Name: Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-22T13:00:00
Duration: 1 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا التعاون في علم الوراثة الذرة ، ومشروع جينوم خلايا الذرة ، وديف جاكسون (مختبر كولد سبرينج هاربور ، نيويورك) ، وآن دبليو سيلفستر (المختبر البيولوجي البحري ، جامعة شيكاغو ، إلينوي) ، وأندريا جالافوتي (جامعة روتجرز ، نيوجيرسي) ، وكارولين جي راسموسن (جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد) لتوفير المخزونات الطافرة والمحورة وراثيا ، وكذلك روبرت ف. بيكر وألكسندر جوركيفيتش من مركز المجهر الضوئي المتقدم في جامعة ميسوري كولومبيا لمساعدتهم في الفحص المجهري متحد البؤر. تم دعم JMR من قبل زمالة J. William Fulbright ، وصندوق Diane P. و Robert E. Sharp ، وبرنامج أبحاث الجينوم النباتي التابع لمؤسسة العلوم الوطنية (IOS-1546873) إلى PM. يتم دعم CDTC و CMRV و EDCDP و RJRR من قبل برنامج المنح الدراسية في كلية أتينيو. يتم دعم CDTC و EDCDP و RJRR من خلال منحة DOST-SEI S &T الجامعية. يتم دعم DODL من قبل منحة الأب توماس شتاينبوغلر SJ الأكاديمية. يتم دعم RJRR من قبل Aiducation International - Pathways to Higher Education Scholarship. تم دعم هذا العمل من قبل كلية العلوم والهندسة ومكتبة ريزال ، جامعة أتينيو دي مانيلا.

Improved Methods for Imaging Maize Leaf Primordia

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

نقدم طريقتين لإعداد بريمورديا أوراق الذرة للتصوير الخلوي. تسمح الطريقة الأولى (قسم البروتوكول 2) بقياس البدائية لتحليل المقطع العرضي ، بينما تتيح الطريقة الثانية (قسم البروتوكول 3) فتح وتسطيح البدائية لتحليل التركيب الكامل. تسهل هذه الطرق التصوير الخلوي ل FPs في أوراق الذرة الأولية24 (كما هو موضح في الشكل 4 والشكل 5) وتوفر حلولا بسيطة لتحديات تصوير أوراق الذرة النامية. يقلل قسم البروتوكول 2 من وقت التشريح ويحسن دقة أخذ العينات عن طريق قياس البدائية قبل التقسيم بدلا من الاعتماد فقط على معلمات التدريج 9,16. مع شريط نانو متاح تجاريا ، يحل قسم البروتوكول 3 المشكلة طويلة الأمد المتمثلة في تصوير البدائية ذات الأوراق الكاملة في الذرة. يحسن هذا البروتوكول الطريقة السابقة ، التي تستخدم أنابيب غسيل الكلى 31 ، وهو بديل أرخص بكثير للتصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي11،32،33. ومع ذلك ، عندما يتعلق الأمر بتصور السمات التشريحية للأوراق وتحقيق أفضل النتائج ، فإن كلا البروتوكولين لهما بعض القيود ، الموضحة في الجدول 2 وتتم مناقشتها بمزيد من التفصيل أدناه.
في قسم البروتوكول 2 ، واجهنا صعوبة في تصور الخطوط العريضة للخلايا في أقسام عرضية سميكة من البدائية للأوراق ، ولم يقدم التلطيخ المضاد بأصباغ الفلورسنت المرتبطة بجدار الخلية أو غشاء البلازما نتائج مرضية. على سبيل المثال ، أنتجت FM 4-64 نتائج دون المستوى الأمثل مقارنة بعلامة FP لغشاء البلازما ، p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; الشكل 3 أ - د). للتغلب على هذا القيد ، نوصي باستخدام اهتزاز لإنتاج أقسام أنسجة أرق (~ 0.1 مم)58 والتي ستسمح بتصوير مجال مشرق حيوي لمخططات الخلايا أو تحسين بروتوكول التلوينالمضاد 47,59.
في قسم البروتوكول 3 ، يتمثل القيد الرئيسي في صعوبة تركيب الورقة دون تمزق أو تلف أو فقاعات هواء ، كما هو مفصل في خطوات البروتوكول 3.2.5-3.2.6 (الشكل 3E-K). نظرا لأن ورقة الذرة متناظرة ثنائيا ، فقد يكون حامل نصف ورقة بدلا من حامل ورقة كاملة كافيا للتصور9. للقيام بذلك ، يمكن قطع البدائية بشفرة حلاقة على طول المحور الطولي بعد فكها حتى الوسط ، مما يسمح بتركيب نصف الورقة فقط. هناك قيد آخر لقسم البروتوكول 3 وهو أن سمك الورقة يمكن أن يحد من الدقة البصرية لإشارة الفلوروفور أثناء التصوير العميق. لمعالجة هذه المشكلة ، من الممكن استخدام تقنية إزالة الأنسجة60. ومع ذلك ، وجدنا أن ClearSee61 ، وهو كاشف إزالة شائع الاستخدام لتصوير الأنسجة النباتية ، غير متوافق مع البروتوكول لأنه يتسبب في انفصال العينة والغطاء عن الشريط النانوي. يمكن أن يكون الحل المحتمل لهذه المشكلة هو تطبيق غشاء شبه منفذ31 على عينة الورقة ، مما يسمح بمعالجتها بمحلول المقاصة أثناء تثبيتها في مكانها بواسطة الشريط النانوي. يمكن أيضا استخدام مثل هذه الطريقة التي تسمح بتطبيق المحاليل السائلة على الورقة غير الملفوفة في تقنيات التهجين الكامل للحمض النووي الريبي في الموقع وتقنيات التوطين المناعي ، والتي تم تحسينها سابقا لتطوير نورات الذرة ولكن ليس للأوراق الكاملةالبدائية 62,63.
وصفنا بروتوكولات الذرة ، التي تحتوي على أوراق بريمورديا كبيرة حتى في مرحلة الشتلات. قد تتطلب أنواع الحشائش الأخرى ذات الأوراق الأولية الأصغر بكثير ، مثل الأرز والشعير والقمح و Setaria و Brachypodium16،23،64،65،66 ، استخدام أدوات دقيقة إضافية لتطبيق هذه البروتوكولات بشكل فعال. علاوة على ذلك ، لم تكن هذه البروتوكولات مخصصة لتصوير الخلايا الحية ، والتي تلتقط العمليات الديناميكية في الوقت الفعلي لتكوين الأنسجة والاستجابات الخلوية. ومع ذلك ، مع استمرار تقدم مجسات الفلورسنت وتقنيات التصوير وقدرات الحوسبة في تصوير الخلايا الحية للنباتات67 ، يمكن أن تبني الأبحاث المستقبلية على هذه البروتوكولات لتطوير استراتيجيات تصوير الخلايا الحية المصممة خصيصا للميزات الفريدة لأوراق العشب البدائية.

تعد المحاصيل العشبية مصدرا رئيسيا للغذاء والوقود الحيوي لسكان العالم1 ، وتحسين تشريح الأوراق لديه القدرة على زيادة إنتاجيتها 2,3. ومع ذلك ، فإن فهمنا الحالي لكيفية تنظيم تشريح الأوراق في الأعشاب محدود4 ويتطلب تحليل الأوراق البدائية ، حيث يتم تحديد العديد من السمات التشريحية والفسيولوجية للورقة مسبقا في وقت مبكر من التطور5،6،7. لا غنى عن تقنيات التصوير الخلوي ، مثل التألق والتصوير متحد البؤر ، لدراسة تشريح أوراق العشب والسمات الخلوية ، ولكن من الصعب تطبيق هذه التقنيات على بريمورديا أوراق العشب لأنها مغلفة بعمق وملفوفة داخل دوامة الأوراق. لقد عالجنا هذه المشكلة من خلال تطوير طرق لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل الأوراق الكاملة غير الملفوفة للتألق والتحليل البؤري لأوراق الذرة البدائية ، وهو نظام نموذجي لدراسة تشريح أوراق العشب وتطورها2،8.
تتكون ورقة الذرة ، مثل جميع أوراق العشب ، من شفرة تشبه الشريط مع غمد يلتف حول الساق ويتطور في الساق 9،10،11،12،13. تتطور الأوراق من المرستيم القمي للساق (SAM) في نمط distichous ، حيث تبدأ كل ورقة جديدة في الموضع المعاكس للورقة السابقة ، مما ينتج عنه رتبتان من الأوراق على طول المحور الرأسي (الشكل 1 أ) 14 . يتم تحديد المرحلة التنموية لكل ورقة بريمورديوم من خلال موقعها بالنسبة إلى SAM ، مع تعيين أقرب بريمورديوم على أنه plastochron1 (P1) والبريمورديا التالية المعينة على أنها P2 و P3 وما إلى ذلك (الشكل 1B ، C) 2. أثناء التطور (الشكل 1D) ، تظهر ورقة البدائية أولا كدعامة على شكل هلال حول قاعدة SAM (P1) ، ثم تنمو لتصبح بريمورديوم على شكل غطاء يمتد فوق meristem (P2) 9،10،11. ثم تتوسع الحواف القاعدية للغطاء بشكل جانبي وتتداخل مع بعضها البعض مع نمو الطرف لأعلى ، مكونا بدائيا مخروطي الشكل (P3-P5) 10. ثم ينمو طول البدائية بسرعة ، وتصبح حدود شفرة الغمد في القاعدة أكثر بروزا مع تكوين الرباط ، وهو الإسقاط الشبيه بالهامش على الجانب المحوري للورقة (P6 / P7). أخيرا ، تنفتح الورقة عند خروجها من الزهرة أثناء نمو الحالة المستقرة ، حيث يتم تقييد الخلايا المنقسمة داخل المنطقة القاعدية الصغيرة للشفرة ، وتشكيل تدرج مع خلايا متوسعة ومميزة على طول المحور القريب البعيد (P7 / P8) 15. تحتوي قمة تبادل لشتلة الذرة على العديد من البدائيات في مراحل مختلفة من التطور ، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة نمو الأوراق8.
يتطلب التحليل الدقيق لتطور الأوراق المبكر التدريج أو استخدام معايير موحدة لتحديد مراحل متميزة من تطور البدائية فيما يتعلق بالنمو أو المعلمات المورفولوجية الأخرى. نظرا لأن ورقة البدائية مخفية داخل ساق العشب ، يستخدم الباحثون عادة معلمات مثل عمر النبات أو حجم الأوراق الناشئة كتنبؤات لمراحل وأحجام ورقة البدائية 9,16. في الذرة ، يتم تحديد العمر الزمني للنبات إما بعدد الأيام بعد الزراعة أو الإنبات (DAP / DAG)17,18. يتم تحديد المرحلة الخضرية (المرحلة V) من خلال الورقة العلوية ذات الياقة المرئية ، وخط شاحب على الجانب المحوري بين النصل والغمد يتوافق مع موضع الرباط والأذنين ، وزوج من المناطق على شكل إسفين عند قاعدة النصل (الشكل 1 أ ، ب)17,19 . بين 20 و 25 DAG ، ينتقل SAM إلى مرستيم الإزهار ويتوقف عن إنتاج أوراق جديدة20. يمكن أن تختلف معدلات نمو نبات الذرة البدائية اعتمادا على البيئة والنمط الوراثي للنبات. لهذا السبب ، لا يمكن لعمر النبات وحجم الأوراق الناشئة التنبؤ بدقة بأحجام الأوراق البدائية ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يساعد استخدام هذه المعلمات في التنبؤ بنطاق مراحل وأحجام Primordia للأغراض التجريبية.
يعد تحليل المقطع المستعرض طريقة شائعة لفحص تشريح الأوراق وتطورها في الذرة والأعشاب الأخرى لأنه يسمح بأخذ عينات من البلاستوكرونات المتعددة في قسم واحد عبر الساق21،22،23. هذه الطريقة ملائمة أيضا للتصوير الخلوي للعينات الطازجة ، حيث تعمل الأوراق المحيطة كسقالة تحافظ على بدائية الأوراق في مكانها أثناء التقسيم والتركيب24. ومع ذلك ، فإن عيب هذه الطريقة هو أنه قد يكون من الصعب تحديد موقع البلاستوكرون المستهدف والمنطقة بدقة داخل البدائية عند التقسيم من لقطة سليمة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نمو الأوراق يختلف عبر البلاستوكرون وعلى طول المحور القريبالبعيد 2,5 ، فقد يؤدي أخذ العينات غير الدقيق إلى تفسير غير صحيح لمرحلة نمو ومنطقة البدائية في قسم معين. لذلك ، فإن تطوير طريقة لأخذ عينات دقيقة من المقطع المستعرض أمر بالغ الأهمية لضمان دقة وتكرار التحليلات التشريحية والتنموية لأوراق العشب البدائية.
يتيح تحليل جبل الورقة الكاملة التحقيق الشامل والتكاملي للأنسجة والعمليات الخلوية التي تحدث على نطاق العضو بالكامل ، مثل النمو التكاثري25 ونمط الوريد26،27،28. توفر الطريقة نظرة عامة على الورقة ، مما يسمح باكتشاف عمليات وأنماط مميزة يصعب اكتشافها باستخدام تحليل المقطع العرضي24،27. على عكس أرابيدوبسيس ، حيث توجد بالفعل طرق راسخة لتصوير حوامل الأوراق الكاملة29,30 ، لا توجد حاليا طريقة قياسية لتصوير حوامل الأوراق الكاملة غير المطوية في الأعشاب. تضمن بروتوكول سابق لفك أوراق الذرة المعزولة مواد غير شائعة ولم يكن مناسبا للتصوير الخلوي31. يمكن لتقنيات التصوير المتقدمة ، مثل التصوير المقطعي المحوسب (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، الحصول على معلومات تشريحية ثلاثية الأبعاد دون عزل وفتح البدائية11،32،33 ، لكنها باهظة الثمن وتتطلب معدات متخصصة. إن تطوير تقنية للتغلب على القيود التي يفرضها التشكل المدلفن والمخروطي للأوراق البدائية في الذرة والأعشاب الأخرى من شأنه أن يعزز التحقيقات في سماتها التشريحية والتنموية.
هنا ، نقدم طرقا لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة البدائية للتألق والتصوير متحد البؤر. استخدمنا هذه الطرق لتحديد عدد الوريد ورسم خريطة لتوزيع الهرمونات المكانية والزمانية في أوراق الذرة البدائية مع البروتينات الفلورية (FPs)24. تتضمن الطريقة الأولى إزالة الجزء العلوي من الأوراق القديمة من شتلات الذرة باستخدام متجرد سلكي (الشكل 1E). من خلال تعريض طرف البدائية (P5-P7) ، يصبح من الممكن تحديد طوله دون الحاجة إلى إزالة الأوراق المحيطة القديمة تماما ، مما يتيح التقسيم السهل والدقيق. تتضمن الطريقة الثانية فك وتركيب بريمورديا كاملة الأوراق (P3-P7) بشريط نانو شفاف على الوجهين (الشكل 1F). هذه الطرق مناسبة لتصور مختلف FPs24 ولكنها تحتاج إلى تحسين لاستخدام الأصباغ الفلورية وكواشف الإزالة. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح بعض الإجراءات لتسطيح مكدسات z ، وخياطة الصور ، ودمج القنوات في ImageJ / FIJI34 ، والتي تنطبق على الصور التي تنتجها الطريقتان. هذه الطرق مفيدة للتألق الروتيني أو التصوير البؤري لأوراق الذرة ، ولكن يمكن أيضا تكييفها مع أنواع العشب النموذجية الأخرى ، مثل الأرز و Setaria و Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> الشكل 1: تنظيم ومورفولوجيا أوراق الذرة البدائية ونظرة عامة على الطرق . (أ) تمثيل تخطيطي لشتلة الذرة. الذرة لها سلالة ديستيكوس ، حيث تبدأ الورقة الجديدة في الموضع المعاكس للورقة السابقة. يشير رقم الورقة إلى الترتيب الزمني الذي ظهرت به الأوراق من الإنبات (أي الورقة الأولى ، L1 ؛ الورقة الثانية ، L2 ؛ الورقة الثالثة ، L3 ؛ إلخ). تحتوي كل ورقة على شفرة بعيدة وغمد قاعدي محدد بواسطة طوق يتوافق مع الرباط والأذن. تشير الورقة العلوية ذات الياقة المرئية إلى المرحلة الخضرية. الشتلات في هذا المثال في مرحلة V2 ، مع طوق L2 (رأس السهم) مرئية. يشير رمز المقص إلى الموقع في mesocotyl (أنا) حيث يجب قطع الشتلات من أجل جمعها. (ب) تمثيل تخطيطي للساق المقطعة يظهر L1 إلى L4 معزولا، مع عرض الورقة الأولية L5 إلى L9 كصورة مكبرة في (C). يشير رقم البلاستوكرون إلى موضع البدائية بالنسبة إلى SAM ، مع أصغر ورقة بريمورديوم (P1) الأقرب إلى SAM والأوراق الأقدم بريمورديا (P2 ، P3 ، P4 ، وهكذا) على التواليأبعد 2. (د) تمثيل تخطيطي لمورفولوجيا أوراق الذرة الأولية من P1 إلى P5. (ه) نظرة عامة تخطيطية لطريقة تحليل المقطع المستعرض لبدائية أوراق الذرة. (1) تقليم الأوراق القديمة باستخدام متجرد سلكي. (2) قياس البدائية وقسم تبادل لاطلاق النار. (3) قم بتركيب القسم على شريحة للتصوير والمعالجة (4 ، 5). (و) نظرة عامة تخطيطية لطريقة التحليل الكامل لأوراق الذرة البدائية. (1) قم بإزالة الأوراق المحيطة لاستخراج البدائية. (2) قص وفك البدائية المسطحة على شريط النانو. (3) تركيب العينة للتصوير والمعالجة (4 ، 5). الاختصارات: L = ورقة ؛ bl = شفرة ؛ ش = غمد ؛ ثاني أكسيد الكربون = طوق ؛ أنا = ميزوكوتيل. V = نباتي ؛ P = بلاستوكرون ؛ SAM = تبادل لاطلاق النار meristem القمي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

في الذرة (Zea mays) والأعشاب الأخرى (Poaceae) ، تغلف الأوراق البدائية بعمق وتدحرجت داخل دوامة الأوراق ، مما يجعل من الصعب دراسة نمو الأوراق المبكر. هنا ، نصف طرق تحضير المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة البدائية للتصوير الفلوري والتصوير متحد البؤر. تستخدم الطريقة الأولى متجردا سلكيا لإزالة الأجزاء العلوية من الأوراق القديمة ، مما يعرض طرف الورقة الأولية ويسمح بقياسها لأخذ عينات أكثر دقة من المقطع العرضي. تستخدم الطريقة الثانية شريطا نانويا واضحا على الوجهين لفتح وتركيب بريمورديا كاملة الأوراق للتصوير. نعرض فائدة الطريقتين في تصور وتحليل مراسلي البروتين الفلوري في الذرة. توفر هذه الطرق حلا للتحديات التي يطرحها التشكل المميز لأوراق الذرة البدائية وستكون مفيدة لتصور وقياس السمات التشريحية والتنموية للأوراق في الذرة وأنواع العشب الأخرى.

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

تحليل المقطع المستعرض لأوراق الذرة البدائية استخدمنا قسم البروتوكول 2 لتحديد عدد الوريد وتوصيف أنماط الاستجابة الهرمونية في المقاطع المستعرضة لأوراق الذرة الأولية مع FPs (الشكل 4) 24. لتقييم دور هرمون الأوكسين النباتي في نمو الأوراق وتكوين الوريد، حددنا عدد الأوردة في الورقة البدائية لطافرة الذرة التي تعاني من نقص الأوكسين، والتي تتلاشى شرابة254. في البلاستوكرونات المبكرة ، تظهر الأوردة النامية خلوية مميزة في طبقة الخلايا المتوسطة لأوراق الذرة البدائية21,22. ومع ذلك ، فإن تحديد الأوردة وعدها باستخدام التقنيات النسيجية التقليدية22 يمكن أن يكون كثيف العمالة ويستغرق وقتا طويلا. وهكذا، لتحديد كمية الأوردة، استخدمنا علامة بروتين تدفق أوكسين الذرة p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP فيما بعد)، والتي تشير إلى الأوردة النامية والخيوط الشفافة (PCSs; الشكل 4 أ). باستخدام قسم البروتوكول 2 ، تمكنا من توحيد أخذ عينات المقطع المستعرض عن طريق قياس البدائية قبل التقسيم (الشكل 4B ، C). اكتشفنا اتجاها يحتوي فيه vt2 على بدائية أوسع وأوردة أكثر من المعتاد (الشكل 4D ، E) 24 ، وهو ما يتوافق مع البيانات من الأوراق الموسعة بالكامل55 ، مما يشير إلى أن العيب في vt2 بدأ في وقت مبكر من تطور الأوراق. باستخدام قسم البروتوكول 2 ، تمكنا أيضا من فحص أنماط التعبير عن مراسلي FP للاستجابة الهرمونية بشكل منهجي في ورقة البدائية (انظر أمثلة الصور في الشكل 4F-I). من خلال مخطط موحد لأخذ عينات المقطع المستعرض ، قمنا بتعيين توزيع استجابات الأوكسين والسيتوكينين (CK) وحمض الجبريليك (GA) عبر البلاستوكرونات والمناطق المختلفة من الأوراق البدائية ، واكتشفنا أنماط استجابة جديدة نفترض أن لها آثارا على نمو الأوراق وتكوين الوريد24. لذلك ، توضح هذه النتائج التمثيلية فائدة قسم البروتوكول 2 لتحليل المقطع العرضي لأوراق الذرة البدائية.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> الشكل 4: النتائج التمثيلية لتحليل المقطع العرضي لأوراق الذرة البدائية. (A-E) القياس الكمي لعدد الوريد وعرض البدائيات في ورقة البدائية للشرابة العادية والمتلاشية2 باستخدام علامة بروتين تدفق الأوكسين PIN1a-YFP. (أ) صور مضان تمثيلية للمقاطع المستعرضة من P5 إلى P7 التي تعبر عن PIN1a-YFP في الأوردة النامية والخيوط المفصلية. تم تصوير المقاطع المستعرضة باستخدام مجهر التألق باستخدام مرشح FITC (إثارة 495-519 نانومتر). تم تحديد عدد الأوردة وعرض البدائية باستخدام أدوات الخط متعدد النقاط والخط الحر في FIJI / ImageJ ، على التوالي. (ب) شتلة ذرة مع إزالة زهور الورقة العلوية بمتجرد سلكي لكشف قمة الورقة الرابعة (L4). يمتد القوس على طول البدائية المتوقع ، مع الخط المتقطع الذي يشير إلى منتصف الطول. (ج) رسم تخطيطي لأشكال البدائية المختلفة من P5 إلى P7 ، يوضح كيف يمكن أن يختلف عدد الوريد وعرض البدائية عند الطول المتوسط (الخط الأفقي المتقطع) اعتمادا على مرحلة تطور البدائية. (د، ه) قياس عرض البدائية (D) ورقم الوريد (E) في قسم منتصف الطول من L4 العادي و vt2. يمثل خط الاتجاه متوسطات التدحرج 10 مم للقياسات ± الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). (واو-ط) صور تمثيلية متحدة البؤر لمقاطع عرضية من أوراق البدائية التي تعبر عن مجموعات من PIN1a-YFP ، مراسل استجابة الأوكسين ، DR5-RFP ، مراسل استجابة السيتوكينين ، TCS-Tomato ، علامة استجابة حمض الجبريليك ، GAR2-YFP ، و mDII-Venus ، نسخة متحولة من مراسل إدخال إشارات الأوكسين DII-Venus. يتم تثبيت قنوات FP على قناة المجال الساطع في كل صورة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (أ) ؛ 10 مم (ب) ؛ 100 ميكرومتر (F-I). تم تعديل هذا الرقم واستنساخه بإذن من Robil و McSteen24. الاختصارات: DAG = أيام بعد الإنبات ؛ P = بلاستوكرون ؛ vt2 = شرابة التلاشي 2 ؛ PCS = حبلا بروكاميال ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر ؛ PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-الطماطم = TCSv2::NLS-tdالطماطم; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-فينوس = pzmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تحليل كامل لأوراق الذرة البدائية اتبعنا قسم البروتوكول 3 لتصور وتحليل تعبير FP في حوامل الأوراق الكاملة لأوراق الذرة البدائية (الشكل 5). من خلال تصور أنماط الوريد باستخدام PIN1a-YFP ، وجدنا أن تكوين الأوردة يحدث في البدائية بأكملها خلال البلاستوكرونات المبكرة ، لكن هذه العملية تصبح مقيدة في المناطق القريبة لاحقا في التطور (الشكل 5 أ)24. استكمالا لتحليلات المقطع العرضي ، كشفت تحليلات جبل الورقة الكاملة عن أنماط خاصة بالأنسجة والمرحلة لاستجابة الهرمونات أثناء تكوين الوريد24. أحد الأمثلة على ذلك هو نمط التعبير لمراسل استجابة CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato) ، بالنسبة إلى تعبير PIN1a-YFP (الشكل 5B)24. باتباع قسم البروتوكول 3 ، تمكنا من إجراء تحليلات نوعية وكمية لتعبير FP في ورقة البدائية (الشكل 5D-F ؛ بيانات غير منشورة). قمنا بفحص أنماط التعبير لمراسل استجابة الأوكسين ، DR5rev :: mRFPer41 (DR5-RFP) ، وعلامة استجابة GA ، p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP39 (GAR2-YFP) ، في حوامل كاملة الأوراق من طفرات مفردة ومزدوجة من vt2 والنبات القزم 3 (d3) ، طافر ناقصGA 56 (الشكل 5D). قارنا أيضا المستويات النسبية لتكاثر الخلايا بين البدائية العادية وأوراق vt2 باستخدام p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP) ، وهي علامة على انتقال G1 / S في دورة الخلية 57 (الشكل 5E ، F). في حين لم يكن هناك فرق كبير بين الطبيعي و vt2 ، كان تعبير Cyclin-D2B-YFP متسقا مع ملف تكاثر الخلايا المعروف للبلاستوكروناتالمبكرة 31. نستنتج أن قسم البروتوكول 3 هو طريقة فعالة لتحليل حوامل كاملة من أوراق الذرة البدائية ، والتي يصعب تصويرها بسبب مورفولوجيتها الملفوفة.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> الشكل 5: النتائج التمثيلية للتحليل الكامل لأوراق الذرة البدائية. (أ) صور مضان تمثيلية للأوراق البدائية ل 7 شتلة ذرة من DAG تظهر الأوردة النامية والخيوط البروكمبيالية ، كما هو موضح بعلامة بروتين تدفق الأوكسين PIN1a-YFP. تم استئصال P3-P6 primordia من القاعدة ، وفكها ، وتسويتها مع الجانب المحوري لأعلى. تظهر الأجزاء الداخلية لقطات مقربة ل P3 و P4. في P5 و P6 ، تحدد الخطوط المتقطعة النهاية البعيدة للمناطق التكاثرية ، حيث لا تزال غالبية الخيوط الاستباقية تتطور وتمتد. (ب، ج) صور تمثيلية متحدة البؤر تظهر تعبير PIN1a-YFP ومراسل استجابة السيتوكينين ، TCS-Tomato ، في المنطقة الهامشية القريبة من بدائية P5. (د) صور مضان تمثيلية ل P4 primordia تظهر تعبير مراسل استجابة الأوكسين ، DR5-RFP ، وعلامة استجابة حمض الجبريليك ، GAR2-YFP في الطفرات العادية والمفردة والمزدوجة للشرابة المتلاشية 2 والنبات القزم 3. (ه) صور تمثيلية متحدة البؤر ل P3 و / أو P4 تظهر تعبير Cyclin-D2B-YFP ، مراسل انتقال G1 / S في دورة الخلية. (F) الكميات النسبية لتكاثر الخلايا في ورقة P3 / P4 الأولية العادية و vt2 ، محددة كميا عن طريق قياس الكثافة المتكاملة لإشارة Cyclin-D2B-YFP فوق منطقة البدائية باستخدام ImageJ / FIJI. تمثل الأشرطة متوسط القياسات ± الخطأ المعياري للمتوسط. شريط المقياس = 500 ميكرومتر (A ، D ، E) ؛ 200 ميكرومتر (ب) ؛ 100 ميكرومتر (C). تم تعديل الشكل 4A-C واستنساخه بإذن من Robil و McSteen24 ، في حين أن الشكل 4D-F هو بيانات غير منشورة من المؤلفين. الاختصارات: DAG = أيام بعد الإنبات ؛ P = بلاستوكرون ؛ vt2 = شرابة التلاشي 2 ؛ d3 = نبات قزم 3 ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر ؛ PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-الطماطم = TCSv2::NLS-tdالطماطم; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; سيكلين-D2B-YFP = p Zm سيكلين-D2B::Zmسيكلين-D2B:YFP; ns = لا يوجد فرق كبير ؛ au = وحدة تعسفية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الملف التكميلي 1: أمثلة على مراحل تطور الأوراق في شتلات الذرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي S1: العينات النباتية والمواد المستخدمة في البروتوكولات. (أ، ب) شتلة الذرة 7-8 DAG مع إزالة دوامة الورقة العلوية باستخدام متجرد سلكي. (ب) يظهر الجزء الداخلي لقطة مقربة للساق باستخدام بدائية P6 المكشوفة. (ج-ز) براعم شتلات الذرة مع إزالة الزهرات العلوية لتحليل المقطع العرضي (C ، D) وإزالة الأوراق المحيطة بالكامل لتحليل التركيب الكامل (E-G). (H) لفافة من هلام البولي يوريثين شريط نانوي شفاف على الوجهين. (ط، ي) P6 ورقة primordium (I) والمنطقة القريبة من ورقة P8 (J) غير ملفوفة ومثبتة على شرائح زجاجية بشريط نانو. (ك) شريحة زجاجية ذات ورقة بريمورديوم غير ملفوفة مثبتة على مرحلة مجهر فوق التألق. اختصار: DAG = أيام بعد الإنبات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging (Video) | JoVE 

أوراق الذرة البدائية مغلفة بعمق وملفوفة ، مما يجعل من الصعب دراستها. هنا ، نقدم طرقا لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة البدائية للتألق والتصوير متحد البؤر.

طرق محسنة لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة الأولية للتصوير الفلوري والبؤري

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

الأعشاب مثل الذرة لها أوراق بريمورديا تنمو داخل الساق ، مما يجعل من الصعب دراستها. نعالج هذه المشكلة ببروتوكولات محسنة لإعداد المقاطع المستعرضة لأوراق الذرة وحوامل كاملة للتصوير الفلوري والتصوير متحد البؤر. يستخدم البروتوكول الأول متجردا سلكيا لقطع الأوراق القديمة ، مما يسمح بقياس البدائية قبل التقسيم.يستخدم البروتوكول الثاني شريطا نانويا واضحا على الوجهين لفتح ورقة بريمورديوم كاملة. تعمل هذه البروتوكولات على تحسين دقة التقسيم العرضي وتمكين فتح الأوراق البدائية ، والتي كان من الصعب جدا تحقيقها بسبب مورفولوجيتها المخروطية المدرفلة. ستكون هذه الطرق مفيدة لتصور وقياس السمات التشريحية والتنموية للأوراق في الذرة والأعشاب الأخرى.بناء على هذه الطرق ، نخطط لتطوير استراتيجيات تصوير الخلايا الحية لمعالجة الأسئلة المتعلقة بتطوير أوراق العشب.