Name: Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Projeto de Abertura dos Laboratórios Chave de Hubei (bolsa nº 2021KFY055), Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei (bolsa nº 2020CFB240) e Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (bolsa nº 2042020kf0065).

Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Todos os camundongos C57BL/6J utilizados foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Wuhan, e todos os experimentos relacionados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade de Wuhan. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos camundongos.
1. Enucleação e fixação dos olhos
<ol><li>Eutanasiar os camu...

Mouse Retina Isolation and Methanol Treatment for Studying Retinal Ganglion Cells

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma.">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li><li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy.">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).</li><li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma:+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI.">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li><li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+damage:+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas.">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li><li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush.">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (2), 31 (2020).</li><li>Nadal-Nicol&#225;s, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li><li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing:+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li><li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry.">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li><li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives.">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li><li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pfl&#252;ger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images:+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling.">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li><li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry:+Comparison+of+Davidson's+solution+and+formalin+as+fixatives.">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+A+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin's+fluid+or+Davidson's+fluid.">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li><li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin:+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible.">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59 (2012).</li><li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine,+conjunctiva,+and+airway.">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li><li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method.">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li><li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining.">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li><li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma.">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+a+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li></ol>

A fixação é um passo essencial para preservar a retina, o que pode interferir em investigações subsequentes do CGR com base na morfologia. A fixação bem-sucedida captura rapidamente a estrutura e o estado das retinas no momento de expô-las ao meio de fixação, o que é fundamental para uma análise mais aprofundada. Embora o formaldeído tenha sido considerado um dos agentes fixadores mais comuns para fixação e preservação de tecidos e células, o formaldeído isoladamente nem sempre funciona bem como o fixa...

As células ganglionares da retina (CGRs) são os únicos neurônios de projeção na retina, integrando-se e transmitindo informações visuais externas ao cérebro1. Muitas doenças neurodegenerativas, como o glaucoma e a neuropatia óptica traumática, são caracterizadas por danos irreversíveis e perda deCGRs 2,3. Analisar as alterações morfológicas e quantitativas dos CGRs é um passo crucial para determinar como as doenças neurodegenerativas se desenvolvem e avançam 4,5.
O ensaio de imunofluorescência indireta é um método amplamente aceito para monitorar a distribuição de proteínas e contagem celular. Em laboratório, a imunomarcação retiniana de montagem total é comumente utilizada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições fisiológicas e patológicas daretina6. Os marcadores mais comuns utilizados para quantificação de RGC em toda a retina incluem Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e assim por diante 7,8. A caracterização da quantidade e distribuição dos RGCs requer imunomarcação retiniana de alta qualidade em toda a montagem. Geralmente, nos protocolos de imunomarcação, a retina é imersa em fixadores químicos antes de ser incubada em anticorpos. Os fixadores ideais não devem alterar a forma das células, a acessibilidade ou afinidade dos epítopos por anticorpos ou as dimensões lineares do tecido 9,10.
Devido à estrutura complexa da retina, problemas como fragilidade e dobramento da retina, bem como algumas dificuldades comuns, incluindo encolhimento celular e núcleos obscuros, são propensos a ocorrer ao fazer um adesivo de retina de montagem inteira, o que tem um impacto negativo na pesquisa experimental. Além disso, nem todas as retinas são imunomarcadas imediatamente, especialmente quando se trata de retinas de camundongos transgênicos com preços caros e de origem preciosa, exigindo a preservação das amostras extras de retina para uso posterior.
A solução fixadora apropriada pode fixar o tecido rapidamente, evitar a autólise tecidual, preservar a morfologia e a estrutura normais das células teciduais e manter a antigenicidade de proteínas e outras substâncias10. Atualmente, a fixação à base de formaldeído tem sido amplamente utilizada em vários tecidos, incluindo retinas separadas, copos hemisseccionados e globos oculares inteiros10. A retração tecidual e a alteração morfológica das células são os dois desafios críticos encontrados após a imersão em formaldeído11. Além disso, formulações de fixação modificadas estão surgindo cada vez mais para maximizar a retenção das propriedades originais da retina e das células-alvo 9,10. Diferentes tratamentos de fixação retiniana podem afetar a estrutura retiniana, a imunogenicidade de proteínas, a excitação da fluorescência e o ciclo de têmpera da atenuação de forma diferente12,13. As retinas fixadas com solução de Davidson são morfologicamente mais intactas quando comparadas àquelas fixadas com formalina, mas a solução de Davidson é menos compatível com alguns anticorpos, como a molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada a marcadores microgliais 112. Considerando a natureza frágil das retinas, os pesquisadores naturalmente se perguntariam se a integridade da retina, bem como as propriedades e a morfologia das células-alvo, mudarão após o armazenamento de longo prazo. No entanto, os possíveis efeitos da solução de fixação na morfologia das células retinianas e RGC após o armazenamento por vários meses foram raramente relatados. A otimização da fixação retiniana é fundamental para a avaliação e preservação dos CGRs.
Fornecemos uma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para coloração de retina murina de montagem total. Nosso método enfatiza o preparo e armazenamento adequado de retinas para investigação de CGR, levando em consideração a necessidade de armazenamento em longo prazo do tecido retiniano, bem como aspectos específicos da formação ou degradação de fluoróforos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well hemagglutination plate</td>
			<td>Labedit Company</td>
			<td></td>
			<td>Incubation antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Citotest</td>
			<td></td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescent quenching mountant</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1401</td>
			<td>Slow down fluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>GC305010</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>Apply 40x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>RWD Life science Co.,LTD&#160;</td>
			<td>77001S</td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>20210624</td>
			<td>GC&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>SecheVite</td>
			<td></td>
			<td>Sealing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Accelerate the fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Rinse the eyeball&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>Cat. #1832-RBPMS</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-165-148</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells

As células ganglionares da retina (RGCs), que são os neurônios de projeção da retina, propagam informações visuais externas para o cérebro. As alterações patológicas nos CGRs têm estreita relação com inúmeras doenças degenerativas da retina. A imunomarcação retiniana de montagem total é frequentemente usada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições de desenvolvimento e patologias da retina. Em algumas circunstâncias, algumas amostras valiosas de retina, como as de camundongos transgênicos, podem precisar ser retidas por um longo período sem afetar a morfologia ou o número de RGCs. Para resultados experimentais confiáveis e reprodutíveis, o uso de um meio de preservação eficaz é essencial. Aqui, descrevemos o efeito do metanol como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo. Em resumo, durante o processo de isolamento, o metanol frio (-20 °C) é pipetado na superfície da retina para ajudar a fixar os tecidos e facilitar sua permeabilidade, e então as retinas podem ser armazenadas em metanol frio (-20 °C) antes de serem imunomarcadas. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de isolamento da retina e o protocolo de armazenamento de amostras de tecido, que é útil e prático para a investigação de CGRs.

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Após a dissecção, a retina deve parecer um trevo plano de quatro folhas. Neste estudo, utilizando o protocolo descrito acima, a retina ficou branca após a adição de metanol (Figura 1). Enquanto isso, a retina mudou de macia para maleável e plana. Em seguida, os CGRs foram marcados com anti-RBPMS8. Quatro campos de imagem foram obtidos na retina de montagem total (n = 3) usando um microscópio confocal (ocular: 10x; objetivo: 40x). Visões representativas dos CG...

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Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells (Video) | JoVE 

O metanol pode ser usado como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo, o que é útil para a investigação de células ganglionares da retina.

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

A pesquisa visa fornecer um fluxo de trabalho de isolamento de retina modificado e um protocolo de armazenamento de amostras de tecido, o que é útil e prático para investigar RGCs. As retinas são frágeis e dobradas, o que limita a pesquisa experimental ao fazer um adesivo de retina de montagem inteira. Além disso, todas as retinas não requerem imunocoloração imediata.Às vezes, amostras extras de retina precisam de preservação para uso posterior. Fornecemos uma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples de coloração de retina de montagem total que enfatiza o preparo adequado e a necessidade de armazenamento de retinas a longo prazo para investigação de CGR. Continuaremos a trabalhar na pesquisa básica de neuropatias ópticas degenerativas.Além disso, o mecanismo molecular da lesão do nervo óptico e regeneração de acidentes e potenciais alvos clínicos para o diagnóstico e tratamento de doenças neurodegenerativas serão explorados.