Name: Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator at JoVE.com

Авторы выражают благодарность Такахито Вада и Сайко Йошида (Токийский университет, Токио, Япония) за экспериментальную помощь. Эта работа финансировалась за счет следующих грантов Y.H.: исследовательский грант от Программы отличных молодых исследователей Токийского университета; Грант Японского общества содействия развитию науки (JSPS) KAKENHI для начинающих ученых, грант No 19K17976; грант для Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) от Японского фонда прикладной энзимологии, грант No 17F005; грант Фонда фармакологических исследований; грант Мемориального фонда медицинских и фармацевтических исследований Мочиды; грант MSD Life Science Foundation; грант от Daiwa Securities Health Foundation; грант Токийского фонда биохимических исследований; Грант на исследования в области наук о жизни от Научного фонда Такеда; и грант Фонда медицинских исследований SENSSHIN.

Все эксперименты на животных, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Токийского университета и выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами Токийского университета.
<s...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha:+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance.">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue.">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li><li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology:+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis.">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+obesity:+from+discovery+to+biology.">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li><li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene.">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li><li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI:+The+Taiwan+biobank+study.">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20,000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study.">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).</li><li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans.">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li><li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2,+a+lipid-activated+transcription+factor.">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16.">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM16+controls+a+brown+fat/skeletal+muscle+switch.">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li><li>Rajakumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+determines+and+maintains+brown+adipocyte+identity.">EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity.</a> Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).</li><li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex.">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+co-localizes+with+PPAR&#947;+and+transcriptionally+controls+the+brown+fat+gene+program.">NFIA co-localizes with PPAR&#947; and transcriptionally controls the brown fat gene program.</a> Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation.">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes.">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729 (2022).</li><li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR&#947;+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs.">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPAR&#947; specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li><li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism.">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li><li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+maintains+white+adipocyte+identity+through+suppression+of+the+beige+cell+thermogenic+gene+program.">Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid.">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion.">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells.">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice.">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).</li><li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+a+simple,+reproducible,+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate.">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li><li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications.">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li><li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plat-E:+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses.">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li><li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis.">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li><li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation.">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li></ol>

Здесь мы описали протокол выделения SVF из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и выполнения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для переваривания коллагеназы уменьшило экспериментальные вариации, снизило риск загрязнения и повысило ...

Биология жировой ткани привлекает все большее внимание из-за растущей распространенности ожирения и диабета 2 типа во всем мире1. Адипоциты хранят избыточную энергию в виде липидных капель, которые высвобождаются при голодании. Кроме того, жировая ткань поддерживает системный энергетический гомеостаз, выступая в качестве эндокринного органа и сообщаясь с другими тканями 2,3. Интересно, что как избыток жировой ткани (ожирение), так и потеря жира (липодистрофия) связаны с резистентностью к инсулину и диабетом1. Адипоциты делятся на три типа: белые, коричневые и бежевые1. Белые адипоциты в основном хранят избыточную энергию в виде липидов, тогда как коричневые и бежевые адипоциты рассеивают энергию в виде тепла через митохондриальный разъединяющий белок-1 (Ucp1)1,4. Примечательно, что бежевые адипоциты (также называемые «индуцируемыми» коричневыми адипоцитами) появляются в белой жировой ткани в ответ на холодную или симпатическую стимуляцию и демонстрируют паттерны экспрессии генов, которые перекрываются, но отличаются от таковых у «классических» коричневых адипоцитов5. В последнее время коричневые и бежевые адипоциты стали потенциальными мишенями для лечения ожирения и диабета, направленного на «усиление рассеивания энергии», а не на «подавление потребления энергии»4. Кроме того, сообщается, что аллель риска варианта ожирения FTO rs1421085 у людей, который демонстрирует самую сильную связь с более высоким индексом массы тела (ИМТ) среди распространенных вариантов6,7 и демонстрирует различные взаимодействия генов и окружающей среды8,9, отрицательно регулирует дифференцировку и функцию бежевых адипоцитов10. Рецептор γ, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ), известен как главный транскрипционный регулятор адипогенеза и необходим и достаточен для дифференцировки адипоцитов11. Регуляторы транскрипции, такие как гомологичный домен PRD1-BF1-RIZ1, содержащий 16 (PRDM16), ранний фактор В-клеток 2 (EBF2) и ядерный фактор I-A (NFIA), имеют решающее значение для дифференцировки и функции адипоцитов коричневого и бежевого цвета 12,13,14,15,16,17,18. С другой стороны, программирование генов белых адипоцитов требует регуляторов транскрипции, таких как трансдуциноподобный энхансерный белок 3 (TLE3) и белок цинкового пальца 423 (ZFP423)19,20,21.
Модельные системы in vitro позволяют проводить молекулярные исследования, направленные на улучшение понимания механизма (механизмов), лежащего в основе функций и дисфункций адипоцитов. Хотя существуют общедоступные и иммортализированные клеточные линии преадипоцитов, такие как 3T3-L1 и 3T3-F442A22,23,24, культура первичных преадипоцитов и дифференцировка в адипоциты были бы более подходящей моделью для изучения адипогенеза in vivo. Выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) из жировой ткани мышей является известным методом получения первичных преадипоцитов25,26. Однако коллагеназное расщепление жировой ткани, которое обычно выполняется с помощью бактериального шейкера с трубчатой стойкой, может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению27,28. Здесь мы описываем альтернативный протокол, в котором используется мягкий диссоциатор тканей с магнитно-активированной клеточной сортировкой (MACS) для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-105-808</td>
			<td>contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen coated dishes, 100 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>#356450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen coated dishes, 60 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>#354401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Coat Microplate 6 well</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>4810-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Wako</td>
			<td>041-18861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, blunt/sharp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, sharp/sharp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Milteny Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACSOcto Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R Injection U-100</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>872492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>146-08871&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td>
			<td>Add gene</td>
			<td>#1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>cell biolab</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12996-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Sybr Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>#FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Wako</td>
			<td>180-02653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2877-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated isolation of the stromal vascular fraction from murine white adipose tissue using a tissue dissociator

Исследование дифференцировки белых, коричневых и бежевых адипоцитов in vitro позволяет исследовать клеточно-автономные функции адипоцитов и их механизмы. Иммортализированные белые клеточные линии преадипоцитов находятся в открытом доступе и широко используются. Тем не менее, появление бежевых адипоцитов в белой жировой ткани в ответ на внешние сигналы трудно повторить в полной мере с использованием общедоступных клеточных линий белых адипоцитов. Выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши обычно выполняется для получения первичных преадипоцитов и дифференцировки адипоцитов. Однако измельчение и переваривание жировой ткани коллагеназой вручную может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению. Здесь мы представляем модифицированный полуавтоматический протокол, в котором используется тканевый диссоциатор для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF с целью уменьшения экспериментальных вариаций, уменьшения загрязнения и повышения воспроизводимости. Полученные преадипоциты и дифференцированные адипоциты могут быть использованы для функционального и механистического анализа.

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Этот протокол дает полностью дифференцированные, насыщенные липидами адипоциты через 7 дней после индуцирования дифференцировки адипоцитов. Степень дифференцировки адипоцитов можно оценить с помощью окрашивания триглицеридов и липидов масляным красным цветом (рис. 1А</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator at JoVE.com

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Этот протокол описывает полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и достижения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для расщепления коллагеназы уменьшает экспериментальную изменчивость и повышает воспроизводимость.

Полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции из белой жировой ткани мыши с помощью тканевого диссоциатора

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Нас интересуют коричневый и бежевый подтипы адипоцитов, которые рассеивают энергию в виде тепла, в то время как белые адипоциты обычно накапливают энергию, поскольку наша цель - разработать новое лечение ожирения и диабета, основанное на стимулировании расхода энергии, а не на подавлении потребления энергии. Мы идентифицировали транскрипционный фактор, NFI, как критический регулятор дифференцировки коричневых адипоцитов с помощью полногеномного открытого хроматинового анализа. NFI и главный транскрипционный регулятор адипогенеза, PPAR-гамма, локализуются как специфические для бурого жира энхансеры.В процессе выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани мыши ручное измельчение и коллагеназное переваривание жировой ткани может привести к экспериментальной изменчивости и контаминации. В нашем методе используется тканевый диссоциатор для расщепления коллагеназы, который облегчает выделение SVF, снижает экспериментальную изменчивость и контаминацию, а также улучшает воспроизводимость. Эксперименты с использованием индивидуально-дифференцированных адипоцитов незаменимы для исследований в нашей области.Наш протокол обеспечит простое и воспроизводимое выделение SVF для последующей дифференцировки адипоцитов и ускорит исследования в нашем сообществе. В настоящее время мы исследуем роль NFI в метаболизме всего тела, таком как масса тела и глюкоза, используя модели мышей с усилением и потерей функций. В ближайшем будущем мы также изучим другие фармакологические активации NFI для каждого последующего пути.