Name: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-04-14T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures at JoVE.com

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) en de International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. wordt momenteel ondersteund door een K08-subsidie van het National Eye Institute (EY033420). Er werden geen federale fondsen gebruikt voor HFT-onderzoek. Verdere steun komt van het James Grosfeld Initiative for Dry AMD en de volgende particuliere donoren: Barbara Dunn en Dee & Dickson Brown.

Het huidige protocol met betrekking tot de verwerving en het gebruik van menselijk weefsel werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Michigan (HUM00105486).
1. Bereiding van foto-geoxideerde buitenste segmentpunten en fragmenten
OPMERKING: Aan het donker aangepaste netvliezen van runderen werden gekocht en op ijs verzonden (zie materiaaltabel). Van deze netvliezen werden OS gezuiverd volgens een eerder g...

Quantifying Retinal Pigment Epithelial Phagocytosis and Lipofuscin Accumulation

Hoewel RPE lipofuscine al tientallen jaren wordt bestudeerd, wordt de toxiciteit ervan besproken 2,9,16,42. Gezien de onduidelijkheid over de toxiciteit van lipofuscine uit diermodellen11, zijn in vitro modellen met menselijke RPE waardevol. Een reeks in vitro lipofuscine accumulatiemodellen zijn beschreven, maar geen enkele heeft zowel OS-voeding als z...

Het retinale pigmentepitheel (RPE) biedt kritische ondersteuning voor bovenliggende fotoreceptoren, inclusief de dagelijkse opname en afbraak van fotoreceptor buitenste segmentpunten of fragmenten (in dit protocol staat de afkorting OS voor OS-tips of fragmenten in plaats van hele buitenste segmenten). Deze dagelijkse opname in de post-mitotische RPE overbelast uiteindelijk de fagolysosomale capaciteit en leidt tot de opbouw van onverteerbaar, autofluorescerend intracellulair materiaal, lipofuscine genaamd. Interessant is dat verschillende studies ook hebben aangetoond dat RPE-lipofuscine zich kan ophopen zonder OS-fagocytose 1,2. Lipofuscine heeft veel componenten, waaronder cross-linked adducten afgeleid van visuele cyclus retinoïden, en kan bijna 20% van het RPE-celvolume innemen voor mensen ouder dan 80 jaar3.
Of lipofuscine giftig is, is fel bediscussieerd. De ziekte van Stargardt is een autosomaal recessieve degeneratie van de fotoreceptoren en RPE waarbij een mutatie in ABCA4 een onjuiste verwerking van visuele cyclus retinoïden in de buitenste segmenten van de fotoreceptor veroorzaakt. Onjuiste retinoïde verwerking leidt tot afwijkende cross-linking en vorming van bis-retinoïde soorten, waaronder de bis-retinoïde N-retinylideen-N-retinylethanolamine (A2E). Studies hebben meerdere mechanismen voor A2E-toxiciteit 4,5 aangetoond. Lipofuscine draagt bij aan fundus autofluorescentiesignalen tijdens klinische beeldvorming, en zowel de patiënten van Stargardt als de diermodellen vertonen een verhoogde fundus autofluorescentie voorafgaand aan retinale degeneratie, wat een correlatie suggereert tussen lipofuscinespiegels en toxiciteit 6,7. Met de leeftijd hoopt lipofuscine zich echter op bij alle mensen zonder een RPE-degeneratie te veroorzaken. Verder, in leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), waar RPE-degeneratie alleen voorkomt bij oudere patiënten, hebben degenen met vroege en intermediaire vormen van de ziekte minder fundus autofluorescentiesignalen dan leeftijdsgematchte niet-zieke mensen8. Deze klinische bevindingen zijn geverifieerd op histologisch niveauen 9,10.
Diermodellen van RPE lipofuscine accumulatie hebben ook enige onduidelijkheid over lipofuscine toxiciteit gelaten. De ABCA4 knock-out muis geeft geen retinale degeneratie weer op een gepigmenteerde achtergrond, terwijl dit wel het geval is op een albino achtergrond of bij blootstelling aan blauw licht11,12. Verder verschilt de toxiciteit van lipofuscine afgeleid via ABCA4 knock-out waarschijnlijk van de langzamer accumulerende lipofuscine die optreedt bij natuurlijke veroudering, zoals gezien in AMD13.
In vitro modellen van lipofuscine accumulatie bieden een alternatief voor het bestuderen van de effecten van lipofuscine accumulatie op RPE gezondheid. Dergelijke modellen maken het mogelijk om lipofuscinecomponenten te manipuleren, van het voeden van enkele retinoïde componenten tot het voeden van OS, en maken onderzoek mogelijk in menselijke in plaats van dierlijke RPE. In de afgelopen decennia zijn er meerdere methoden ontwikkeld om RPE lipofuscine in cultuur te modelleren. Samen met andere groepen voedde de groep van Dr. Boulton dagelijks runder-OS gedurende maximaal drie maanden op passage 4 tot 7 menselijke primaire RPE-cellen van donoren van 4 tot 85 jaar oud14. Als alternatief heeft remming van autofagie ook geleid tot lipofuscineaccumulatie in passages 3 tot 7 primaire menselijke RPE-culturen15. Subletale lysosomale remming in sterk gedifferentieerde, passage 1, primaire humane prenatale RPE (hfRPE) culturen slaagde er echter niet in lipofuscine te induceren, zelfs niet met de herhaalde toevoeging van OS op dagelijkse basis16.
Als een meer reductionistische benadering hebben anderen enkele lipofuscinecomponenten aan culturen gevoerd, met name de bis-retinoïde A2E 4,17. Dergelijke studies zijn waardevol omdat ze potentiële directe mechanismen van toxiciteit voor individuele lipofuscinecomponenten definiëren, die bijvoorbeeld lysosomale cholesterol en ceramidehomeostase impliceren18. Tegelijkertijd is er discussie over de toxiciteit van A2E19, en het rechtstreeks aan cellen voeren omzeilt de typische route voor lipofuscine-accumulatie, waarbij fagocytose van fotoreceptor OS betrokken is. In een poging om alle componenten van lipofuscine aan RPE-culturen te leveren, zuiverden Boulton en Marshall lipofuscine uit menselijke ogen en voedden dit aan passage 4 tot 7 menselijke primaire RPE-culturen afgeleid van zowel foetale als oudere menselijke donoren20. Hoewel innovatief, vertegenwoordigt deze methode een beperkte lipofuscinebron voor herhaalde experimenten.
Hoewel herhaalde voedingen van OS aan RPE-culturen lipofuscine produceren in veel systemen, lukt dit niet in sterk gedifferentieerde primaire RPE-culturen16. Foto-oxiderend OS induceert cross-linking reacties zoals bis-retinoïde vorming die van nature optreedt tijdens lipofuscinevorming in vivo. Dit kan de vorming van lipofuscine-achtige korrels in RPE-kweeksystemen versnellen, zelfs die welke sterk gedifferentieerd zijn en resistent zijn tegen lipofuscine-accumulatie16. Hier wordt een methode geïntroduceerd om lipofuscine-achtige korrelaccumulatie te induceren in sterk gedifferentieerde hfRPE en menselijke iPSC-RPE, aangepast van Wihlmark's gepubliceerde protocol21. Deze methode heeft het voordeel dat lipofuscine-achtige korrels worden geïnduceerd die dezelfde bron (fotoreceptor OS) en route (fagolysosomale OS-opname) gebruiken als voor lipofuscinogenese in vivo. Verder wordt het gedaan op menselijke RPE-culturen die sterk gedifferentieerd en gevalideerd zijn in meerdere studies om menselijke RPE in vivo te repliceren 22,23,24. Deze lipofuscine-achtige korrels worden onverteerbaar autofluorescent materiaal (UAM) genoemd en bieden gegevens en discussie in dit protocol waarin UAM wordt vergeleken met in vivo lipofuscine. Samen met methoden voor het bouwen en evalueren van met UAM beladen culturen in sterk gedifferentieerde menselijke RPE, wordt ook een bijgewerkte methode geïntroduceerd om RPE OS-fagocytose te beoordelen. Er zijn meerdere uitstekende puls-chase methoden geïntroduceerd voor het kwantificeren van OS fagocytose, waaronder Western blotting, immunocytochemie en FACS25,26,27. Vroeg in de OS-puls-chase kunnen omstandigheden die leiden tot een slechte os-opname echter worden samengevoegd met omstandigheden die een snelle degradatie van geïnternaliseerd besturingssysteem bevorderen. De hier gepresenteerde methode meet de totale hoeveelheid geïntroduceerd besturingssysteem die volledig wordt verbruikt / afgebroken door de RPE ("Total Consumptive Capacity"), waardoor deze ambiguïteit wordt geëlimineerd. Er wordt verwacht dat inzichten over lipofuscinetoxiciteit met behulp van deze protocollen, inclusief effecten op OS-fagocytosesnelheden met behulp van de "Total Consumptive Capacity" -methode, zullen worden gebruikt om licht te werpen op de toxiciteit van lipofuscine in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353003</td>
			<td>Others also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Transwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-LC3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4801S</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 1D4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#5417</td>
			<td>1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rhodopsin antibody 4D2</td>
			<td>EnCor Biotech</td>
			<td>MCA-B630</td>
			<td>1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#23007</td>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autofluorescence quencher</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td>Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy 493/503</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol esterase&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>From A12216 kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Stellaris SP8 with FALCON module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-adapted bovine retinas</td>
			<td>W. L. Lawson Company</td>
			<td>Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)</td>
			<td>Contact information: 
			https://wllawsoncompany.com/ 
			(402) 499-3161 
			stacy@wllawsoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Attune NxT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analysis software&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld UV light&#160;</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVGL-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MFG-E8</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>10853-H08B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human purified Protein S</td>
			<td>Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>J60015-AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>J2380</td>
			<td>LDH-Glo Cytotoxicity Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#72485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene-coated slides</td>
			<td>Tekdon</td>
			<td>Customized</td>
			<td>Customized specifications: PTFE mask with the following &#34;cut-outs&#34; -&#160; 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000122 RC DC protein assay</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrode</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet crosslinker device</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td>UVP CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved lipofuscin models and quantification of outer segment phagocytosis capacity in highly polarized human retinal pigment epithelial cultures

De dagelijkse fagocytose van fotoreceptor buitenste segmenten door het retinale pigmentepitheel (RPE) draagt bij aan de accumulatie van een intracellulair verouderingspigment genaamd lipofuscine. De toxiciteit van lipofuscine is goed ingeburgerd bij de ziekte van Stargardt, de meest voorkomende erfelijke retinale degeneratie, maar is meer controversieel bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid in de ontwikkelde wereld. Het bepalen van lipofuscine toxiciteit bij mensen is moeilijk geweest, en diermodellen van Stargardt's hebben beperkte toxiciteit. In vitro modellen die menselijke RPE in vivo nabootsen, zijn dus nodig om de generatie, klaring en toxiciteit van lipofuscine beter te begrijpen. De meeste celkweek-lipofuscinemodellen tot nu toe waren in cellijnen of hadden betrekking op het voeden van RPE met een enkel onderdeel van het complexe lipofuscinemengsel in plaats van fragmenten / tips van het hele buitenste segment van de fotoreceptor, wat een completer en fysiologischer lipofuscinemodel genereert. Hier wordt een methode beschreven om de accumulatie van lipofuscine-achtig materiaal (onverteerbaar autofluorescentiemateriaal of UAM genoemd) te induceren in sterk gedifferentieerde primaire menselijke prenatale RPE (hfRPE) en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) afgeleide RPE. UAM geaccumuleerd in culturen door herhaalde voedingen van met ultraviolet licht behandelde OS-fragmenten die door de RPE via fagocytose worden opgenomen. De belangrijkste manieren waarop UAM in vivo lipofuscine benadert en verschilt, worden ook besproken. Bij dit model van lipofuscine-achtige accumulatie worden beeldvormingsmethoden geïntroduceerd om het brede autofluorescentiespectrum van UAM-korrels te onderscheiden van gelijktijdige antilichaamkleuring. Ten slotte is, om de impact van UAM op de RPE-fagocytosecapaciteit te beoordelen, een nieuwe methode geïntroduceerd voor het kwantificeren van de opname en afbraak van fragmenten in het buitenste segment/tips. Deze methode, die "Total Consumptive Capacity" wordt genoemd, overwint mogelijke verkeerde interpretaties van RPE-fagocytosecapaciteit die inherent zijn aan klassieke "pulse-chase" -testen in het buitenste segment. De hier geïntroduceerde modellen en technieken kunnen worden gebruikt om lipofuscinegeneratie- en klaringsroutes en vermeende toxiciteit te bestuderen.

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

De set-up voor foto-oxidatie van OS wordt gedemonstreerd in figuur 1Ai. De met polytetrafluorethyleen gecoate dia's maken het mogelijk om een groot volume OS in oplossing per open rechthoek te laden zonder zich over de rest van de dia te verspreiden. De plaat met OS bevindt zich in een steriele petrischaal met het deksel eraf en een UV-lamp wordt over de dia geplaatst zoals weergegeven in figuur 1Aii. Als alternatief kan de dia in een UV Crosslinker-apparaat wor...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures at JoVE.com

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures (Video) | JoVE 

Dit protocol beschrijft een lipofuscine accumulatiemodel in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheel (RPE) culturen en een verbeterde buitensegment (OS) fagocytosetest om het totale OS-verbruik / degradatievermogen van de RPE te detecteren. Deze methoden overwinnen de beperkingen van eerdere lipofuscinemodellen en klassieke pulse-chase buitenste segment fagocytose-assays.

Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

Hoewel lipofuscine zich universeel ophoopt in de RPE met veroudering, is het moeilijk geweest om de toxiciteit ervan te onderscheiden. Hier ontwikkelen we protocollen waarmee we lipofuscine-achtige accumulatie kunnen ontwikkelen in sterk gepolariseerde en volwassen RPE-culturen om de effecten van lipofuscine op de RPE-fysiologie te helpen onderscheiden. Het bestuderen van lipofuscine toxiciteit bij mensen wordt verward door het feit dat lipofuscine afneemt als de RPE sterft.Diermodellen van lipofuscine toxiciteit hebben zeer uiteenlopende resultaten gehad. We hebben zorgvuldig in vitro modellen van lipofuscine-achtige materiaalaccumulatie gemaakt om de studie van lipofuscinetoxiciteit te vergemakkelijken. De sleutel tot het succes van onze modellen is het handhaven van sterk gedifferentieerde culturen terwijl lipofuscinegenese wordt geïnduceerd via hetzelfde proces dat lipofuscine in vivo veroorzaakt, namelijk fagocytose van fotoreceptor buitensegmenten.Ons in vitro protocol is uniek omdat lipofuscine-achtig materiaal zich ophoopt in RPE-culturen die sterk gedifferentieerd zijn om RPE in vivo getrouw na te bootsen. In deze omstandigheden vonden we dat RPE-cultuur zeer resistent is tegen de accumulatie van lipofuscine en tegen het toxische effect van lipofuscine. Bovendien, in het proces van testen op fenotypes geïnduceerd door lipofuscine-achtige accumulatie in onze RPE-culturen, creëerden we een nieuw type fagocytosetest genaamd totale consumptieve capaciteit.Deze test stelt ons in staat om de volledige capaciteit van de RPE te bepalen om buitenste segmenten te fagocyteren, terwijl we enkele van de verwarrende interpretaties vermijden die gepaard gaan met klassieke puls-chase fagocytose-assays. We zijn verheugd om dit model van lipofuscine-achtige materiaalaccumulatie te gebruiken om beter te begrijpen welke RPE-stressoren normaal inerte lipofuscine in een meer pathologische rol kunnen brengen bij RPE-celsterfte.