Name: A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-09T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning at JoVE.com

För den aktuella studien godkändes djurförsöken av UCSF Institutional Animal Care and Use Committee och utfördes i enlighet med NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Vuxna, 8-12 veckor gamla C57BL/6 han- och honmöss (egenuppfödda) användes här.
1. Beredning av DRG-prov
<ol><li>Bedöva mössen med 2,5 % Avertin (se Materialförteckning). Säkerställ adekvat anestesi genom brist på svar på smärtsam stimulering. Perfundera djuren tr...

Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

<ol>
	<li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain.">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain.">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).</li><li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+its+role+in+pain.">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li><li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+study+of+oxytocin+expression.">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).</li><li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain:+implications+for+clinical+practice.">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li><li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation.">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li><li>Chen, X. J., Sun, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+circuit+mechanisms+of+itch.">Central circuit mechanisms of itch.</a> Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).</li><li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms:+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways.">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li><li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury:+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets.">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li><li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain.">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li><li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UBA1/GARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li><li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations.">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li><li>Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+somatosensory+neuron+involvement+in+the+SOD1(G93A)+mouse+model.">Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).</li><li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels.">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).</li><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines.">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).</li><li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain.">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li><li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury:+roles+in+inflammation,+cell+death+and+nociception.">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li><li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function.">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+outgrowth,+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia.">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).</li><li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons:+Linking+structure+with+polarity+and+function.">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li><li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease.">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li><li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons.">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752 (2021).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRGquant:+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG.">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).</li></ol>

Detta protokoll ger en enkel steg-för-steg-procedur för kryostatsektionering av musens DRG för att få högkvalitativa DRG-sektioner på objektglas på ett tillförlitligt sätt. Det finns fyra viktiga steg i detta protokoll. Först måste DRG-provet och pincetten vara torra innan DRG-provet sätts på bas-OCT. All vätska som omger DRG-provet kommer att bilda ett isskal runt det, vilket resulterar i att DRG-sektioner separeras från OCT och kröker sig. För det andra, om aluminiumblocket inte har ett märke, eller o...

Dorsalrotsgangliet (DRG) innehåller de primära sensoriska neuronerna, vävnadsmakrofagerna och satellitcellerna som omger de primära sensoriska neuronerna 1,2,3,4. Det är en viktig anatomisk struktur vid bearbetning av ofarliga och skadliga signaler och spelar avgörande roller vid smärta, klåda och olika perifera nervsjukdomar 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Även om flera metoder har utvecklats för att dissekera DRG-vävnad från musens ryggmärg14,15,16, är kryosektionering av DRG-vävnaden fortfarande utmanande eftersom DRG-vävnaden är ganska liten, och kryostatsektioner av DRG-prover tenderar att kröka sig till rullar, vilket gör det svårt att korrekt överföra kryostatsektionerna till glasskivor. Korrekt kryosektion av DRG-vävnaden är dock avgörande för immunhistokemiska studier och strukturen hos DRG-sensoriska neuroner 17,18,19,20,21,22,23. Dessutom, eftersom resultat från encells-RNA-sekvensering har avslöjat den anmärkningsvärda heterogeniteten hos DRG-sensoriska neuroner hos både människor24 och möss25, är korrekt kryosektion av DRG-vävnad avgörande för att undersöka den funktionella rollen hos olika DRG-celler vid olika fysiologiska och patologiska tillstånd.
Även om vävnadsrensningstekniken har använts för att undersöka 3D-rekonstruktionen av DRG26 som en alternativ teknik för kryosektion av DRG, är vävnadsrensningstekniken tids- och arbetskrävande. I jämförelse är kryosektionering av DRG snabb och relativt enkel att utföra, och därför är det fortfarande en nyckelteknik för immunhistokemi och strukturstudier av DRG och andra regioner i centrala nervsystemet. Att få högkvalitativa, intakta och platta kryostatsektioner på glasskivor är dock fortfarande en utmaning inom neurovetenskaplig forskning på grund av den lilla provstorleken av vävnader, som DRG och vissa hjärnregioner, och det finns ingen artikel som beskriver det optimala protokollet vid denna tidpunkt för kryosektion av små vävnadsprover, såsom mus-DRG.
Detta protokoll ger en enkel, steg-för-steg-teknik för kryostatsnittning av musens DRG för att på ett tillförlitligt sätt erhålla så många högkvalitativa DRG-sektioner på objektglasen för efterföljande DRG-studier. Även om den är speciellt utformad för kryosektionering av DRG-prover, kan denna teknik potentiellt användas för kryosektion av olika andra vävnader med en liten provstorlek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Avertin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td>Anesthetize animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia&#160;Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1910</td>
			<td>Hold the OCT section at the bottom&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergo Tweezers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S95310</td>
			<td>Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o&#8217;clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td>To collect the DRG section&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>133794</td>
			<td>&#160;Mark the orientation of base OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scigen&#160;Tissue-Plus O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;23730571</td>
			<td>Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for mouse dorsal root ganglion cryosectioning

Högkvalitativa kryostatsektioner av musdorsalrotsganglion (DRG) är avgörande för korrekt immunkemisk färgning och RNAscope-studier vid forskning om inflammatorisk och neuropatisk smärta, klåda och andra perifera neurologiska tillstånd. Det är dock fortfarande en utmaning att konsekvent få högkvalitativa, intakta och platta kryostatsektioner på glasskivor på grund av den lilla provstorleken på DRG-vävnaden. Än så länge finns det ingen artikel som beskriver ett optimalt protokoll för DRG-kryosektion. Detta protokoll presenterar en steg-för-steg-metod för att lösa de ofta förekommande svårigheterna i samband med DRG-kryosektion. Den presenterade artikeln förklarar hur man tar bort den omgivande vätskan från DRG-vävnadsproverna, placerar DRG-sektionerna på objektglaset i samma riktning och plattar till sektionerna på glasglaset utan att böja sig. Även om detta protokoll har utvecklats för kryosektionering av DRG-proverna, kan det användas för kryosektion av många andra vävnader med en liten provstorlek.

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

I den aktuella studien samlades cirka 16 kontinuerliga, högkvalitativa DRG-sektioner in från en mus L4 DRG. De erhållna sektionerna var utan någon förvrängning. Figur 1 visar steg-för-steg-proceduren för kryosektioneringen. Avlägsnandet av extra vätska från vävnadssnitten visas i figur 2. Processen för OCT-inbäddning av vävnaderna är markerad i figur 3. Figur 4 visar den korrekta placeri...

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning at JoVE.com

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning (Video) | JoVE 

Här presenteras utvecklingen för att konsekvent förvärva högkvalitativa kryostatsektioner för dorsalrotsganglioner.

En procedur för kryosektion av dorsalrotsganglioner hos möss

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...

Det är fortfarande en utmaning att konsekvent få högkvalitativa, intakta och platta kryostatsektioner för dorsalrotsganglion hos möss. Forskningen syftar till att svara på hur man kan få idealisk kryostatsektion av dorsalrotganglion hos möss. Detta protokoll ger en enkel steg-för-steg-teknik för kryostatsektion av musens DRG till högkvalitativa, intakta och platta DRG-kryostatsektioner för möss.Den här presenterade artikeln förklarar hur man tar bort omgivande vätska från musens DRG-provvävnad, placerar DRG-sektionerna på objektglasen som är vända mot samma orientering och plattar till DRG-sektionerna utan att böja sig. En stor utmaning är att OCT-sektionerna av musens DRG tenderar att böja sig till en rulle, vilket gör den svår att placera på glasglaset. Det är också utmanande att få tillräckligt med sektioner från ett prov på grund av den lilla storleken på musens DRG.