applikasjoner, vil kulturen av organoidcellemonolag bli utnyttet, da dette representerer det mest effektive og håndterbare systemet.

Intestinale organoider, som først ble etablert i 2009, har dukket opp som et kraftig in vitro-verktøy for å studere tarmbiologi gitt deres morfologiske og funksjonelle likhet med modne vev. Nylig har teknologiske fremskritt i dyrkede organoider avledet fra stamceller fra voksenvev gjort det mulig for den langsiktige kulturen av intestinale stamceller (ISC) med selvfornyelses- og differensieringspotensial. Disse organoider har blitt mye brukt for grunnleggende og translasjonelle forskningsstudier på gastrointestinal fysiologi og patofysiologi 1,2,3,4,5,6. 3D-organoidene utviklet av Clevers-gruppen gir et kraftig verktøy for å studere tarmepitelet med forbedret fysiologisk relevans7. Siden intestinale organoider er avledet fra vevsstamceller og består av flere celletyper, rekapitulerer de funksjonaliteten til tarmepitelet. Merk at en enkeltsortert leucinrik repetisjon som inneholder G-proteinkoblet reseptor 5-positiv (Lgr5 +) stamcelle også kan generere 3D-organoider uten Paneth-celler eller en ISC-nisje som epitelnisje eller stromalnisje7. Imidlertid er den organoiddannende kapasiteten til enkeltsorterte Lgr5+-celler lav sammenlignet med krypten og ISC-Paneth-celledublettene8.
Et økende antall studier har vist at metodene for inkubasjon av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller kollagenasedissosiasjon forårsaker løsning i epitelet og frigjøring av krypter. Siden enzymatisk dissosiasjon kan ha en effekt på celletilstanden til krypter, brukes vanligvis en mekanisk isolasjonsmetode for å dissociere vevet. Selv om mekanisk fordøyelse er en rask teknikk, kan denne metoden være forbundet med inkonsekvente kryptutbytter eller dårlig celle levedyktighet9. Derfor kan EDTA-behandling og mekanisk dissosiasjon kombineres for å generere bedre kryptutbytter. Et trekk ved metodikken vist i denne artikkelen er bruken av kraftig risting av vevfragmentene etter EDTA-kelering10. Kraftig risting tillater effektiv isolering av krypter fra krypt-villuskomplekser i tynntarmen. Graden av manuell risting bestemmer separasjonen. Dermed er det viktig å skaffe krypter fra komplekser for eksperimenter på dette feltet. I tillegg kan riktig dyktighet redusere villusforurensning til et minimum og øke antall krypter.
Derfor kan denne eksperimentelle protokollen, som benytter murine-avledede små tarmorganoider, bedre isolere krypter med fysisk kraft etter behandling med EDTA for dissosiasjon. Det er kjent at ekspresjonsmønsteret til erytropoietinproduserende hepatocellulær reseptor B2 (EphB2) delvis gjenspeiler kryptmiljøet. For eksempel er EphB2-positive celler organisert fra bunn til topp11. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ble utført basert på EphB2-ekspresjonen, og de oppnådde cellene ble delt inn i fire grupper: EphB2høy, EphB2med, EphB2lav og EphB2neg. Deretter ble organoidveksten fra enkeltsorterte EphB2høye celler i villtype (WT) mus demonstrert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-05SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>2325-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>3820-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>2345-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm tissue culture dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>3020-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EphB2 APC-conjugated antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>CCV-1306E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 mol/L)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06894-14</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMelody</td>
			<td>BD Life Sciences-Biosciences</td>
			<td>661762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>173012</td>
			<td>1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (software)</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>16672-04</td>
			<td>25 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hammacher laboratory scissor</td>
			<td>SANSYO</td>
			<td>91-1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170-PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory tweezer</td>
			<td>AS-ONE</td>
			<td>7-164-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354230</td>
			<td>ECM for 3D organoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human Lysozyme</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>LS-B8704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF (20 &#956;g/mL stock solution)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>50 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman (10 &#956;L, 20 &#956;L, 200 &#956;L, and 1,000 &#956;L)</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-12, -13, -15, and -16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Noggin (20 &#956;g/mL stock solution</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1967-NG-025</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine R-Spondin 1 (250 &#956;g/mL stock solution)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>32021-95</td>
			<td>2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE2000-S (inverted microscope)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>24131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse image microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LCV100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULVAC</td>
			<td>ULVAC KIKO Inc.</td>
			<td>100073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>331752-47-7</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research

I dag representerer organoiddyrkning et viktig verktøy for in vitro-studier av ulike biologiske aspekter og sykdommer i ulike organer. Murine små tarmkrypter kan danne organoider som etterligner tarmepitelet når de dyrkes i en 3D ekstracellulær matrise. Organoidene er sammensatt av alle celletyper som oppfyller ulike intestinale homeostatiske funksjoner. Disse inkluderer Paneth-celler, enteroendokrine celler, enterocytter, bobleceller og tuftceller. Velkarakteriserte molekyler tilsettes i kulturmediet for å berike tarmstamceller (ISC) merket med leucinrike repetisjoner som inneholder G-proteinkoblet reseptor 5 og brukes til å drive differensiering ned spesifikke linjer; disse molekylene inkluderer epidermal vekstfaktor, Noggin (et benmorfogenetisk protein) og R-spondin 1. I tillegg er en protokoll for å generere organoider fra en enkelt erytropoietinproduserende hepatocellulær reseptor B2 (EphB2) -positiv ISC også detaljert. I denne metodeartikkelen beskrives teknikker for å isolere små tarmkrypter og en enkelt ISC fra vev og sikre effektiv etablering av organoider.

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

For å generere mus små tarmorganoider, kan en kombinasjon av EDTA-behandling og en mekanisk isolasjonsmetode brukes til effektivt å isolere krypter10,13. Resultatene av denne studien viste at nesten alle de isolerte kryptene umiddelbart ble forseglet og virket kegleformede etter at de ble presset ut av epitelnisjene (figur 1A). For å minimere villusforurensning ble den resulterende suspensjonen ført gjennom en 70 μm cellesil, og deretter ble filtratet sentrifugert. Siden noen krypter forstyrres under filtrering og suspensjon, bør disse trinnene utføres nøye. Resultatene viste at nesten alle krypter i sluttfraksjonen var integrert og egnet for bruk i dyrkning (figur 1B). For å visualisere alle de belagte kryptene individuelt ble det belagt 100 krypter per brønn (figur 1C). Etter å ha tilsatt det spesifikke kryptkulturmediet (figur 1D), ble utviklingen av organoider overvåket med et mikroskop daglig. Videre ble organoidvekst fra kryptene observert med time-lapse-bilder for å overvåke utviklingen (figur 1E og tilleggsvideo S1). De kultiverte kryptene oppførte seg på en stereotyp måte. Det indre lumen av organoid ble fylt med en masse apoptotiske celler. Aktiv spredning og differensiering av ISC-er skjedde i kryptregionen med spirende (figur 1E og tilleggsvideo S1). Spirende var kombinert med ISC-migrasjon og spredning og Paneth-celledifferensiering. De differensierte Paneth-cellene var alltid plassert på det spirende stedet (tilleggsfigur S1). Siden organoidene ble bekreftet å være stabile i kultur ved bruk av et invertert mikroskop ved 10x forstørrelse, kunne teknikken brukes til å undersøke kryptdannelse i den utviklende tynntarmen og for å bestemme kapasiteten til vevregenerering og ISC langsiktig overlevelse for produksjon av nye tarmepitelceller14,15,16.
Lgr5 er definert som en ISC-markør, og murine Lgr5+ celler danner 3D-organoider7. Siden overfloden av LGR5-protein på celleoverflaten er lav og det mangler anti-LGR5-antistoffer med høy affinitet, er det imidlertid utfordrende å effektivt isolere murine ISC ved hjelp av FACS. EphB2 har tidligere blitt identifisert som en overflatemarkør for rensing av murine og humane ISC fra tarmvev17,18. Uttrykksmønsteret til EphB2 øker kompleksiteten involvert i ISC-markører. EphB2-positive celler er organisert gjennom det proliferative rommet, toppet på bunnen av kryptene, mens de avtar i en gradient mot toppen av kryptene11. Paneth-celler og stamceller er også lokalisert i krypten. Paneth-celler uttrykker hovedsakelig EphB3, som er nødvendig for deres posisjonering, og stamcellene over dem i krypten uttrykker hovedsakelig EphB2. Dermed kan forurensning av begge celletyper forekomme i løpet av ISC-rensing ved bruk av anti-EphB2-antistoffet. Følgelig bør deres markørgenuttrykk og organoiddannende kapasitet av celler isolert ved bruk av EphB2 ved FACS vurderes.
Basert på disse fakta, ved hjelp av FACS-analyse, kan EphB2 overflatemerkede celler isoleres fra WT-krypter19. Det har blitt undersøkt om EphB2-uttrykk kan skille mellom fire grupper med uttrykk for spesifikke markører, for eksempel ISC-spesifikke markørgener (Lgr5, Ascl2 og Olfm4) og stamcellespesifikke markørgener (Ki67, Myc og FoxM1). Dette eksperimentet viste at EphB2høye celler var overveiende ISC, i motsetning til EphB2med celler20,21. Til slutt, basert på celleisolasjonsmetoden, ble de oppnådde cellene delt inn i fire grupper (EphB2høy, EphB2med, EphB2lav og EphB2neg celler) (figur 2). Deretter ble enkeltceller som uttrykker høye nivåer av EphB2 sortert etter FACS dyrket for organoid vekst. En enkelt EphB2-høycelle kan uavhengig av hverandre anvendes til lokalisert behandling og gjenskape selvorganiserende kryptvilløse strukturer som minner om normal tynntarm (figur 3). Imidlertid genererer cellene avledet fra andre grupper (EphB2med, EphB2low og EphB2neg) ikke organoider20.
I en tidligere studie var ~ 6% av enkeltsorterte Lgr5-GFPhi-celler i stand til å initiere kryptvilløse organoider7. Imidlertid var de gjenværende cellene ikke i stand til å generere organoider og døde innen de første 12 h7. Forfatterne antok at dette var et resultat av fysisk og/eller biologisk stress som lå i isolasjonsprosedyren7. Mindre enn 6% organoidvekst ble også oppnådd fra enkeltsorterte EphB2høye celler i WT-mus. Ved dag 5 av kulturen dannet sfæroidlignende strukturer (figur 3). Fra dag 7 til dag 9 forekom det evaginasjon av flekkene for å danne krypter (figur 3). Det er viktig at anvendelsen av en valgt ROCK-hemmer på de enkeltsorterte EphB2høye cellene reduserte dissosiasjonsindusert apoptose og økte effektiviteten av organoidvekst.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65219/65219fig01.jpg"> Figur 1 Generering av mus små tarmorganoider. (A) Krypter fremstilt ved en kombinasjon av EDTA-kelering og mekanisk dissosiasjon. (B) Resulterende rensede krypter. (C) Krypter innebygd i den ekstracellulære matrisen. (AC) De svarte pilene indikerer krypter. (D) Tredimensjonal kultur av krypter og organoider. (E) Representative bilder av en voksende organoid avledet fra en krypt. De hvite pilene indikerer kryptspirende. Skalastenger = (A-C) 100 μm og (E) 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65219/65219fig02.jpg"> Figur 2: Flowcytometri gating-strategi for å oppnå en populasjon av EphB2-positive (EphB2+) celler i villtypemus. (A) Forover- og sidespredningsplott brukes til å skille cellene i henhold til henholdsvis størrelse og granularitet. (B) Fluorescens scatter brukes til å skille levedyktige celler i henhold til 7-AAD (PerCP) fluorescensintensiteten til cellene. Porten for den 7-AAD-negative cellepopulasjonen ble valgt. (C) Portene for EphB2-høy (EphB2høy), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-lav (EphB2lav) og EphB2-negativ (EphB2neg) cellepopulasjoner ble valgt. Forkortelser: FSC-A = fremover scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; 7-AAD = 7-amino-actinomycin D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65219/65219fig03.jpg"> Figur 3: Tidsforløp for enkeltsortert EphB2høycellet organoidvekst hos villtypemus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Dyrkningsmedium for en 24-brønns plate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219_JoVE_Table1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tilleggsvideo F1: Intervallbilder av en organoid i vekst. Skala bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/JoVE_Supplymental%20Movie1.avi" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfigur S1: Representativt bilde av antilysozymantistofffarging i en organoid. De hvite pilene indikerer Paneth-celler. Forkortelse: DIC = differensialinterferenskontrastmikroskop. Skala bar = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65219/65219_%20supplementary%20Figure%20S1%20(1).pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research at JoVE.com

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

Vi beskriver en protokoll for å isolere murin, små tarmkrypter og dyrkning av intestinale 3D-organoider fra kryptene. I tillegg beskriver vi en metode for å generere organoider fra en enkelt intestinal stamcelle i fravær av en sub-epitelial cellulær nisje.

3D-dyrking av organoider fra murintestinale krypter og en enkelt stamcelle for organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Vår forskning fokuserer på stamcellebiologi, spesielt intestinal stamcelle, tilstede på bunnen av tarmkrypten. Målet er å svare på hvordan homeostase opprettholdes av stamcellen i tarmen. Denne 3D-organkulturen avledet fra intestinal stamcelle gir et kraftig verktøy for å studere spredning, differensiering og vedlikehold av stamceller.Orgelteknologi hjelper kulturen av intestinal stamcelle i lang tid ved å beholde selvfornyelses- og differensieringspotensialet. Organoid har blitt mye brukt til grunnleggende og translasjonelle forskningsstudier på intestinal sårbarhet og tidligere skjørhet. Vår nåværende utfordring er å forstå koronarsystemet som er involvert i tarmepitelceller og stamceller.Forståelse av biologiske prosesser utløst av objektiv kloning er av sentral betydning. Et av våre betydelige funn er at signalering gjennom kloning opprettholder homeostasen av intestinal epitelvekst og differensiering. Vår protokoll beskriver en metode for konsekvent isolering av små tarmkrypter, og påfølgende kultur av 3D-organoider for å forbedre kryptal frigjøringshastighet.Vi etablerer en mekanisk isolasjonsmetode med kraftig risting, etter behandling med EDTA. EDTA og mekanisk dissosiasjon kan kombineres for å forbedre kryptiske utbytter. I tillegg kan riktig dyktighet redusere virusforurensning til et minimum, og øke antall krypter.Våre funn tyder på at signaleringen gjennom muskel- og organismereseptorene ser ut til å fungere sammen for å opprettholde homeostasen av i intestinal epitelvekst og differensiering. Dette oppfordrer oss til å anta at det ikke-nevrokoronar-arteritiske systemet spilte en viktig rolle i modereringen av intestinal stamcellenisje.