Name: Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-22T13:00:00
Duration: 1 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

लेखक मक्का जेनेटिक्स कोऑपरेशन, मक्का सेल जीनोमिक्स प्रोजेक्ट, डेव जैक्सन (कोल्ड स्प्रिंग हार्बर लेबोरेटरी, एनवाई), ऐनी डब्ल्यू सिल्वेस्टर (समुद्री जैविक प्रयोगशाला, शिकागो विश्वविद्यालय, आईएल), एंड्रिया गैलावोटी (रटगर्स विश्वविद्यालय, एनजे), और कैरोलिन जी रासमुसेन (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड) को उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक स्टॉक प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। मिसौरी-कोलंबिया कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए। जेएमआर को जे विलियम फुलब्राइट फैलोशिप, द डायने पी और रॉबर्ट ई शार्प फंड और नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्लांट जीनोम रिसर्च प्रोग्राम (आईओएस -1546873) द्वारा पीएम द्वारा समर्थित किया गया था। सीडीटीसी, ईडीसीडीपी और आरजेआरआर को डीओएसटी-एसईआई एस एंड टी अंडरग्रेजुएट स्कॉलरशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। डीओडीएल फादर थॉमस स्टीनबुगलर एसजे अकादमिक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है। आरजेआरआर को एडकेशन इंटरनेशनल-पाथवेज टू हायर एजुकेशन स्कॉलरशिप द्वारा समर्थित किया गया है। इस काम को स्कूल ऑफ साइंस एंड इंजीनियरिंग और रिजाल लाइब्रेरी, एटेनियो डी मनीला विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Improved Methods for Imaging Maize Leaf Primordia

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

हम सेलुलर इमेजिंग के लिए मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया तैयार करने के लिए दो तरीके प्रस्तुत करते हैं। पहली विधि (प्रोटोकॉल खंड 2) अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण के लिए प्रिमोडियम के माप की अनुमति देती है, जबकि दूसरी विधि (प्रोटोकॉल खंड 3) पूरे-माउंट विश्लेषण के लिए प्रिमोडियम के अनरोलिंग और चपटेपन को सक्षम बनाती है। ये विधियां मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया24 (जैसा कि चित्र 4 और चित्रा 5 में दिखाया गया है) में एफपी की सेलुलर इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती हैं और मक्का के पत्तों को विकसित करने की इमेजिंग की चुनौतियों के लिए सरल समाधान प्रदान करती हैं। प्रोटोकॉल खंड 2 विच्छेदन समय को कम करता है और केवल स्टेजिंग पैरामीटर9,16 पर निर्भर होने के बजाय सेक्शनिंग से पहले प्रिमोर्डिया को मापकर नमूना सटीकता में सुधार करता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नैनो टेप के साथ, प्रोटोकॉल खंड 3 मक्का में पूरे पत्ते के प्रिमोर्डिया की इमेजिंग की लंबे समय से चली आ रही समस्या को हल करता है। यह प्रोटोकॉल पिछली विधि पर सुधार करता है, जिसमें डायलिसिस ट्यूबिंग 31 का उपयोग किया गया था, और सीटी और एमआरआई11,32,33 का बहुत सस्ता विकल्प है। हालांकि, जब पत्ती शारीरिक लक्षणों को देखने और इष्टतम परिणाम उत्पन्न करने की बात आती है, तो दोनों प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं होती हैं, जिन्हें तालिका 2 में उल्लिखित किया गया है और नीचे अधिक विस्तार से चर्चा की गई है।
प्रोटोकॉल खंड 2 में, हमें पत्ती प्रिमोर्डिया के मोटे अनुप्रस्थ वर्गों में सेल की रूपरेखा को देखने में कठिनाई का सामना करना पड़ा, और सेल की दीवार- या प्लाज्मा झिल्ली-बाध्यकारी फ्लोरोसेंट रंगों के साथ काउंटरस्टेनिंग ने संतोषजनक परिणाम प्रदान नहीं किए। उदाहरण के लिए, एफएम 4-64 ने प्लाज्मा झिल्ली एफपी मार्कर की तुलना में उप-मानक परिणाम उत्पन्न किए, पी जेडएम पीआईपी 2-1::जेडएमपीआईपी 2-1: सीएफपी39 (पीआईपी 2-1-सीएफपी; चित्रा 3 ए-डी)। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम पतले ऊतक वर्गों (~ 0.1 मिमी)58 का उत्पादन करने के लिए एक वाइब्रेटोम का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो सेल की रूपरेखा की ज्वलंत उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग या काउंटरस्टेनिंग प्रोटोकॉल47,59 को अनुकूलित करने की अनुमति देगा।
प्रोटोकॉल खंड 3 में, मुख्य सीमा फाड़ने, क्षति, या हवा के बुलबुले के बिना पत्ती को ऊपर उठाने की कठिनाई है, जैसा कि प्रोटोकॉल चरण 3.2.5-3.2.6 (चित्रा 3 ई-के) में विस्तृत है। चूंकि मक्का का पत्ता द्विपक्षीय रूप से सममित होता है, इसलिए पूरे पत्ते वाले पर्वत के बजाय आधा पत्ती वाला पर्वत विज़ुअलाइज़ेशन9 के लिए पर्याप्त हो सकता है। ऐसा करने के लिए, प्राइमोडियम को अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ रेजर ब्लेड से काटा जा सकता है, इसे मिडरिब तक घुमाने के बाद, पत्ती के केवल आधे हिस्से को लगाया जा सकता है। प्रोटोकॉल खंड 3 की एक और सीमा यह है कि पत्ती की मोटाई गहरी इमेजिंग के दौरान फ्लोरोफोरे सिग्नल के ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन को सीमित कर सकती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, ऊतक समाशोधन तकनीक60 को नियोजित करना संभव है। हालांकि, हमने पाया कि ClearSee61, आमतौर पर पौधों के ऊतकों की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला समाशोधन अभिकर्मक, प्रोटोकॉल के साथ संगत नहीं है क्योंकि यह नमूना और कवरस्लिप को नैनो टेप से अलग करने का कारण बनता है। इस समस्या का एक संभावित समाधान पत्ती के नमूने पर एक अर्धपारगम्य झिल्ली31 लागू करना हो सकता है, जिससे इसे नैनो टेप द्वारा जगह पर रखते हुए समाशोधन समाधान के साथ इलाज किया जा सके। ऐसी विधि जो तरल समाधानों को अनरोल्ड पत्ती पर लागू करने की अनुमति देती है, का उपयोग सीटू संकरण और इम्यूनोलोकलाइजेशन तकनीकों में पूरे-माउंट आरएनए के लिए भी किया जा सकता है, जिन्हें पहले मक्का पुष्पक्रम विकसित करने के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन पूरे पत्ती प्रिमोर्डिया62,63 के लिए नहीं।
हमने मक्का के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया, जिसमें अंकुर चरण में भी बड़ी पत्ती प्रिमोर्डिया है। चावल, जौ, गेहूं, सेतारिया और ब्रैकीपोडियम 16,23,64,65,66 जैसे बहुत छोटे पत्ती प्रिमोर्डिया के साथ अन्य घास प्रजातियों को इन प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से लागू करने के लिए अतिरिक्त सटीक उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, ये प्रोटोकॉल लाइव सेल इमेजिंग के लिए अभिप्रेत नहीं थे, जो ऊतक गठन और सेलुलर प्रतिक्रियाओं की वास्तविक समय की गतिशील प्रक्रियाओं को कैप्चर करता है। हालांकि, जैसा कि फ्लोरोसेंट जांच, इमेजिंग प्रौद्योगिकियां और कंप्यूटिंग क्षमताएं पौधोंके लिए लाइव सेल इमेजिंग में आगे बढ़ रही हैं, भविष्य के शोध घास पत्ती प्रिमोर्डिया की अनूठी विशेषताओं के अनुरूप लाइव सेल इमेजिंग रणनीतियों को विकसित करने के लिए इन प्रोटोकॉल पर निर्माण कर सकते हैं।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

मक्का (ज़िया मेस) और अन्य घासों (पोएसी) में, पत्ती प्रिमोर्डिया को पत्ती के भीतर गहराई से घेरा और घुमाया जाता है, जिससे पत्ती के शुरुआती विकास का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। यहां, हम प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुप्रस्थ वर्गों और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट तैयार करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। पहली विधि पुरानी पत्तियों के ऊपरी हिस्सों को हटाने के लिए एक तार स्ट्रिपर का उपयोग करती है, पत्ती प्रिमोडियम की नोक को उजागर करती है और अधिक सटीक अनुप्रस्थ खंड नमूनाकरण के लिए इसके माप की अनुमति देती है। दूसरी विधि इमेजिंग के लिए पूरे पत्ती प्रिमोर्डिया को अनरोल और माउंट करने के लिए स्पष्ट, डबल-साइडेड नैनो टेप का उपयोग करती है। हम मक्का में फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं की कल्पना और विश्लेषण में दो तरीकों की उपयोगिता दिखाते हैं। ये विधियां मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया की विशिष्ट आकृति विज्ञान द्वारा प्रस्तुत चुनौतियों का समाधान प्रदान करती हैं और मक्का और अन्य घास प्रजातियों में पत्ती शारीरिक और विकासात्मक लक्षणों की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी होंगी।

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

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Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging (Video) | JoVE 

मक्के के पत्तों के प्रिमोर्डिया को गहराई से घेरा और लुढ़का जाता है, जिससे उनका अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। यहां, हम प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुप्रस्थ खंड तैयार करने और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट को अनरोल करने के तरीके प्रस्तुत करते हैं।

प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुप्रस्थ वर्गों और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट को अनरोल्ड करने के लिए बेहतर तरीके

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

मक्का जैसी घास में शूट के भीतर पत्ती प्रिमोर्डिया उगती है, जिससे उन्हें अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। हम इस समस्या को प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए मक्का पत्ती अनुप्रस्थ वर्गों और पूरे माउंट तैयार करने के लिए बेहतर प्रोटोकॉल के साथ संबोधित करते हैं। पहला प्रोटोकॉल पुरानी पत्तियों को काटने के लिए एक तार स्ट्रिपर का उपयोग करता है, जिससे सेक्शनिंग से पहले प्राइमोडियम की माप की अनुमति मिलती है।दूसरा प्रोटोकॉल पूरे लीफ प्रिमोडियम को अनरोल करने के लिए स्पष्ट, डबल-साइडेड नैनो टेप का उपयोग करता है। ये प्रोटोकॉल अनुप्रस्थ अनुभागण की सटीकता में सुधार करते हैं और पत्ती प्रिमोर्डिया के अनरोलिंग को सक्षम करते हैं, जो उनके रोल, शंक्वाकार आकृति विज्ञान के कारण प्राप्त करना बहुत मुश्किल है। ये विधियां मक्का और अन्य घासों में पत्ती शारीरिक और विकासात्मक लक्षणों को देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी होंगी।इन विधियों के आधार पर, हम घास पत्ती के विकास में सवालों को संबोधित करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग रणनीतियों को विकसित करने की योजना बना रहे हैं।