Name: Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00
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Los autores desean agradecer a Takahito Wada y Saiko Yoshida (Universidad de Tokio, Tokio, Japón) por su asistencia experimental. Este trabajo fue financiado por las siguientes subvenciones a Y.H.: beca de investigación del Programa de Jóvenes Investigadores Excelentes de la Universidad de Tokio; Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, número de subvención 19K17976; subvención para el Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) de la Fundación Japonesa de Enzimología Aplicada, número de subvención 17F005; beca de la Fundación de Investigación Farmacológica; beca de la Fundación Memorial Mochida para la Investigación Médica y Farmacéutica; beca de la Fundación MSD Life Science; subvención de la Daiwa Securities Health Foundation; subvención de la Fundación de Investigación Bioquímica de Tokio; Beca de Investigación en Ciencias de la Vida de la Fundación Takeda Science; y subvención de la Fundación de Investigación Médica SENSHIN.

Todos los experimentos con animales descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tokio y realizados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Tokio.
1. Preparación de la solución enzimática y el medio
<ol><li>Coloque ambos lados del tejido adiposo blanco inguinal (lado derecho e izquierdo, aproximadamente 150 mg) de un ratón de 7-8 semanas de edad y 2,5 ml de ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha:+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance.">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue.">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li><li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology:+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis.">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+obesity:+from+discovery+to+biology.">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li><li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene.">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li><li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI:+The+Taiwan+biobank+study.">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20,000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study.">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).</li><li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans.">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li><li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2,+a+lipid-activated+transcription+factor.">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16.">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM16+controls+a+brown+fat/skeletal+muscle+switch.">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li><li>Rajakumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+determines+and+maintains+brown+adipocyte+identity.">EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity.</a> Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).</li><li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex.">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+co-localizes+with+PPAR&#947;+and+transcriptionally+controls+the+brown+fat+gene+program.">NFIA co-localizes with PPAR&#947; and transcriptionally controls the brown fat gene program.</a> Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation.">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).</li><li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes.">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729 (2022).</li><li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR&#947;+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs.">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPAR&#947; specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li><li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism.">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li><li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+maintains+white+adipocyte+identity+through+suppression+of+the+beige+cell+thermogenic+gene+program.">Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid.">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion.">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li><li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells.">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice.">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).</li><li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture:+a+simple,+reproducible,+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate.">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li><li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications.">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li><li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plat-E:+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses.">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li><li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis.">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li><li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation.">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li></ol>

Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de la SVF del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y realizar la diferenciación de adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de colagenasa disminuyó la variación experimental, disminuyó el riesgo de contaminación y aumentó la reproducibilidad. Si bien este procedimiento es un paso crítico dentro del protocolo presentado, el proceso está altamente automatizado y no se necesita optimización. Sin embargo, depen...

La biología del tejido adiposo ha estado atrayendo una atención cada vez mayor debido a la creciente prevalencia de obesidad y diabetes tipo 2 a nivel mundial1. Los adipocitos almacenan el exceso de energía en forma de gotas de lípidos, que se liberan al morir de hambre. Además, el tejido adiposo mantiene la homeostasis energética sistémica al servir como órgano endocrino y comunicarse con otros tejidos 2,3. Curiosamente, tanto el exceso de tejido adiposo (obesidad) como la pérdida adiposa (lipodistrofia) están relacionados con la resistencia a la insulina y la diabetes1. Los adipocitos se dividen en tres tipos: blanco, marrón y beige1. Los adipocitos blancos almacenan principalmente el exceso de energía como lípidos, mientras que los adipocitos marrones y beige disipan la energía en forma de calor a través de la proteína 1 de desacoplamiento mitocondrial (Ucp1)1,4. En particular, los adipocitos beige (también llamados adipocitos marrones "inducibles") aparecen en el tejido adiposo blanco en respuesta a la estimulación fría o simpática y exhiben patrones de expresión génica que se superponen pero son distintos de los de los adipocitos marrones "clásicos"5. Recientemente, se ha anticipado que los adipocitos marrones y beige son objetivos potenciales de tratamientos contra la obesidad y la diabetes destinados a "mejorar la disipación de energía" en lugar de "suprimir la ingesta de energía"4. De manera favorable, se informa que el alelo de riesgo de la variante de obesidad FTO rs1421085 en humanos, que exhibe la asociación más fuerte con un mayor índice de masa corporal (IMC) entre las variantes comunes 6,7 y exhibe varias interacciones gen-ambiente8,9, regula negativamente la diferenciación y función de los adipocitos beige10. El γ del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPARγ) es conocido como un regulador transcripcional maestro de la adipogénesis y es necesario y suficiente para la diferenciación de los adipocitos11. Los reguladores transcripcionales, como el dominio homólogo PRD1-BF1-RIZ1 que contiene 16 (PRDM16), el factor 2 de células b tempranas (EBF2) y el factor nuclear I-A (NFIA), son cruciales para la diferenciación y función de los adipocitos marrones y beige 12,13,14,15,16,17,18 . Por otro lado, la programación génica del adipocitos blancos requiere reguladores transcripcionales, como la proteína potenciadora similar a la transducina 3 (TLE3) y la proteína 423 del dedo de zinc (ZFP423)19,20,21.
Los sistemas modelo in vitro permiten realizar estudios moleculares que tienen como objetivo mejorar la comprensión de los mecanismos subyacentes a las funciones y disfunciones de los adipocitos. Aunque existen líneas celulares de preadipocitos inmortalizadas y disponibles públicamente como 3T3-L1 y 3T3-F442A22,23,24, el cultivo de preadipocitos primarios y la diferenciación en adipocitos sería un modelo más adecuado para estudiar la adipogénesis in vivo. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino es un método bien conocido para la obtención de preadipocitos primarios25,26. Sin embargo, la digestión de la colagenasa del tejido adiposo, que se realiza comúnmente utilizando un agitador bacteriano con un bastidor tubular, puede resultar en una variación experimental y es propensa a la contaminación27,28. Aquí, describimos un protocolo alternativo que utiliza un disociador de tejido suave de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) para la digestión de la colagenasa para lograr un aislamiento más fácil de la SVF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3010-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-105-808</td>
			<td>contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen coated dishes, 100 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>#356450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen coated dishes, 60 mm</td>
			<td>BD</td>
			<td>#354401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Coat Microplate 6 well</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>4810-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Wako</td>
			<td>041-18861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, blunt/sharp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors, sharp/sharp</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Milteny Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACSOcto Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R Injection U-100</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>872492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin Sulfate</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>146-08871&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td>
			<td>Add gene</td>
			<td>#1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td>
			<td>cell biolab</td>
			<td>RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>12996-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Sybr Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>#FSQ-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Wako</td>
			<td>180-02653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2877-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated isolation of the stromal vascular fraction from murine white adipose tissue using a tissue dissociator

El estudio in vitro de la diferenciación de adipocitos blancos, marrones y beige permite la investigación de las funciones autónomas celulares de los adipocitos y sus mecanismos. Las líneas celulares de preadipocitos blancos inmortalizados están disponibles públicamente y se usan ampliamente. Sin embargo, la aparición de adipocitos beige en el tejido adiposo blanco en respuesta a señales externas es difícil de recapitular en toda su extensión utilizando líneas celulares de adipocitos blancos disponibles públicamente. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino se ejecuta comúnmente para obtener preadipocitos primarios y realizar la diferenciación de adipocitos. Sin embargo, la picada y la digestión de la colagenasa del tejido adiposo a mano pueden dar lugar a variaciones experimentales y son propensas a la contaminación. Aquí, presentamos un protocolo semiautomatizado modificado que utiliza un disociador de tejido para la digestión de colagenasa para lograr un aislamiento más fácil del SVF, con el objetivo de reducir la variación experimental, reducir la contaminación y aumentar la reproducibilidad. Los preadipocitos obtenidos y los adipocitos diferenciados pueden ser utilizados para análisis funcionales y mecanicistas.

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Este protocolo produce adipocitos completamente diferenciados y cargados de lípidos 7 días después de inducir la diferenciación de los adipocitos. El grado de diferenciación de los adipocitos puede evaluarse mediante la tinción de triglicéridos y lípidos (Figura 1A), o el análisis de expresión de ARNm mediante qPCR-RT de genes adipocitos, como el regulador maestro de la adipogénesis Pparg y su diana Fabp4 (Figura 1B). Para inducir la...

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Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Estamos interesados en los subtipos marrones y beige de adipocito que disipan la energía en forma de calor, mientras que el adipocito blanco generalmente almacena energía como Nuestro objetivo es desarrollar un nuevo tratamiento para la obesidad y la diabetes basado en la promoción del gasto energético, en lugar de la supresión de la ingesta de energía. Hemos identificado un factor de transcripción, NFI, como un regulador crítico de la diferenciación de adipocitos marrones mediante un análisis de cromatina abierta de todo el genoma. NFI y el regulador transcripcional maestro de la adipogénesis, PPAR-gamma, se co-localizan como los potenciadores específicos de la grasa marrón.En el proceso de aislamiento de la fracción vascular estromal del tejido adiposo del ratón, la picada manual y la digestión de la colagenasa del tejido adiposo pueden conducir a la variabilidad experimental y la contaminación. Nuestro método utiliza un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa, que facilita el aislamiento de SVF, reduce la variabilidad experimental y la contaminación, y mejora la reproducibilidad. Los experimentos con adipocito individualmente diferenciados son indispensables para la investigación en nuestro campo.Nuestro protocolo ofrecería un aislamiento de SVF fácil y reproducible para la posterior diferenciación de adipocitos y aceleraría la investigación en nuestra comunidad. Actualmente, estamos investigando el papel de la NFI del metabolismo de todo el cuerpo, como el peso corporal y la glucosa, utilizando modelos de ratón de ganancia y pérdida de función. También exploraremos otras activaciones farmacológicas de NFI para cada vía descendente en un futuro próximo.