Name: Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-22T13:00:00
Duration: 1 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Die Autoren danken der Maize Genetics Cooperation, dem Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) und Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) für die Bereitstellung der mutierten und transgenen Bestände sowie Robert F. Baker und Alexander Jurkevich vom Advanced Light Microscopy Core an der University of California. Missouri-Columbia für ihre Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. JMR wurde durch das J. William Fulbright Fellowship, den Diane P. and Robert E. Sharp Fund und das Plant Genome Research Program (IOS-1546873) der National Science Foundation unterstützt. CDTC, CMRV, EDCDP und RJRR werden durch das Stipendienprogramm des Ateneo College unterstützt. CDTC, EDCDP und RJRR werden durch das DOST-SEI S&T Undergraduate-Stipendium unterstützt. Das DODL wird durch das Akademische Stipendium von P. Thomas Steinbugler SJ unterstützt. RJRR wird von Aiducation International – Pathways to Higher Education Scholarship unterstützt. Diese Arbeit wurde von der School of Science and Engineering und der Rizal Library der Ateneo de Manila University unterstützt.

Improved Methods for Imaging Maize Leaf Primordia

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wir stellen zwei Methoden vor, um Maisblatt-Primordien für die zelluläre Bildgebung zu präparieren. Die erste Methode (Protokollteil 2) ermöglicht die Messung des Primordiums für die Querschnittsanalyse, während die zweite Methode (Protokollabschnitt 3) das Abrollen und Abflachen des Primordiums für die Analyse der gesamten Montierung ermöglicht. Diese Methoden erleichtern die zelluläre Bildgebung von FPs in Maisblattprimordien24 (wie in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt) und bieten einfache Lösungen für die Herausforderungen bei der Bildgebung von sich entwickelnden Maisblättern. Protokollabschnitt 2 reduziert die Präparierzeit und verbessert die Probenahmegenauigkeit, indem die Primordien vor dem Schneiden gemessen werden, anstatt sich nur auf die Staging-Parameterzu verlassen 9,16. Mit kommerziell erhältlichem Nanotape löst Protokollabschnitt 3 das seit langem bestehende Problem der Abbildung ganzblättriger Primordien in Mais. Dieses Protokoll verbessert die bisherige Methode, bei der Dialyseschläuche 31 verwendet wurden, und ist eine viel billigere Alternative zu CT und MRT11,32,33. Wenn es jedoch darum geht, anatomische Merkmale von Blättern zu visualisieren und optimale Ergebnisse zu erzielen, weisen beide Protokolle einige Einschränkungen auf, die in Tabelle 2 beschrieben und im Folgenden näher erläutert werden.
In Protokollabschnitt 2 hatten wir Schwierigkeiten, Zellumrisse in dicken Querschnitten der Blattprimordien sichtbar zu machen, und die Gegenfärbung mit Zellwand- oder Plasmamembran-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen lieferte keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Zum Beispiel lieferte FM 4-64 suboptimale Ergebnisse im Vergleich zum FP-Marker der Plasmamembran, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Abbildung 3A-D). Um diese Einschränkung zu überwinden, empfehlen wir die Verwendung eines Vibratoms, um dünnere Gewebeschnitte (~0,1 mm)58 zu erzeugen, was eine lebendige Hellfeld-Abbildung von Zellumrissen oder die Optimierung des Gegenfärbeprotokolls ermöglicht 47,59.
In Protokollabschnitt 3 besteht die Haupteinschränkung darin, dass es schwierig ist, den Flügel ohne Riss, Beschädigung oder Luftblasen zu montieren, wie in den Protokollschritten 3.2.5-3.2.6 beschrieben (Abbildung 3E-K). Da das Maisblatt beidseitig symmetrisch ist, kann für die Visualisierung9 eine halbblättrige Halterung anstelle einer ganzblättrigen Halterung ausreichen. Dazu kann das Primordium nach dem Abrollen bis zur Mittelrippe mit einer Rasierklinge entlang der Längsachse geschnitten werden, so dass nur die Hälfte des Blattes montiert werden kann. Eine weitere Einschränkung des Protokollabschnitts 3 besteht darin, dass die Dicke des Blattes die optische Auflösung des Fluorophorsignals während der Tiefenbildgebung begrenzen kann. Um dieses Problem zu lösen, ist es möglich, eine Gewebereinigungstechnik60 anzuwenden. Wir stellten jedoch fest, dass ClearSee61, ein häufig verwendetes Clearing-Reagenz für die Bildgebung von Pflanzengewebe, nicht mit dem Protokoll kompatibel ist, da es dazu führt, dass sich die Probe und das Deckglas vom Nanoband lösen. Eine mögliche Lösung für dieses Problem könnte darin bestehen, eine semipermeable Membran31 über die Blattprobe aufzubringen, so dass sie mit der Clearing-Lösung behandelt werden kann, während sie durch das Nanoband an Ort und Stelle gehalten wird. Eine solche Methode, die es ermöglicht, flüssige Lösungen auf das abgerollte Blatt aufzubringen, könnte auch für Whole-Mount-RNA-in-situ-Hybridisierungs- und Immunlokalisierungstechniken verwendet werden, die bisher für die Entwicklung von Maisblütenständen, nicht aber für ganzblättrige Primordien optimiert wurden 62,63.
Wir haben Protokolle für Mais beschrieben, der bereits im Keimlingsstadium große Blattprimordien hat. Andere Grasarten mit viel kleineren Blattprimordien, wie Reis, Gerste, Weizen, Setaria und Brachypodium 16,23,64,65,66, erfordern möglicherweise den Einsatz zusätzlicher Präzisionswerkzeuge, um diese Protokolle effektiv anzuwenden. Darüber hinaus waren diese Protokolle nicht für die Bildgebung lebender Zellen gedacht, die dynamische Prozesse der Gewebebildung und zellulärer Reaktionen in Echtzeit erfasst. Da jedoch Fluoreszenzsonden, Bildgebungstechnologien und Rechenkapazitäten bei der Bildgebung lebender Zellen für Pflanzen67 weiter voranschreiten, könnte die zukünftige Forschung auf diesen Protokollen aufbauen, um Strategien zur Bildgebung lebender Zellen zu entwickeln, die auf die einzigartigen Eigenschaften von Grasblatt-Primordien zugeschnitten sind.

Graspflanzen sind eine wichtige Nahrungsquelle und Biokraftstoffquelle für die Weltbevölkerung1, und die Verbesserung der Blattanatomie hat das Potenzial, ihre Produktivität zu steigern 2,3. Unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Blattanatomie bei Gräsern reguliert wird, ist jedoch begrenzt4 und erfordert die Analyse von Blattprimordien, da viele anatomische und physiologische Merkmale des Blattes früh in der Entwicklung vorgegeben sind 5,6,7. Zelluläre Bildgebungstechniken wie Fluoreszenz und konfokale Bildgebung sind unverzichtbar für die Untersuchung der Anatomie und der zellulären Merkmale von Grasblättern, aber diese Techniken lassen sich nur schwer auf Grasblattprimordien anwenden, da sie tief in den Blattquirl eingehüllt und gerollt sind. Wir haben dieses Problem angegangen, indem wir Methoden zur Herstellung von Querschnitten und abgerollten Ganzblatthalterungen für die Fluoreszenz- und konfokale Analyse von Maisblattprimordien entwickelt haben, einem Modellsystem zur Untersuchung der Anatomie und Entwicklung von Grasblättern 2,8.
Das Maisblatt besteht wie alle Grasblätter aus einer riemenartigen Halme mit einer Scheide, die sich um den Stängel wickelt und den Trieb 9,10,11,12,13 entwickelt. Die Blätter entwickeln sich aus dem apikalen Meristem (SAM) des Sprosses in einem distichösen Muster, bei dem jedes neue Blatt in der entgegengesetzten Position des vorherigen Blattes beginnt, was zu zwei Blattreihen entlang der vertikalen Achse führt (Abbildung 1A)14 . Das Entwicklungsstadium jedes Blattprimordiums wird durch seine Position relativ zum SAM identifiziert, wobei das nächstgelegene Primordium als Plastochron1 (P1) und die folgenden Primordien als P2, P3 usw. bezeichnet werden (Abbildung 1B,C)2. Während der Entwicklung (Abbildung 1D) erscheint das Blattprimordium zunächst als halbmondförmiger Strebepfeiler um die Basis des SAM (P1) und wächst dann zu einem haubenförmigen Primordium heran, das sich über das Meristem erstreckt (P2)9,10,11. Die basalen Ränder der Haube dehnen sich dann seitlich aus und überlappen sich, wenn die Spitze nach oben wächst, und bilden ein kegelförmiges Primordium (P3-P5)10. Das Primordium nimmt dann rasch an Länge zu, und die Scheiden-Blatt-Grenze an der Basis wird mit der Bildung des Blatthäutchens, dem fransenartigen Vorsprung auf der adaxialen Seite des Blattes (P6/P7), deutlicher. Schließlich entfaltet sich das Blatt, wenn es während des stationären Wachstums aus dem Wirtel austritt, bei dem die sich teilenden Zellen in der kleinen basalen Region der Spreite eingeschränkt sind und einen Gradienten mit expandierenden und differenzierenden Zellen entlang der proximal-distalen Achse bilden (P7/P8)15. Die Sprossspitze eines Maiskeimlings enthält mehrere Primordien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, was sie zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung der Blattentwicklung macht8.
Eine genaue Analyse der frühen Blattentwicklung erfordert eine Stadieneinteilung oder die Verwendung standardisierter Kriterien, um verschiedene Stadien der Primordiumentwicklung in Bezug auf andere Wachstums- oder morphologische Parameter zu definieren. Da die Blattprimordien im Grastrieb verborgen sind, verwenden die Forscher in der Regel Parameter wie das Alter der Pflanze oder die Größe der austreibenden Blätter als Prädiktoren für die Stadien und Größen der Blattprimordien 9,16. Bei Mais wird das chronologische Alter der Pflanze entweder durch die Anzahl der Tage nach der Pflanzung oder nach der Keimung (DAP/DAG) bestimmt17,18. Das vegetative Stadium (V-Stadium) wird durch das oberste Blatt mit sichtbarem Kragen, eine blasse Linie auf der abaxialen Seite zwischen der Blattspreite und der Scheide, die der Position des Blatthäutchens und der Ohrmuscheln entspricht, ein Paar keilförmiger Regionen an der Basis der Spreite bestimmt (Abbildung 1A,B)17,19 . Zwischen 20 und 25 DAG geht das SAM in ein Blütenstandsmeristem über und hört auf, neue Blätter zu produzieren20. Die Wachstumsraten von Maisblattprimordien können je nach Umgebung und Genotyp der Pflanze variieren. Aus diesem Grund können das Alter der Pflanzen und die Größe der austreibenden Blätter die Größe der Blattprimordien nicht genau vorhersagen. Die Verwendung dieser Parameter kann jedoch dazu beitragen, den Bereich der Primordia-Stadien und -Größen für experimentelle Zwecke vorherzusagen.
Die Querschnittsanalyse ist eine beliebte Methode zur Untersuchung der Blattanatomie und -entwicklung bei Mais und anderen Gräsern, da sie die Entnahme mehrerer Plastochronen in einem einzigen Schnitt über den Sprossermöglicht 21,22,23. Diese Methode eignet sich auch für die zelluläre Bildgebung frischer Proben, da die umgebenden Blätter als Gerüst dienen, das die Blattprimordien während des Schneidens und Montierens an Ort und Stelle hält24. Ein Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, dass es schwierig sein kann, den Zielplastochron und die Zielregion innerhalb des Primordiums genau zu lokalisieren, wenn aus einem intakten Spross geschnitten wird. Da das Blattwachstum zwischen den Plastochronen und entlang der proximal-distalen Achsevariiert 2,5, kann eine ungenaue Probenahme zu einer falschen Interpretation des Entwicklungsstadiums und der Region des Primordiums in einem bestimmten Abschnitt führen. Daher ist die Entwicklung einer Methode zur präzisen Querschnittsprobenahme von entscheidender Bedeutung, um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von anatomischen und entwicklungsbedingten Analysen von Grasblattprimordien zu gewährleisten.
Die Ganzblattanalyse ermöglicht die umfassende und integrative Untersuchung von Gewebe- und Zellprozessen, die auf der Ebene des gesamten Organs ablaufen, wie z. B. proliferatives Wachstum25 und Venenmusterung26,27,28. Die Methode bietet einen paradermalen Überblick über das Blatt und ermöglicht die Entdeckung unterschiedlicher Prozesse und Muster, die sonst mit Hilfe der Querschnittsanalyse schwer zu erkennen wären24,27. Anders als bei Arabidopsis, wo es bereits etablierte Methoden zur Bildgebung ganzblättriger Halterungen gibt29,30, gibt es derzeit keine Standardmethode zur Abbildung von ungerollten ganzblättrigen Halterungen in Gräsern. Ein früheres Protokoll zum Abrollen isolierter Maisblattprimordien betraf ungewöhnliche Materialien und war für die zelluläre Bildgebung nicht geeignet31. Fortschrittliche bildgebende Verfahren wie Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) können anatomische 3D-Informationen erfassen, ohne die Primordien zu isolieren und abzurollen 11,32,33, aber sie sind teuer und erfordern spezielle Geräte. Die Entwicklung einer Technik zur Überwindung der Einschränkungen, die durch die gerollte und konische Morphologie von Blattprimordien bei Mais und anderen Gräsern auferlegt werden, würde die Untersuchung ihrer anatomischen und entwicklungsbedingten Merkmale vorantreiben.
Hier stellen wir Methoden zur Herstellung von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung vor. Wir haben diese Methoden verwendet, um die Venenzahl zu quantifizieren und die räumlich-zeitliche Hormonverteilung in Maisblattprimordien mit fluoreszierenden Proteinen (FPs) zu kartieren24. Bei der ersten Methode wird der obere Teil älterer Blätter von Maissämlingen mit einer Abisolierzange entfernt (Abbildung 1E). Durch die Freilegung der Spitze des Primordiums (P5-P7) wird es möglich, seine Länge zu bestimmen, ohne die älteren umgebenden Blätter vollständig entfernen zu müssen, was ein einfaches und genaues Schneiden ermöglicht. Die zweite Methode besteht darin, ganzblättrige Primordien (P3-P7) mit durchsichtigem, doppelseitigem Nanoband abzurollen und zu montieren (Abbildung 1F). Diese Methoden eignen sich für die Visualisierung verschiedener FPs24, müssen jedoch für die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und Clearingreagenzien optimiert werden. Darüber hinaus beschreiben wir einige Verfahren zum Reduzieren von Z-Stapeln, zum Zusammenfügen von Bildern und zum Zusammenführen von Kanälen in ImageJ/FIJI34, die für die mit den beiden Methoden erzeugten Bilder gelten. Diese Methoden sind nützlich für die routinemäßige Fluoreszenz- oder konfokale Bildgebung von Maisblättern, können aber auch für andere Modellgrasarten wie Reis, Setaria und Brachypodium angepasst werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Abbildung 1: Organisation und Morphologie von Maisblattprimordien und Überblick über die Methoden . (A) Schematische Darstellung eines Maiskeimlings. Mais hat eine distichige Phyllotaxie, wobei das neue Blatt an der entgegengesetzten Position des vorherigen Blattes beginnt. Die Blattnummer gibt die chronologische Reihenfolge an, in der die Blätter aus der Keimung hervorgegangen sind (d. h. erstes Blatt, L1, zweites Blatt, L2, drittes Blatt, L3 usw.). Jedes Blatt hat eine distale Spreite und eine basale Scheide, die durch einen Kragen abgegrenzt wird, der dem Blatthäutchen und der Ohrmuschel entspricht. Das oberste Blatt mit sichtbarem Kragen kennzeichnet das vegetative Stadium. Der Sämling in diesem Beispiel befindet sich im V2-Stadium, wobei der L2-Kragen (Pfeilspitze) sichtbar ist. Das Scherensymbol zeigt die Stelle am Mesokotyl (Me) an, an der der Sämling geschnitten werden muss, um gesammelt zu werden. (B) Schematische Darstellung des präparierten Sprosses mit isolierten L1 bis L4, wobei die Blattprimordien L5 bis L9 als vergrößertes Bild in (C) dargestellt sind. Die Plastochronzahl gibt die Position des Primordiums relativ zum SAM an, wobei das jüngste Blattprimordium (P1) dem SAM am nächsten ist und die älteren Blattprimordien (P2, P3, P4 usw.) sukzessive weiter entfernt sind2. (D) Schematische Darstellung der Morphologie von Maisblattprimordien von P1 bis P5. (E) Schematische Darstellung des Verfahrens zur Querschnittsanalyse der Maisblattprimordien. (1) Schneiden Sie die älteren Blätter mit einer Abisolierzange ab. (2) Messen Sie das Primordium und schneiden Sie den Trieb. (3) Montieren Sie den Schnitt zur Bildgebung und Verarbeitung auf einen Objektträger (4, 5). (F) Schematische Übersicht über das Verfahren zur Whole-Mount-Analyse der Maisblatt-Primordien. (1) Entfernen Sie die umgebenden Blätter, um das Primordium zu extrahieren. (2) Schneiden Sie das Primordium ab und rollen Sie es flach auf dem Nanoband ab. (3) Montieren Sie die Probe für die Bildgebung und Verarbeitung (4, 5). Abkürzungen: L = Blatt; bl = Klinge; sh = Scheide; co = Kragen; me = Mesokotyl; V = vegetativ; P = Plastochron; SAM = apikales Meristem schießen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

Bei Mais (Zea mays) und anderen Gräsern (Poaceae) sind die Blattprimordien tief umhüllt und im Blattquirl eingerollt, was es schwierig macht, die frühe Blattentwicklung zu untersuchen. Hier beschreiben wir Methoden zur Präparation von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung. Bei der ersten Methode wird eine Abisolierzange verwendet, um die oberen Teile älterer Blätter zu entfernen, wodurch die Spitze des Blattprimordiums freigelegt wird und seine Messung für eine genauere Querschnittsprobenahme ermöglicht wird. Bei der zweiten Methode wird durchsichtiges, doppelseitiges Nanoklebeband verwendet, um ganzblättrige Primordien für die Bildgebung abzurollen und zu montieren. Wir zeigen den Nutzen der beiden Methoden bei der Visualisierung und Analyse fluoreszierender Proteinreporter in Mais. Diese Methoden bieten eine Lösung für die Herausforderungen, die sich aus der charakteristischen Morphologie von Maisblattprimordien ergeben, und werden für die Visualisierung und Quantifizierung von anatomischen und entwicklungsbedingten Merkmalen von Blättern bei Mais und anderen Grasarten nützlich sein.

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

Querschnittsanalyse von Maisblattprimordien Wir verwendeten Protokollabschnitt 2, um die Anzahl der Venen zu quantifizieren und Hormonreaktionsmuster in Querschnitten von Maisblattprimordien mit FPs zu charakterisieren (Abbildung 4)24. Um die Rolle des Pflanzenhormons Auxin für das Blattwachstum und die Venenbildung zu untersuchen, haben wir die Anzahl der Adern in den Blattprimordien einer Auxin-defizienten Maismutante, der verschwindenden Quaste, quantifiziert254. In frühen Plastochronen zeigen sich entwickelnde Adern in der medianen Zellschicht des Maisblattprimordiumsdeutlich zellularisiert 21,22. Die Identifizierung und Zählung von Venen mit konventionellen histologischen Techniken22 kann jedoch arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein. Um die Venen zu quantifizieren, verwendeten wir daher den Mais-Auxin-Efflux-Proteinmarker p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP im Folgenden), der sich entwickelnde Venen und prokambiale Stränge (PCS; Abbildung 4A). Mit Hilfe des Protokollabschnitts 2 konnten wir die Querschnittsprobenahme standardisieren, indem wir die Primordien vor dem Schnitt vermessen (Abbildung 4B,C). Wir entdeckten einen Trend, bei dem vt2 ein breiteres Primordium und mehr Adern als normal aufweist (Abbildung 4D,E)24, was mit den Daten von vollständig ausgebreiteten Blättern55 übereinstimmt, was darauf hindeutet, dass der Defekt in vt2 früh in der Blattentwicklung begann. Mit Hilfe von Protokollabschnitt 2 konnten wir auch die Expressionsmuster von FP-Reportern der Hormonantwort in den Blattprimordien systematisch untersuchen (siehe Beispiele der Bilder in Abbildung 4F-I). Durch ein standardisiertes Querschnitts-Probenahmeschema kartierten wir die Verteilung von Auxin-, Cytokinin- (CK) und Gibberellinsäure (GA)-Reaktionen auf verschiedene Plastochronen und Regionen von Blattprimordien und entdeckten neue Reaktionsmuster, von denen wir annehmen, dass sie Auswirkungen auf das Blattwachstum und die Venenbildung haben24. Daher zeigen diese repräsentativen Ergebnisse die Nützlichkeit des Protokollabschnitts 2 für die Querschnittsanalyse von Maisblattprimordien.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse für die Querschnittsanalyse von Maisblattprimordien. (A-E) Quantifizierung der Venenzahl und Primordiumbreite in Blattprimordien normaler und verschwindender Quasten2 mit dem Auxin-Efflux-Proteinmarker PIN1a-YFP. (A) Repräsentative Fluoreszenzbilder von Querschnitten von P5 bis P7, die PIN1a-YFP in sich entwickelnden Venen und prokambialen Strängen exprimieren. Die Querschnitte wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines FITC-Filters (495-519 nm Anregung) abgebildet. Die Anzahl der Erzgänge und die Mächtigkeit des Primordiums wurden mit den Mehrpunkt- bzw. Freihandlinienwerkzeugen in FIJI/ImageJ quantifiziert. (B) Ein Maissämling, bei dem die oberen Blattquirle mit einer Abisolierzange entfernt wurden, um die Spitze des vierten Blattes freizulegen (L4). Die Klammer erstreckt sich über die projizierte Primordiumlänge, wobei die gestrichelte Linie die mittlere Länge anzeigt. (C) Schematische Darstellung der verschiedenen Primordiumformen von P5 bis P7, die veranschaulicht, wie die Aderzahl und die Primordiumbreite in der mittleren Länge (horizontale gestrichelte Linie) je nach Entwicklungsstadium des Primordiums variieren können. (D,E) Messung der Primordiumbreite (D) und der Venenzahl (E) im mittleren Längenabschnitt des L4 von normal und vt2. Die Trendlinie stellt gleitende 10-mm-Durchschnittswerte der Messungen ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) dar. (F-I) Repräsentative konfokale Bilder von Querschnitten von Blattprimordien, die Kombinationen aus PIN1a-YFP, Auxin-Response-Reporter, DR5-RFP, Cytokinin-Response-Reporter, TCS-Tomate, Gibberellinsäure-responsivem Marker, GAR2-YFP und mDII-Venus, einer mutierten Version des Auxin-Signaleingangsreporters DII-Venus, exprimieren. Die FP-Kanäle werden in jedem Bild mit dem Hellfeldkanal überlagert. Maßstabsbalken = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Robil und McSteen24 modifiziert und reproduziert. Abkürzungen: DAG = Tage nach der Keimung; P = Plastochron; VT2 = verschwindende Quaste2; PCS = prokambialer Strang; YFP = gelb fluoreszierendes Protein; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; RFP = rot fluoreszierendes Protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Whole-Mount-Analyse von Maisblatt-Primordien Wir folgten Protokollabschnitt 3, um die FP-Expression in ganzblättrigen Mounts von Maisblattprimordien zu visualisieren und zu analysieren (Abbildung 5). Durch die Visualisierung von Venenmustern mit PIN1a-YFP fanden wir heraus, dass die Bildung von Venen im gesamten Primordium während früher Plastochronen auftritt, dieser Prozess jedoch später in der Entwicklung in den proximalen Regionen eingeschränkt wird (Abbildung 5A)24. Komplementär zu den Querschnittsanalysen haben die Ganzblattanalysen gewebe- und stadienspezifische Muster der Hormonantwort während der Venenbildung aufgezeigt24. Ein Beispiel ist das Expressionsmuster des CK-Antwortreporters TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomate) relativ zur PIN1a-YFP-Expression (Abbildung 5B)24. In Anlehnung an Protokollabschnitt 3 konnten wir sowohl qualitative als auch quantitative Analysen der FP-Expression in den Blattprimordien durchführen (Abbildung 5D-F; unveröffentlichte Daten). Wir untersuchten die Expressionsmuster eines Auxin-Antwort-Reporters, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), und eines GA-responsiven Markers, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), in Ganzblatt-Montierungen von Einzel- und Doppelmutanten von vt2 und Zwergpflanze3 (d3), einer GA-defizienten Mutante56 (Abbildung 5D). Wir verglichen auch das relative Ausmaß der Zellproliferation zwischen normalen und vt2-Blattprimordien mit pZm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP 42 (Cyclin-D2B-YFP), das ein Marker für den G1/S-Übergang im Zellzyklus 57 ist (Abbildung 5E,F). Während es keinen signifikanten Unterschied zwischen normal und vt2 gab, stimmte die Cyclin-D2B-YFP-Expression mit dem bekannten Zellproliferationsprofil der frühen Plastochronenüberein 31. Wir kommen zu dem Schluss, dass Protokollabschnitt 3 eine effektive Methode zur Analyse ganzer Mounts von Maisblattprimordien ist, die aufgrund ihrer gerollten Morphologie schwer abzubilden sind.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse für die Whole-Mount-Analyse von Maisblattprimordien. (A) Repräsentative Fluoreszenzbilder von Blattprimordien von 7 DAG-Maiskeimlingen, die sich entwickelnde Adern und prokambiale Stränge zeigen, die durch den Auxin-Efflux-Proteinmarker PIN1a-YFP markiert sind. P3-P6 Primordien wurden aus der Basis herausgeschnitten, abgerollt und mit der adaxialen Seite nach oben abgeflacht. Die Einschübe zeigen Nahaufnahmen von P3 und P4. In P5 und P6 markieren gestrichelte Linien das distale Ende der proliferativen Zonen, in denen sich die meisten prokambialen Stränge noch entwickeln und ausdehnen. (B,C) Repräsentative konfokale Bilder zeigen die Expression von PIN1a-YFP und Cytokinin-Response-Reporter, TCS-Tomato, in der proximalen Marginalregion eines P5-Primordiums. (D) Repräsentative Fluoreszenzbilder von P4-Primordia, die die Expression des Auxin-Antwort-Reporters DR5-RFP und des Gibberellinsäure-responsiven Markers GAR2-YFP in normalen und Einzel- und Doppelmutanten von verschwindenden Quasten2 und Zwergpflanzen3 zeigen. (E) Repräsentative konfokale Bilder von P3 und/oder P4, die die Expression von Cyclin-D2B-YFP, einem Reporter für den G1/S-Übergang im Zellzyklus, zeigen. (F) Relative Mengen der Zellproliferation in P3/P4-Blattprimordien von normal und vt2, quantifiziert durch Messung der integrierten Dichte des Cyclin-D2B-YFP-Signals über die Fläche des Primordiums mit ImageJ/FIJI. Die Balken stellen die Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts dar. Maßstabsbalken = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). Abbildung 4A-C wurde mit Genehmigung von Robil und McSteen24 modifiziert und reproduziert, während Abbildung 4D-F unveröffentlichte Daten der Autoren sind. Abkürzungen: DAG = Tage nach der Keimung; P = Plastochron; VT2 = Verschwindende Quaste2; D3 = Zwergpflanze3; YFP = gelb fluoreszierendes Protein; RFP = rot fluoreszierendes Protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = kein signifikanter Unterschied; au = beliebige Einheit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzungsdossier 1: Beispiele für Blattentwicklungsstadien bei Maiskeimlingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Pflanzenproben und Materialien, die in den Protokollen verwendet werden. (A,B) Ein Maissämling 7-8 DAG, bei dem der obere Blattquirl mit einer Abisolierzange entfernt wurde. (B) Der Einsatz zeigt eine Nahaufnahme des Triebes mit dem belichteten P6-Primordium. (C-G) Triebe von Maissämlingen, bei denen die oberen Quirle für die Querschnittsanalyse (C,D) und die umgebenden Blätter für die Analyse der gesamten Montage (E-G) vollständig entfernt wurden. (H) Eine Rolle Polyurethan-Gel-klares, doppelseitiges Nano-Klebeband. (I,J) P6-Blattprimordium (I) und proximaler Bereich des P8-Blattes (J) abgerollt und mit dem Nanoband auf Glasobjektträger montiert. (K) Ein Objektträger aus Glas mit einem abgerollten Blattprimordium, das auf dem Tisch eines Epifluoreszenzmikroskops montiert ist. Abkürzung: DAG = Tage nach der Keimung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging (Video) | JoVE 

Maisblatt-Primordien sind tief umhüllt und gerollt, was es schwierig macht, sie zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Herstellung von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung vor.

Verbesserte Methoden zur Präparation von Querschnitten und abgerollten ganzen Mounts von Maisblattprimordien für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Bei Gräsern wie Mais wachsen Blattprimordien innerhalb des Sprosses, was es schwierig macht, sie zu untersuchen. Wir adressieren dieses Problem mit verbesserten Protokollen zur Präparation von Maisblatt-Querschnitten und ganzen Montierungen für die Fluoreszenz- und konfokale Bildgebung. Das erste Protokoll verwendet eine Abisolierzange, um die älteren Blätter zu schneiden, was die Messung des Primordiums vor dem Schneiden ermöglicht.Das zweite Protokoll verwendet durchsichtiges, doppelseitiges Nanoklebeband, um das Primordium der ganzen Blätter abzurollen. Diese Protokolle verbessern die Genauigkeit der Querschnitte und ermöglichen das Abrollen der Blattprimordien, die aufgrund ihrer gerollten, konischen Morphologie nur sehr schwer zu erreichen waren. Diese Methoden werden nützlich sein, um anatomische und entwicklungsbedingte Blattmerkmale bei Mais und anderen Gräsern zu visualisieren und zu quantifizieren.Basierend auf diesen Methoden planen wir, Strategien zur Bildgebung lebender Zellen zu entwickeln, um Fragen der Grasblattentwicklung zu beantworten.