Name: A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-09T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning at JoVE.com

Per il presente studio, gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'UCSF e sono stati condotti in conformità con la Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Qui sono stati utilizzati topi maschi e femmine adulti di 8-12 settimane C57BL/6 (allevati internamente).
1. Preparazione del campione DRG
<ol><li>Anestetizzare i topi con Avertin al 2,5% (vedi Tabella dei Materiali</stro...

Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

<ol>
	<li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain.">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain.">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).</li><li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+study+of+oxytocin+expression.">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).</li><li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain:+implications+for+clinical+practice.">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li><li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation.">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li><li>Chen, X. J., Sun, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+circuit+mechanisms+of+itch.">Central circuit mechanisms of itch.</a> Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).</li><li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms:+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways.">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li><li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury:+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets.">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li><li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain.">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li><li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBA1/GARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li><li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations.">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li><li>Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+somatosensory+neuron+involvement+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model.">Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).</li><li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels.">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).</li><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines.">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).</li><li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain.">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li><li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury:+roles+in+inflammation,+cell+death+and+nociception.">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li><li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function.">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+outgrowth,+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia.">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).</li><li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+Linking+structure+with+polarity+and+function.">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li><li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease.">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li><li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons.">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752 (2021).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRGquant:+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG.">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).</li></ol>

Questo protocollo fornisce una semplice procedura passo-passo per il sezionamento del criostato del DRG del topo per ottenere sezioni DRG di alta qualità su vetrini in modo affidabile. Ci sono quattro passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, il campione DRG e le pinzette devono essere asciutti prima di mettere il campione DRG sull'OCT di base. Qualsiasi liquido che circonda il campione DRG formerà un guscio di ghiaccio attorno ad esso, con il risultato che le sezioni DRG si separano dall'OCT e si curvono. I...

Il ganglio della radice dorsale (DRG) contiene i neuroni sensoriali primari, i macrofagi tissutali e le cellule satelliti che circondano i neuroni sensoriali primari 1,2,3,4. È una struttura anatomica chiave nell'elaborazione di segnali innocui e nocivi e svolge un ruolo critico nel dolore, nel prurito e in vari disturbi dei nervi periferici 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi per sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale del topo14,15,16, la criosezione del tessuto DRG rimane impegnativa poiché il tessuto DRG è piuttosto piccolo e le sezioni del criostato dei campioni DRG tendono a curvarsi in rotoli, rendendo difficile il trasferimento corretto delle sezioni del criostato sui vetrini. Tuttavia, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per gli studi di immunoistochimica e la struttura dei neuroni sensoriali DRG 17,18,19,20,21,22,23. Inoltre, poiché i risultati del sequenziamento dell'RNA a singola cellula hanno rivelato la notevole eterogeneità dei neuroni sensoriali DRG sia nell'uomo24 che nei topi25, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per studiare il ruolo funzionale di diverse cellule DRG in varie condizioni fisiologiche e patologiche.
Sebbene la tecnica di purificazione dei tessuti sia stata applicata per studiare la ricostruzione 3D del DRG26 come tecnica alternativa di criosezione del DRG, la tecnica di purificazione dei tessuti richiede tempo e lavoro. In confronto, la criosezione del DRG è rapida e relativamente facile da eseguire, e quindi rimane una tecnica chiave per l'immunoistochimica e gli studi di struttura del DRG e di altre regioni del sistema nervoso centrale. Tuttavia, ottenere sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini rimane una sfida nella ricerca neuroscientifica a causa delle minuscole dimensioni del campione di tessuti, come il DRG e alcune regioni cerebrali, e non esiste un articolo che descriva il protocollo ottimale a questo punto per la criosezione di campioni di tessuto di piccole dimensioni, come i DRG di topo.
Questo protocollo fornisce una tecnica semplice e passo-passo per il sezionamento criostatico del DRG di topo per ottenere in modo affidabile il maggior numero di sezioni DRG di alta qualità sui vetrini per i successivi studi DRG. Sebbene sia stata progettata specificamente per la criosezione di campioni DRG, questa tecnica può potenzialmente essere utilizzata per la criosezione di vari altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td>Anesthetize animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1910</td>
			<td>Hold the OCT section at the bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergo Tweezers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S95310</td>
			<td>Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o&#8217;clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td>To collect the DRG section&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>133794</td>
			<td>&#160;Mark the orientation of base OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scigen&#160;Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;23730571</td>
			<td>Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for mouse dorsal root ganglion cryosectioning

Le sezioni del criostato del ganglio della radice dorsale (DRG) di topo di alta qualità sono fondamentali per una corretta colorazione immunochimica e studi di RNAscope nella ricerca di dolore infiammatorio e neuropatico, prurito e altre condizioni neurologiche periferiche. Tuttavia, rimane una sfida ottenere costantemente sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini a causa delle minuscole dimensioni del campione del tessuto DRG. Finora, non esiste un articolo che descriva un protocollo ottimale per la criosezione DRG. Questo protocollo presenta un metodo passo-passo per risolvere le difficoltà frequentemente incontrate associate alla criosezione DRG. L'articolo presentato spiega come rimuovere il liquido circostante dai campioni di tessuto DRG, posizionare le sezioni DRG sul vetrino rivolte verso lo stesso orientamento e appiattire le sezioni sul vetrino senza curvare verso l'alto. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per la criosezione dei campioni DRG, può essere applicato per la criosezione di molti altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

L'attuale studio ha raccolto circa 16 sezioni DRG continue e di alta qualità da un topo L4 DRG. Le sezioni ottenute erano prive di qualsiasi distorsione. La Figura 1 illustra la procedura passo-passo per la criosezione. La rimozione del liquido in eccesso dalle sezioni di tessuto è mostrata nella Figura 2. Il processo di incorporazione OCT dei tessuti è evidenziato nella Figura 3. La Figura 4 mostra ...

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A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning (Video) | JoVE 

Di seguito viene presentato lo sviluppo per l'acquisizione costante di sezioni criostatiche gangliari a radice dorsale di alta qualità.

Una procedura per la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...

Rimane una sfida ottenere costantemente sezioni di criostato del ganglio della radice dorsale del topo di alta qualità, intatte e piatte. La ricerca mira a rispondere a come acquisire la sezione ideale del criostato del ganglio della radice dorsale del topo. Questo protocollo fornisce una semplice tecnica passo-passo per la sezione criostatica del DRG del topo nelle sezioni del criostato DRG del topo di alta qualità, intatte e piatte.Questo articolo presentato spiega come rimuovere il liquido circostante dal tessuto del campione DRG di topo, posizionando le sezioni DRG sui vetrini rivolti verso lo stesso orientamento e appiattire le sezioni DRG senza curvare verso l'alto. Una delle principali sfide è che le sezioni OCT del mouse DRG tendono a curvarsi in un rotolo, rendendo difficile il posizionamento sul vetrino. È anche difficile acquisire sezioni sufficienti da un campione a causa delle piccole dimensioni del DRG del topo.