Name: A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:05:00
Duration: 1 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par des bourses d’études supérieures de l’Université de Bath (Université de Bath, Bath, Royaume-Uni, BA2 7AY) à Y.-L.L. et L.W. Figure 1 a été créé avec BioRender.com (https://biorender.com/).

1. Croissance des plantes et préparation des fleurs
<ol><li>Stratifier les graines d’A. thaliana dans de l’agarose à 0,1 % ou de l’eau stérile pendant 3 jours à 4 °C, ou sous forme de graines sèches pendant 16-24 h à -20 °C (uNASC, communication personnelle).</li>
	<li>Transférer les graines stratifiées dans des pots de compost et les placer dans une chambre de croissance à environnement contrôlé. Propager les plantes avec une photopériode claire:foncée de 16:8 h fournie par des tubes fluorescents (130 μmol m-2 s-1). Maintenez la température à 21 ± 2 °C avec environ 40 % d’humidité relative.</li>
	<li>S’assurer que les plantes donneuses et réceptrices de pollen, ainsi que toute autre lignée de plantes « témoins » appropriée, sont semées ensemble pour assurer une floraison synchrone. Multipliez les plantes pendant environ 6 semaines jusqu’à ce que les inflorescences soient bien établies.</li>
	<li>Sélectionnez les boutons floraux de stade 12 sur la plante réceptrice de pollen 1 jour avant la réalisation du test biologique pour l’émasculation 16,17-ce sont des boutons floraux non ouverts qui compléteront l’ouverture de la fleur et la déhiscence de l’anthère le lendemain 18. REMARQUE: Évitez les trois premières fleurs produites sur l’inflorescence principale, car elles présentent généralement un comportement reproducteur inhabituel. Si l’étude est disponible et appropriée pour l’étude, utiliser une lignée de plantes stériles mâles, comme la lignée de A. thaliana (accession Col-0) pA9-barnase, où les anthères ne parviennent pas à maturité19.</li>
	<li>Pour émasculer les fleurs du receveur de pollen, placez la plante, dans son pot, sur le côté. Collez la tige de la plante, dans la région proche des fleurs qui seront émasculées, sur une lame de verre qui est en position sous un microscope à dissection stéréo.</li>
	<li>À l’aide d’une paire de pinces à pointe fine, ouvrez soigneusement le bouton floral et retirez tous les pétales et anthères des fleurs. Assurez-vous que le pistil n’est pas endommagé et que le stigmate est exempt de pollen contaminant. REMARQUE: Les lignées de plantes stériles mâles ne nécessitent pas d’émasculation.</li>
	<li>Remettez les plantes dans la chambre de croissance et assurez-vous que les fleurs émasculées n’entrent pas en contact avec d’autres plantes ou des corps étrangers.</li>
</ol>2. Dosage de l’hydratation du pollen - acquisition de données brutes
<ol><li>Le lendemain matin, retirez les plantes de la chambre de croissance. Posez la plante réceptrice de pollen sur le côté et positionnez la fleur sur la scène d’un microscope inversé (Figure 2) afin que le stigmate puisse être clairement imagée.</li>
	<li>Fixez la position de la fleur à imager en immobilisant la tige sur une lame de verre à l’aide de bandes de ruban de masquage. Maintenir la température entre 18 °C et 25 °C et l’humidité relative en dessous de 60 %. NOTE: Pour la lignée de plantes stériles mâles pA9-barnase, il est optimal d’effectuer le test le matin lorsque les fleurs s’ouvrent et que les pétales n’entravent pas le champ de vision.</li>
	<li>Ensuite, retirez une fleur saine et fraîchement ouverte de la plante donneuse de pollen. Placer sous un microscope à dissection et recueillir quelques grains de pollen sur l’extrémité d’une pince propre à pointe fine en touchant doucement les anthères (figure 3A). Un cil collé à une tige courte est également un outil efficace pour recueillir et transférer le pollen (Figure 3C).</li>
	<li>Enlevez l’excès de pollen des pinces en les touchant légèrement contre les pétales des fleurs d’où les grains de pollen ont été récoltés, jusqu’à ce qu’une monocouche de grains de pollen se forme à l’extrémité de la pince. REMARQUE: Une monocouche de grains de pollen sur l’extrémité des pinces à pointe fine facilitera considérablement le transfert d’un seul grain dans les étapes suivantes. Il est également possible d’obtenir un seul grain de pollen sur la pince par cette technique (Vidéo supplémentaire S1).</li>
	<li>Retourner à la plante réceptrice du pollen et, à l’aide d’une lentille d’objectif de faible puissance (p. ex. lentille d’objectif 10x; Figure 3B), focaliser le microscope inversé sur le stigmate à polliniser.</li>
	<li>En tenant la pince le long de l’ouverture entre les bras de la pince (Figure 4), approchez-vous prudemment d’une cellule papillale stigmatique non pollinisée (« vierge »). REMARQUE: Nous avons constaté que cette méthode de maintien des forceps facilite la dextérité et réduit l’impact de la poignée de main. Un micromanipulateur peut être utilisé pour les utilisateurs moins expérimentés ou ayant des difficultés à appliquer avec précision un seul grain de pollen à la main.</li>
	<li>Choisissez un grain de pollen convenablement positionné sur la pince pour le transférer au stigmate. Continuez à vous approcher de la cellule papillaire stigmatique non pollinisée jusqu’à ce que le grain de pollen sélectionné entre en contact léger avec sa surface. Retirez lentement les forceps et confirmez la fixation du pollen (Figure 5). REMARQUE: La vidéo supplémentaire S1 et la vidéo supplémentaire S2 démontrent cette étape avec des grains de pollen simples et multiples présents sur les pinces. </li>
	<li>Assurez-vous que le grain de pollen est orienté de manière à ce que son axe équatorial soit clairement visible et net. Passez immédiatement à un objectif de puissance supérieure (par exemple, 20x) et capturez une image du grain de pollen. Cette première image est T = 0. Continuez à capturer d’autres images à intervalles de 1 min pendant un total de 10 min.</li>
	<li>Ajustez la mise au point au besoin pour tenir compte des petits mouvements du grain de pollen ou du stigmate. Enregistrez la température ambiante et l’humidité relative de la pièce toutes les 2 minutes pour permettre des comparaisons futures entre les répétitions expérimentales.</li>
	<li>Une fois que toutes les images ont été capturées, enregistrez-les dans un format sans perte, tel que le format propriétaire du fabricant ou au format TIFF. REMARQUE : Il y aura 11 images par grain de pollen échantillonné (figure supplémentaire S1). Les paramètres d’acquisition accélérée automatisé/manuel de la plupart des logiciels d’acquisition d’images propriétaires sont des fonctionnalités utiles pour faciliter l’organisation de chaque série chronologique.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.4 à 2.9 pour les grains de pollen supplémentaires. Acquérir des données pour un nombre presque équivalent de pollinisations témoins (type sauvage [WT]) et expérimentales.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig02.jpg"> Figure 2 : Configuration de l’équipement utilisé pour le bioessai d’hydratation du pollen. Dans cet exemple, une lignée de plantes mâles stériles pA9-barnase était le receveur de pollen. La plante, dans son pot, a été placée sur le côté et la tige a été collée à une lame de verre positionnée sur la scène du microscope. Pour réduire les contraintes mécaniques et faciliter le positionnement de la plante, une plate-forme réglable a été utilisée pour soutenir le pot de la plante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig03.jpg"> Figure 3 : Prélèvement des grains de pollen de la fleur donneuse de pollen. Les images montrent l’utilisation de (A) pinces à pointe fine et (C) d’un morceau de cil. Les touffes de pollen (flèche rouge) doivent être enlevées en les touchant légèrement contre les pétales des fleurs donneuses jusqu’à l’obtention d’une monocouche de grains de pollen (flèche verte). (B) Image à haute résolution d’un stigmate mâle stérile d’A. thaliana (Col-0) pA9-barnase non pollinisé qui a atteint le stade de développement approprié pour le bioessai d’hydratation du pollen. Barre d’échelle = 100 μm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig04.jpg"> Figure 4 : Méthode de maintien des forceps lors du transfert de pollen au stigmate receveur. A) Orientation incorrecte pour tenir les forceps; (B) orientation correcte pour tenir la pince. Tenir les forceps latéralement dans cette configuration, comme l’indique la position du pouce entre les bras de la pince, offre une plus grande stabilité pour faciliter le transfert des grains de pollen vers les papilles stigmatiques non pollinisées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig05.jpg"> Figure 5 : Transfert d’un seul grain de pollen de l’extrémité d’une paire de forceps à une cellule papillale stigmatique non pollinisée (« vierge ») d’une plante mâle stérile pA9-barnase. (A) Approche prudente de la cellule papillaire. (B) Fixation d’un grain de pollen positionné de manière appropriée (flèche bleue) à la cellule papillale (flèche orange). (C) Retrait des forceps et confirmation visuelle de la fixation du pollen (flèche violette). Les panneaux A-C ont été photographiés avec un objectif 10x (distance de travail de 10,5 mm; ouverture numérique de 0,25) et sont des instantanés dérivés du clip vidéo présenté dans la vidéo supplémentaire S1. (D) Passage à un objectif 20x (distance de travail de 2,1 mm; ouverture numérique de 0,5) pour le lancement de la capture d’images dans une série chronologique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Mesures d’essai d’hydratation du pollen
<ol><li>Définir le taux d’hydratation du pollen comme le changement de longueur du demi-petit axe (figure 6) du grain pollinique (c.-à-d. le rayon équatorial) au fil du temps et le présenter en pourcentage de changement (équation [1]) : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65280/65820eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)</li>
	<li>À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, enregistrez les valeurs des demi-petits axes pour chaque grain de pollen de la série expérimentale. REMARQUE : Le nom de cette option de mesure dépend du logiciel, par exemple « Ellipse pivotée » ou « Ellipse à 5 points ».</li>
	<li>Répéter les étapes 3.1 à 3.2 pour tous les autres grains de pollen à mesurer. Pour des raisons de cohérence, appliquez le même degré de zoom numérique et la même approche pour définir la « limite pollinique » pour toutes les mesures des ensembles de données.</li>
	<li>Une fois toutes les mesures terminées pour une série chronologique, exportez les valeurs brutes des demi-petits axes de chaque pile d’images vers une feuille de calcul et présentez les données en colonnes par pile d’images. Veiller à ce que les données d’au moins 15 grains de pollen hydratés soient incluses dans l’analyse pour chaque lignée végétale (tableau supplémentaire S1).</li>
	<li>Il n’est pas rare qu’un petit nombre de grains de pollen ne parviennent pas à hydrater ou s’hydratent beaucoup plus lentement que prévu. Ces grains « ratés » peuvent être le résultat d’un mauvais contact entre le grain et la cellule papillaire ou liés à la viabilité du pollen. Recherchez-les et excluez-les de l’ensemble de données, sauf si cela est nécessaire dans leur conception expérimentale.</li>
	<li>Calculez les valeurs moyennes pour chaque point temporel par ligne d’usine. Utilisez des tests t non appariés et une ANOVA unidirectionnelle pour l’analyse statistique des données d’hydratation des lignées WT et mutantes à chaque point temporel. Utilisez un test t multiple pour la comparaison simultanée des moyennes entre WT et les lignées mutantes à plusieurs points temporels. NOTE: Les graphiques XY sont également très utiles pour visualiser la tendance globale de l’hydratation du pollen entre les lignées de plantes comparées.</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig06.jpg"> Figure 6 : Grain de pollen WT hydratant sur une cellule papillaire stigmatique d’A. thaliana (Col-0; lignée stérile mâle pA9-barnase). (A) Point temporel zéro, 0 (0 MAP) et (B) 10 MAP. Le cercle rouge autour du grain pollinique est la « limite pollinique » définie et dessinée par l’opérateur à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les lignes vertes et rouge foncé à l’intérieur du pollen représentent respectivement les demi-grands et demi-mineurs. La longueur du demi-petit axe est utilisée pour calculer le degré d’hydratation du pollen. Une série chronologique complète de cet ensemble de données se trouve à la figure supplémentaire S1. L’image a été prise avec un objectif 20x (distance de travail de 2,1 mm; ouverture numérique de 0,5). Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : MAP = min-après-pollinisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

An Improved Method to Measure Pollen Hydration Profiles in Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Rieseberg, L. H., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+speciation.">Plant speciation.</a> Science. 317 (5840), 910-914 (2007).</li><li>Hiscock, S. J., Allen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+cell+signalling+pathways+regulate+pollen-stigma+interactions:+the+search+for+consensus.">Diverse cell signalling pathways regulate pollen-stigma interactions: the search for consensus.</a> New Phytologist. 179 (2), 286-317 (2008).</li><li>Kandasamy, M. K., Nasrallah, J. B., Nasrallah, M. 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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Pour les plantes à fleurs, les tout premiers stades de la reproduction sexuée sont sans doute les plus importants. Au niveau de l’interaction pollen-stigmate, des décisions moléculaires sont prises qui déterminent la « compatibilité » des partenaires en interaction. De telles décisions, si elles sont prises correctement, évitent le gaspillage de ressources qui pourrait avoir une incidence sur la capacité de reproduction21. Ainsi, permettre uniquement au pollen compatible d’effectuer la fécondation est un élément important du maintien de génotypes bien adaptés et, par conséquent, du succès évolutif des espèces. Les recherches menées avec la plante modèle A. thaliana ont été extrêmement précieuses pour approfondir notre compréhension de ce processus. Un certain nombre d’études au cours des dernières décennies ont révélé la présence de facteurs dans le manteau pollinique qui agissent au premier « point de contrôle » de compatibilité, où le pollen accède à de l’eau stigmatique pour permettre l’hydratation du pollen13. Malgré ces premières informations sur les mécanismes qui régulent la compatibilité pollen-stigmate, il existe encore de nombreuses lacunes dans notre compréhension de ce processus. À ce jour, aucun mutant de ligands transmis par le pollen ou de récepteurs stigmatiques connus pour avoir un impact sur l’hydratation du pollen ne peut bloquer complètement la pollinisation compatible, suggérant la présence d’autres déterminants non découverts de l’hydratation du pollen. En étant capable d’observer facilement le phénotype d’intérêt, le bioessai d’hydratation du pollen décrit ici est l’une des techniques les plus simples pour étudier les mutants potentiels qui régulent la pollinisation.
Les méthodologies existantes pour mesurer l’hydratation du pollen utilisent généralement des pollinisations en vrac et rapportent moins de points temporels 14,22,23, et peuvent donc manquer d’importants phénotypes de profil d’hydratation subtil. Par exemple, l’étude de Wang et al.13, ainsi que les travaux sur d’autres mutants de la protéine du manteau pollinique dans notre laboratoire (observations non publiées), ont révélé des différences intrigantes dans les profils d’hydratation entre les mutants. De telles différences subtiles peuvent contenir des indices importants sur les mécanismes de régulation sous-jacents à une pollinisation compatible.
La méthode décrite ici se concentre sur l’acquisition d’un nombre relativement faible de mesures entre les lignées végétales mutantes et WT, en mettant l’accent sur la précision méthodologique pour réduire la variation dans les ensembles de données. Bien que cette méthode soit hautement reproductible (comme le montre la figure 7), en supposant que la température et l’humidité sont correctement contrôlées, il est important de recueillir des données d’hydratation pour un nombre presque égal de pollen WT et mutant le même jour afin de réduire davantage le potentiel de variation. Les données peuvent ensuite être regroupées sur différents jours si nécessaire. En outre, la sélection des plantes de contrôle WT appropriées est essentielle pour une interprétation correcte des résultats d’hydratation. Pour le receveur de pollen, la même lignée végétale doit être utilisée pour recevoir à la fois des grains de contrôle WT et des grains de pollen mutants.
Par exemple, nous utilisons la lignée végétale mâle stérile pA9-barnase, qui est également présentée dans le protocole vidéo, comme destinataire du pollen WT (témoin) et mutant (expérimental) lors de l’étude des lignées mutantes de pollen d’ADN-T (telles que le mutant 'KD' décrit à la figure 8). Le mélange des données d’une telle lignée stérile masculine, qui n’a pas besoin d’être émasculée, avec celles recueillies à partir d’une lignée témoin émasculée manuellement doit être évité car ces stigmates se comporteront probablement différemment. De même, les lignées mutantes émasculées doivent être utilisées en conjonction avec une lignée WT émasculée (témoin) chaque fois que cela est possible. La même prudence doit également être appliquée lors de l’examen du patrimoine génétique des plantes étudiées. Alors que les collections les plus populaires de mutants d’ADN-T ont été générées dans le fond Col-0, d’autres, telles que la collection FLAG de l’Institut national de la recherche agronomique (INRA), sont disponibles dans le fond génétique de Wassilewskija (WS)24,25. Dans de tels cas, il est conseillé d’utiliser les lignées de plantes WT de l’écotype respectif comme témoins.
Bien que nous nous soyons concentrés ici sur l’hydratation du pollen au cours des 10 premières minutes de l’interaction pollen-stigmate, cette méthode peut également être adaptée pour englober des profils d’hydratation couvrant une période plus longue. Une caractéristique clé du protocole est que les fleurs restent attachées au courant végétal parent Les protocoles publiés nécessitent généralement l’excision du pistil et leur placement dans un milieu pour soutenir le tissu pendant la durée de l’expérience14,18,26. Bien qu’il n’y ait aucune preuve directe suggérant qu’une telle approche semi-in vivo ait un impact sur l’hydratation du pollen ou modifie même la régulation in vivo de ce processus, il est concevable que l’excision des fleurs de la plante mère puisse avoir un impact sur la pollinisation. Ainsi, ce protocole permet d’obtenir un véritable environnement in vivo pour l’étude de l’interaction pollen-stigmate, où l’intégrité structurelle de la plante est préservée.
Le transfert de grains de pollen uniques à des papilles stigmatiques « vierges » est sans doute l’une des opérations les plus difficiles décrites dans ce protocole. Il n’est pas rare de transférer des grappes de grains de pollen par erreur. Cependant, le risque que cela se produise peut être considérablement réduit en s’assurant que seule une monocouche de pollen est présente sur la pince (Figure 3A) (ou même un seul grain de pollen; Figure 5), et/ou en utilisant des grains de pollen déjà orientés, de sorte qu’ils « dépassent » des autres sur l’extrémité de la pince. Nous avons constaté qu’un opérateur expérimenté peut réussir le transfert d’un seul pollen vers une cellule papillaire stigmatique en environ 3 minutes et enregistrer des données pour jusqu’à cinq grains de pollen sur une période de 1 heure. Ainsi, sur une période de 2 à 4 jours, suffisamment de données peuvent être accumulées pour une analyse statistique significative des lignées végétales étudiées.
L’erreur humaine est potentiellement la plus grande source de variation dans l’analyse des ensembles de données dérivés d’études utilisant ce protocole. Par exemple, la définition de la « limite pollinique » lors de l’analyse de l’image dépend du jugement du chercheur individuel. Ainsi, il est possible que les mesures effectuées par différents chercheurs, même sur le même ensemble de données, puissent générer des variations. Dans la mesure du possible, un seul chercheur devrait effectuer les mesures afin de minimiser les erreurs d’échantillonnage. En outre, le couplage de l’analyse des ensembles de données WT et mutants par le même opérateur annule la définition potentiellement subjective de la « limite pollinique » et de la variation interopérateur.
En conclusion, une méthode sophistiquée mais précise pour mesurer les profils d’hydratation du pollen dans l’organisme modèle A. thaliana est décrite. Nous avons démontré qu’en utilisant ce protocole, des données très cohérentes sur l’hydratation du pollen pour A. thaliana peuvent être facilement acquises. Trois lots indépendants de données sur les pollinisations de WT acquises à des jours différents ont montré de petits écarts constants de <3% à tous les points temporels (figure 7 et tableau supplémentaire S1). Bien que l’essai biologique présenté ici soit légèrement plus complexe que la plupart des protocoles existants, la résolution des données générées est supérieure et convient à l’identification et à la caractérisation de nouveaux mutants qui ont un impact sur les voies régulant la pollinisation compatible.

La reproduction sexuée réussie chez les angiospermes repose généralement sur le transfert de grains de pollen intraspécifiques de l’anthère au stigmate, soit à l’intérieur des individus ou entre eux (c.-à-d. pollinisation). Ce transfert de grains de pollen à une fleur réceptive est généralement médié par des pollinisateurs ou des facteurs abiotiques; En tant que tel, cela entraîne également fréquemment le dépôt de pollen hétérospécifique dans des conditions naturelles. À quelques exceptions près, la progression de la pollinisation par le pollen hétérospécifique est désavantageuse sur le plan de l’évolution, réduisant la capacité de reproduction en raison de la perte d’opportunités d’accouplement, la plupart des descendants hybrides qui en résultent ne se développant pas correctement ou étant stériles1. Ainsi, des mécanismes ont évolué pour bloquer la pollinisation par des pollens hétérospécifiques « incompatibles» 2. La reconnaissance rapide du pollen compatible est donc sans doute le processus le plus important dans les premiers stades de la reproduction sexuée chez de nombreuses plantes à fleurs.
Dans la famille des Brassicaceae, où les stigmates sont de type « sec », une série de points de contrôle moléculaires agissent à plusieurs stades du processus de reproduction régulant la pollinisation, de sorte que seul le pollen compatible est efficace. L’hydratation du pollen est l’un des points de contrôle les plus importants (Figure 1), car le pollen qui ne parvient pas à s’hydrater ne peut pas progresser pour produire un tube pollinique et ensuite livrer des spermatozoïdes au gamétophyte femelle. Fréquemment, les grains incompatibles ne franchissent pas ce premier point de contrôle de pollinisation et n’ont donc pas accès à l’eau stigmatisante3. Chez les membres de la famille des Brassicaceae, la reconnaissance du pollen se produit rapidement, la compatibilité étant établie dans les minutes suivant la fixation du grain de pollen au pistil 4,5. Ces dernières années, beaucoup de progrès ont été réalisés et nous commençons maintenant à comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent les principaux points de contrôle de la pollinisation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig01.jpg"> Figure 1 : Aperçu des événements clés lors de la pollinisation compatible. Ces étapes, telles que l’hydratation du pollen et la germination du tube pollinique, sont également des « points de contrôle » de pollinisation qui doivent être parcourus avec succès pour effectuer une pollinisation compatible. Le diagramme représente un stigmate de type « sec », typique des espèces de la familledes Brassicaceae 2,20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Des recherches pionnières sur le système d’auto-incompatibilité (SI) de Brassica, où le pollen « soi » est reconnu et rejeté, ont établi le paradigme de la reconnaissance de la stigmatisation pollinique chez les Brassicaceae 6,7,8,9,10. Le SI chez Brassica et ses parents est médié par des protéines de « reconnaissance » qui résident à la surface du pollen et à la membrane plasmique stigmatique qui, lors de l’interaction, conduisent au rejet du pollen. Le rejet du pollen SI opère par perturbation du système de compatibilité pollen-stigmate basal qui, lorsqu’il est pleinement activé par la perception du pollen compatible, conduit à une sécrétion ciblée par le stigmate, entraînant ainsi l’hydratation du pollen (pour les examens du mécanisme de compatibilité pollinique, voir11,12). Dans l’exemple du SI, le ligand transmis par le pollen est une petite protéine riche en cystéine, riche en cystéine S-locus (SCR/SP11), et le récepteur stigmatique est la kinase du récepteur S-locus (SRK).
Récemment, chez Arabidopsis thaliana, un autre groupe de petites protéines riches en cystéine transmises par le pollen, les protéines d’enveloppe pollinique de classe B (AtPCP-Bs), se sont révélées être des régulateurs importants de l’acceptation du pollen par l’activation de l’hydratation du pollen13. Les récepteurs stigmatiques des PCP-Bet les aspects de la voie réglementaire en aval ont également été décritsrécemment 14,15. Il est intéressant de noter que les études mutationnelles de gènes codant pour des médiateurs potentiels de signalisation du pollen transmis par le pollen et stigmatiques de l’hydratation du pollen (y compris AtPCP-Bs) n’ont pas réussi à générer des plantes qui ont un blocage complet au point de contrôle de l’hydratation du pollen. Cela suggère fortement que de multiples autres facteurs, encore non découverts, jouent un rôle dans la régulation de l’hydratation du pollen. En nous appuyant sur la méthode décrite pour la première fois par Wang et al.13, nous décrivons ici un essai biologique in vivo amélioré à haute résolution adapté à l’identification des défauts subtils d’hydratation du pollen dans les lignées candidates mutantes A. thaliana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A9-barnase line</td>
			<td>University of Bath</td>
			<td>Courtsey of Prof. Rod Scott</td>
			<td>Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Dumont 500342</td>
			<td>Tweezer uses for transfer of pollen grain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prsim (version 8.0.2)</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td>Prism</td>
			<td>Comprehensive data analysis, graphing and statistics software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP (version 17)</td>
			<td>JMP Statistical Discovery LLC</td>
			<td>JMP 17</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levington F2S seed &#38; modular compost (with sand)</td>
			<td>Levington</td>
			<td>LEV75F2SMS</td>
			<td>General-purpose compost for plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Singer instrument Co. LTD.</td>
			<td>Singer Micromanipulator</td>
			<td>Micromanipulator to aid transfer of pollen grain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Digit sight DS-U1</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-U1</td>
			<td>Microscope camera (coupletd to SMZ1500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td>Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DS-Fi3 microscope camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Fi3</td>
			<td>Microscope camera (coupletd to TE2000-S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS-Elements Basic Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements BR</td>
			<td>Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon NIS-Elements F</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements F</td>
			<td>Image accquisition and analysis software (for DS-U1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT Col-0 plant line</td>
			<td>NASC</td>
			<td>N700000</td>
			<td>Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-resolution, single-grain, in vivo pollen hydration bioassay for arabidopsis thaliana

La reproduction sexuée chez les plantes à fleurs nécessite une interaction initiale entre le grain de pollen et la surface stigmatique, où un dialogue moléculaire est établi entre les partenaires en interaction. Des études portant sur diverses espèces ont révélé qu’une série de points de contrôle moléculaires régulent l’interaction pollen-stigmate pour s’assurer que seul le pollen compatible, généralement intraspécifique, réussit à effectuer la fécondation. Chez les espèces qui possèdent un « stigmate sec », comme la plante modèle Arabidopsis thaliana, le premier point de contrôle de compatibilité prézygote post-pollinisation est l’établissement de l’hydratation du pollen. 
Cette phase de pollinisation est étroitement réglementée, les signaux du grain de pollen suscitant la libération d’eau du stigmate, permettant ainsi l’hydratation du pollen. La capacité de mesurer et de suivre avec précision l’hydratation du pollen au fil du temps est essentielle à la conception d’expériences visant à comprendre la régulation de cette étape critique de la reproduction. Les protocoles publiés utilisent fréquemment des fleurs qui ont été excisées de la plante mère, maintenues sur des milieux liquides ou solides et pollinisées en vrac. 
Cet article décrit un essai biologique de pollinisation in vivo non invasif qui permet un suivi minute par minute de l’hydratation des grains de pollen individuels d’A. thaliana à haute résolution. Le test est hautement reproductible, capable de détecter des variations très subtiles des profils d’hydratation du pollen, et convient donc à l’analyse des mutants qui affectent les voies régulant la pollinisation. Bien que le protocole soit plus long que ceux décrits pour les pollinisations en vrac, la précision et la reproductibilité qu’il fournit, ainsi que sa nature in vivo , le rendent idéal pour la dissection détaillée des phénotypes de pollinisation.

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Cette section présente deux ensembles d’exemples de données sur l’hydratation du pollen, recueillies comme décrit ci-dessus, pour A. thaliana. Le premier ensemble de données consiste en trois répétitions d’une série chronologique d’hydratation du pollen pour les plantes WT, chaque répétition étant collectée un jour différent. Chaque répétition contient pas moins de 18 valeurs individuelles de grains de pollen, totalisant 55 grains de pollen dans les trois répétitions. Les valeurs minimales et maximales pour les moyennes entre les répétitions, pour tous les points temporels, se situaient à moins de 3 % (figure 7 et tableau supplémentaire S1). Ces données représentatives pour les pollinisations WT démontrent clairement le degré élevé de cohérence qui peut être obtenu en utilisant la méthodologie détaillée ici pour des nombres d’échantillons relativement faibles et sur différents jours.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig07.jpg"> Figure 7 : Graphique XY montrant la consistance des profils d’hydratation du pollen de type sauvage d’A. thaliana sur une période de 10 minutes. Le parent pollinique était l’accession Col-0 de A. thaliana et le parent pistil était la lignée mâle stérile pA9-barnase A. thaliana (Col-0). Les données représentent trois ensembles de données indépendants recueillis à des jours différents et démontrent un degré élevé de cohérence. Un diagramme en boîte et moustaches et une analyse statistique des moyennes de ces ensembles de données sont présentés dans la figure supplémentaire S2. Le nombre de pollen mesuré ('n') pour chaque ensemble de données indépendant est affiché à côté de la syntaxe (WT1/WT2/WT3) sur la figure. Abréviation : WT = type sauvage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le deuxième ensemble de données a été obtenu pour une lignée végétale hébergeant une insertion d’ADN-T dans un gène codant pour la protéine du pollen codant pour une mutation « knockdown », ci-après appelée « mutant KD ». Le pollen mutant a été déposé sur des stigmates stériles mâles pA9-barnase pour le profilage de l’hydratation, comme décrit dans le protocole. Comme on peut le voir sur les données résultantes (Figure 8), les pollens mutants et WT avaient des profils d’hydratation indiscernables au cours des 5 premières minutes. Cependant, 5 à 10 minutes après la pollinisation (MAP), le changement moyen d’axe semi-mineur pour le pollen mutant a commencé à prendre du retard par rapport au pollen WT, la différence devenant statistiquement significative à 10 MAP. Ce résultat démontre non seulement que cette protéine d’enveloppe pollinique joue un rôle dans la médiation de l’hydratation du pollen, mais illustre également bien l’utilité de ce test biologique à grain unique à haute résolution pour suivre l’hydratation du pollen. Dans cet exemple particulier, sa sensibilité a pu détecter l’effet subtil d’un « knockdown » d’un gène codant pour la protéine du manteau pollinique.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65280/65280fig08.jpg"> Figure 8 : Profils d’hydratation du pollen pour WT et une lignée mutante de protéine d’enveloppe pollinique « knockdown » (mutant KD). (A) Profils d’hydratation sur une période de 10 minutes pour WT et pollen mutant. Les parents polliniques étaient l’accession Col-0 de A. thaliana et le mutant KD de la protéine d’enveloppe pollinique (également dans le fond Col-0). Dans les deux cas, le parent du pistil était la lignée mâle stérile pA9-barnase A. thaliana (Col-0). (B) Diagrammes en boîtes et moustaches montrant l’étendue de l’hydratation du pollen (en termes de variation en pourcentage de l’axe semi-mineur) à 5 MAP et 10 MAP pour les ensembles de données WT et pollen mutant. Les moustaches représentent les valeurs minimales et maximales de l’échantillon. Les cases représentent le quartile inférieur, la médiane et le quartile supérieur de l’ensemble de données. Les croix blanches représentent la moyenne de l’ensemble de données. L’analyse du test t non apparié montre que le pourcentage moyen d’hydratation du pollen est significativement différent entre les deux lignées végétales à 10 MAP. Un astérisque indique p < 0,05 (test t non apparié). Abréviations : WT = type sauvage; KD = knockdown; MAP = min-après-pollinisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Série chronologique d’un essai biologique d’hydratation du pollen cultivé d’un grain de pollen WT hydratant sur une cellule papillaire stigmatique d’une plante mâle stérile pA9-barnase pendant 10 minutes. Les images ont été prises à intervalles de 1 minute. Les images à 0 MAP et 10 MAP ont été utilisées dans la figure 6 (jointe séparément). Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : WT = type sauvage; MAP = min-après-pollinisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_New%20Supplementary%20figure%20S1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Diagramme en boîte et moustaches montrant l’étendue de l’hydratation du pollen (en termes de variation en pourcentage de l’axe semi-mineur) sur une période de 10 minutes pour les trois ensembles de données sur le pollen WT décrits à la figure 7. Le parent du pistil était la lignée mâle stérile pA9-barnase A. thaliana (Col-0). Les moustaches représentent les valeurs minimales et maximales de l’échantillon. Les cases représentent le quartile inférieur (charnière inférieure), la médiane (charnière du milieu) et le quartile supérieur (charnière supérieure) de l’ensemble de données. Les points de données individuels sont affichés. L’ANOVA unidirectionnelle montre que le pourcentage moyen des valeurs d’hydratation du pollen entre les trois ensembles de données n’était pas statistiquement significativement différent les uns des autres tout au long de la période de 10 minutes. Le seuil significatif est p < 0,05 (ANOVA unidirectionnelle). Abréviation : WT = type sauvage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary%20figure%20S2%20(2).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire S1 : Données brutes sur l’hydratation du pollen utilisées pour construire la figure 7 (pollen Col-0 d’A. thaliana WT sur stigmate stérile mâle pA9-barnase). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary%20table%20S1.xls" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire S1 : Une vidéo démontrant le transfert d’un seul grain de pollen WT (Col-0 accession) sur l’extrémité d’une paire de forceps à une cellule papillaire stigmatique « vierge » (lignée stérile mâle pA9-barnase). Pour faciliter l’accessibilité de la vidéo, la qualité de l’image a été intentionnellement abaissée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary%20Video%20S1.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire S2 : Une vidéo démontrant le transfert d’un seul pollen WT (Col-0 accession) d’une monocouche de grains de pollen à l’extrémité d’une paire de forceps à une cellule papillaire stigmatique « vierge » (lignée stérile mâle pA9-barnase). Pour faciliter l’accessibilité de la vidéo, la qualité de l’image a été intentionnellement abaissée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65280/65280_Supplementary%20Video%20S2.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE 

Une méthode améliorée pour mesurer les profils d’hydratation du pollen chez Arabidopsis thaliana est décrite ici. La nouvelle méthode offre une résolution plus élevée, est non invasive et est hautement reproductible. Le protocole représente un nouvel outil pour une dissection plus fine des processus qui régulent les premiers stades de la pollinisation.

Un essai biologique in vivo à haute résolution sur l’hydratation du pollen à grain unique pour Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

Les travaux de notre laboratoire visent à comprendre la base moléculaire de la compatibilité de la stigmatisation pollinique dans la famille des angiospermes brassicaceae. En particulier pour identifier le pollen et les facteurs stigmatiques qui régulent une pollinisation réussie, en particulier ceux qui agissent dès les premiers stades de la reproduction des plantes. Les plus grands défis expérimentaux sont l’identification des gènes et des protéines candidats qui pourraient être impliqués dans la signalisation de la stigmatisation pollinique.Une fois le candidat identifié, des études mutationnelles sont nécessaires pour déterminer sa fonction. Nos recherches ont montré qu’une famille de petites protéines d’enveloppe pollinique appelées PCP-B sont des régulateurs importants de l’hydratation du pollen et de la compatibilité de la stigmatisation pollinique chez Arabidopsis thaliana. Ces résultats ont ouvert la voie à d’autres avancées dans la compréhension de la perception des signaux polliniques et de la façon dont les stigmates les relaient.À ce jour, il n’existe pas de protocole normalisé pour mesurer l’hydratation du pollen chez Arabidopsis, ce qui rend difficile la comparaison des ensembles de données. Fournir un protocole détaillé pour un essai biologique de pollinisation peut faciliter la recherche en cours et fournir une boîte à outils facilement accessible pour les scientifiques intéressés par ce domaine. Les protocoles publiés reposent souvent sur l’élimination des stigmates des fleurs avant le début de la pollinisation, ce qui peut avoir des conséquences physiologiques affectant l’hydratation du pollen.La méthode actuelle ressemble le plus à la situation in vivo et est plus précise dans la collecte de points de données individuels. Notre laboratoire se concentre sur la découverte de nouveaux déterminants de l’hydratation du pollen et de leurs partenaires stigmates. Nos travaux récemment publiés ont exploré la protéine du manteau pollinique pour Arabidopsis thaliana, révélant que la surface du pollen contient de nombreuses petites protéines de type ligand, ce qui suggère fortement que de multiples facteurs déterminent la compatibilité de la stigmatisation pollinique.