Name: RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00
Duration: 1 min 27 s
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Wir möchten uns bei den Laboren in der C. elegans-Gemeinschaft bedanken, die die Werkzeuge entwickelt und geteilt haben und deren Arbeit in diesem Manuskript zitiert wird. Einige Stämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium des Canadian Institutes of Health Research (CIHR) an A.L.S. (PJT-175245) unterstützt. C.L. wird durch ein Postgraduiertenstipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (PGS-D) unterstützt.

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

<ol>
	<li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li><li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans.">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li><li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality.">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li><li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+silencing+by+RNAi.">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882 (2006).</li><li>Lee, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts.">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li><li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li><li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans.">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078 (2015).</li><li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline.">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li><li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus.">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li><li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways.">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li><li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes.">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448 (2019).</li><li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance.">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li><li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses.">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797 (2021).</li><li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans.">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li><li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans.">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li><li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein.">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li><li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piRNAs+coordinate+poly(UG)+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing.">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+GeneticsWormBook:+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology.">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record.">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans.">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li><li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint.">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li><li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 10, 6 (2017).</li><li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing.">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li><li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance.">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi.">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li><li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans.">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li><li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans.">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li><li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans.">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li><li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans.">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li></ol>

Alle Autoren bestätigen, dass sie keine Konflikte offenzulegen haben.

In diesem Protokoll wird dsRNA durch Fütterung eingeführt, was bei C. elegans zu einer Standardmethode geworden ist 18. Für RNAi-Vererbungsassays bietet der Fütterungsansatz eine einfache Methode, um eine große P0-Population 2,11,12,22,23,24,25 zu erhalten. Der Zeitpunkt und die Dauer der RNAi-Exposition beeinflussen jedoch die Wirksamkeit des Transgen-Silencings26, und die Konzentration von RNAi-Bakterien beeinflusst die Persistenz des vererbbaren RNAi-Silencings1. Daher sind standardisierte RNAi-Bakterien und Wurmwachstum wichtig, um ein konsistentes Maß an GFP-Silencing und Vererbungsdauer zu erreichen. Dabei werden Embryonen auf RNAi-Platten plattiert, so dass P0-Tiere vom Schlüpfen an RNAi-Bakterien ausgesetzt sind. Bei alternativen Ansätzen wurden synchronisierte Tiere im L1 24,27- oderL4 25-Stadium auf RNAi-NGM-Platten plattiert. Da Hunger und andere Belastungen die Aufrechterhaltung der RNAi-Vererbung beeinträchtigen13, müssen die Platten überwacht werden, um eine Überfüllung und Erschöpfung des Nahrungsangebots zu verhindern. Als Alternative zur Initiierung von RNAi durch Fütterung induzierten einige der bahnbrechenden RNAi-Vererbungsstudien von C. elegans RNAi durch Gonadeninjektion, was eine bessere Kontrolle der dsRNA-Konzentration ermöglicht 1,28.
In diesem Protokoll wird jede Generation als Population mit alkalischer Hypochloritbehandlung durchlaufen, wie zuvor beschrieben 16,22,23,24. Die Hypochloritbehandlung stellt sicher, dass die F1-Generation nicht mit RNAi-Bakterien aus der elterlichen Umgebung kontaminiert wird22 und verhindert mögliche unerwünschte Engpässe in der Population. Die Massenverbringung kann jedoch auch eine Einschränkung darstellen, da einzelne Tiere unterschiedliche Vererbungsmuster aufweisen können 1,29. Eine alternative Methode, um jede Generation zu bestimmen, ist die Auswahl einzelner Tiere 1,2,9,11,25. Dieser Ansatz ermöglicht es, Phänotypen innerhalb von Abstammungslinien zu verfolgen und genetische Kreuzungen einzubauen. Die Abstammungsanalyse kann auch bei Phänotypen mit geringer Penetranz von Vorteil sein12.
Die Expression fluoreszierender Proteine ist ein leistungsfähiges und bequemes Auslesen des RNAi-induzierten Silencings 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Wie in diesem Protokoll beschrieben, kann die GFP-Expression manuell als EIN oder AUS 11,12,15,16,25 bewertet werden. Das manuelle Scoring kann durch die Zuweisung der qualitativen Intensitätsstufen 3,4,14 weiter verfeinert werden. Alternativ kann die automatisierte Intensitätsbewertung von Mikroskopiebildern 11,12,14,25,27 oder die Durchflusszytometrie-Fluoreszenzmessung von lebenden Tieren 2 eine quantitative und Hochdurchsatz-Auslesung liefern. Da die Reporterexpression jedoch auf die Keimbahn beschränkt ist, besteht ein Vorbehalt automatisierter Ansätze darin, dass sie auch zwischen Tieren mit stillgelegter GFP-Expression und Tieren ohne Keimbahn unterscheiden müssen, insbesondere wenn die Studie Mutanten mit abnormaler Keimbahnentwicklung umfasst. Als Alternative zur GFP-Fluoreszenz kann die reverse Transkription (RT)-qPCR verwendet werden, um die RNAi-Ziel-Prä-mRNA- und mRNA-Spiegel 2,16,23,24 zu quantifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht ein direkteres Auslesen des Silencings, das auf RNA abzielt, und ist besonders nützlich für andere RNAi-Ziele, bei denen das Silencing keinen sichtbaren Phänotyp erzeugt. Eine Einschränkung bei der Verwendung künstlicher GFP-Reporter besteht darin, dass exogene und endogene Sequenzen in transgenerationaler RNAi11 unterschiedlich reguliert werden. Studien mit endogenen Targets, wie z. B. dem temperaturempfindlichen embryonalen letalen Allel oma-1(zu405)1,11,16,25, sollten daher als komplementärer Ansatz zu fluoreszierenden transgenen Reportern in Betracht gezogen werden.
Die Analyse von ChIP im Rahmen von RNAi-Vererbungsassays erfordert einen Vergleich zwischen Behandlungen und Replikaten. Erstens, um Unterschiede im Ausgangsmaterial zwischen den Proben zu berücksichtigen, wird das ChIP-Signal auf das Eingangssignal an der gleichen Stelle wie der "Prozentsatz des Eingangs" normalisiert. Die parallele Verarbeitung eines Histon-H3-ChIP hilft zu bestimmen, ob Veränderungen der Histonmodifikation mit Änderungen der Nukleosomendichte korrespondieren. Da es sich bei ChIP um einen mehrstufigen Prozess handelt, kann die Effizienz zwischen den Proben variieren. Die Auswahl geeigneter positiver und negativer Kontrollloci ist nützlich, um das Signal-Rausch-Verhältnis zwischen Proben und Experimenten zu bewerten und zu vergleichen. Um Vergleiche zwischen Proben zu erleichtern, werden die ChIP-DNA-qPCR-Schwellenwerte am RNAi-Ziel häufig auf einen Kontrollort 3,11,15,23,30,31 normiert. Um die Auswirkungen der RNAi-Behandlung zu bewerten, wird auch das Verhältnis des ChIP-Signals bei der Behandlung mit RNAi im Vergleich zu Kontroll- oder Nicht-RNAi-Bedingungen verglichen. Eine Einschränkung des derzeitigen Ansatzes besteht darin, dass ChIP mit ganzen Tieren durchgeführt wird, während das Ansprechen auf die RNAi-Behandlung möglicherweise nur in der Keimbahn erfolgt. Ein Ansatz, um diesen Vorbehalt zu überwinden, besteht darin, ChIP mit isolierten Keimbahnkernen durchzuführen. Weitere technische Überlegungen zur Optimierung von ChIP wurden auch an anderer Stelle ausführlich diskutiert32,33.
Insgesamt bietet diese RNAi-Vererbung und das ChIP-Protokoll eine detaillierte und leicht anzupassende Grundlage, die mit anderen Techniken integriert werden kann, um die transgenerationale epigenetische Regulation weiter zu erforschen. Zum Beispiel können Hochdurchsatz-Sequenzierungsbibliotheken aus der ChIP-DNA (ChIP-seq) konstruiert werden, um eine detailliertere Sicht auf die Chromatinlandschaft sowohl proximal des RNAi-Ziels als auch auf genomweiter Ebene zu erhalten.

Epigenetische Vererbung ermöglicht die Weitergabe genregulatorischer Informationen über Generationen hinweg und kann daher dazu führen, dass die Umwelt oder die Erfahrungen der Eltern ihre Nachkommen beeinflussen. Bei C. elegans kann das durch exogene doppelsträngige RNA (dsRNA) initiierte Gen-Silencing in der Keimbahn für mehrere Generationen in Nachkommen vererbt werden, die nicht dem ursprünglichen Auslöserexponiert sind 1,2,3,4. Dieser Prozess, der als RNA-Interferenz (RNAi)-Vererbung bezeichnet wird, ist eines von mehreren verwandten epigenetischen Silencing-Phänomenen bei C. elegans, einschließlich piRNA-initiiertes mehrgenerationenübergreifendes Silencing 2,5, Paramutation/RNAe (RNA-induziertes epigenetisches Silencing)6,7,8 und Multicopy-Array-initiiertes Silencing9, die überlappende, aber unterschiedliche Anforderungen an kleine RNA- und Chromatin-Regulationsmaschinen stellen . In der exogenen RNAi von C. elegans wird dsRNA zu kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) verarbeitet, die in einem Komplex mit primären Argonautenproteinen agieren, um ihre Ziel-mRNA zu erkennen. Dieses Targeting führt zur Amplifikation von sekundären siRNAs, die mit sekundären Argonauten assoziiert sind, um die Ziel-mRNA sowohl über zytoplasmatische als auch über nukleäre Silencing-Signalwege zum Schweigen zu bringen. Für Keimbahn-exprimierte RNAi-Targets zielen das nukleäre sekundäre Argonaute HRDE-1 und zusätzliche nukleäre RNAi-Faktoren auf naszierende Transkripte ab, was zu einer transkriptionellen Repression und Rekrutierung von Histonmethyltransferasen führt, um repressive Chromatinmarkierungen, einschließlich H3K9me310, abzuscheiden. Histon H3K9me3 fördert die Etablierung eines vererbbaren Silencings von Keimbahn-exprimierten grün fluoreszierenden Proteinen (GFP)-Transgenen durch RNAi-Vererbung11,12.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Transgen, das ein GFP-Histon-Fusionsprotein in der Keimbahn exprimiert, als Reporter für die RNAi-Vererbung zu verwenden und Veränderungen der Histonmodifikationen am Reportertransgenlocus mittels Chromatin-Immunpräzipitation und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (ChIP-qPCR) zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten plattenbasierten RNAi-Fütterungsansatz, um das Reporter-Silencing zu initiieren. Es bietet auch einen detaillierten Zeitplan für die Passage von Tieren zwischen den Generationen, indem Embryonen in utero von trächtigen Erwachsenen durch alkalische Hypochloritbehandlung ("Bleichung") isoliert werden. Methoden und repräsentative Daten zur Überwachung der Häufigkeit des GFP-Silencings in einer Untergruppe der Bevölkerung mittels Fluoreszenzmikroskopie und für die Histon H3K9me3 ChIP-qPCR werden ebenfalls beschrieben. Reporter-basierte RNAi-Vererbungsassays bieten ein hochgradig handhabbares System, um die Rolle genetischer und umweltbedingter Faktoren in der epigenetischen Regulation funktionell zu untersuchen 13,14, und genetische Screenings mit solchen Reportern haben sowohl Gene identifiziert, die für 2,3,15 erforderlich sind, als auch Gene, die 16,17 die Dauer der transgenerationalen epigenetischen Vererbung negativ regulieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGA002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMP201</td>
			<td>Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8898</td>
			<td>Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1791</td>
			<td>Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (6% Sodium hypochlorite)</td>
			<td>Lavo</td>
			<td>02358107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain with GFP RNAi Reporter</td>
			<td>NA</td>
			<td>SX1263</td>
			<td>Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>CAR544</td>
			<td>Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G Magnetic Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain HT115(DE3)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>HT115(DE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain OP50-1</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td>Make a 1.25 M solution and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH (1 M, pH 7.5)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>H1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Printed Slides, 10 wells</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100488-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>NON999</td>
			<td>Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl-&#946;-D-thiogalactoside)</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>IPT001</td>
			<td>Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates supplemented with 100 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Standard lab recipe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole (Tetramisole hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9756</td>
			<td>Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl (8 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator (1.5 mL tubes)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A13346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator (0.2 mL tubes)</td>
			<td>Permagen</td>
			<td>MSR812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>Technologist Choice</td>
			<td>LAB-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5 M)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4221</td>
			<td>For ChIP buffers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Make a 10 M solution and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM Plates</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 &#956;g/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 &#181;g/mL streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG (1 mg/mL)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (35 mm x 10 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1135.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid - Control RNAi&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>L4440 (Plasmid #1654)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid - GFP-targetting RNAi&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>L4417 (Plasmid #1649)</td>
			<td>Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [clec-18]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [gfp exon 1]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [gfp exon 4]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pair [hrp-2]</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-37084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>CFX96&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi-NGM plates</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 &#181;g/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 &#181;g/mL carbenicillin and 5 mM IPTG.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5777</td>
			<td>Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74255</td>
			<td>Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td>Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication Tube</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>214-3721-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication Tube Cap</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>300-2911-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q800R3-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>STP101</td>
			<td>Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer (1X)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tally counter clicker</td>
			<td>Uline</td>
			<td>H-7350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TET701</td>
			<td>Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of transgenerational epigenetic inheritance in c. elegans using a fluorescent reporter and chromatin immunoprecipitation (chip)

Die transgenerationale epigenetische Vererbung (TEI) ermöglicht die Übertragung von Informationen durch die Keimbahn, ohne die Genomsequenz zu verändern, durch Faktoren wie nicht-kodierende RNAs und Chromatinmodifikationen. Das Phänomen der RNA-Interferenz (RNAi)-Vererbung im Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein effektives Modell zur Untersuchung von TEI, das sich den kurzen Lebenszyklus, die Selbstvermehrung und die Transparenz dieses Modellorganismus zunutze macht. Bei der RNAi-Vererbung führt die Exposition von Tieren gegenüber RNAi zu Gen-Silencing und veränderten Chromatinsignaturen am Zielort, die über mehrere Generationen hinweg ohne den ursprünglichen Auslöser bestehen bleiben. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der RNAi-Vererbung in C. elegans unter Verwendung eines Keimbahn-exprimierten kerngrünen Fluoreszenzproteins (GFP)-Reporters. Das Reporter-Silencing wird durch die Fütterung der Tiere mit Bakterien eingeleitet, die doppelsträngige RNA exprimieren, die auf GFP abzielt. Bei jeder Generation werden die Tiere durchgelassen, um eine synchronisierte Entwicklung aufrechtzuerhalten, und das Stummschalten der Reportergene wird durch Mikroskopie bestimmt. In ausgewählten Generationen werden Populationen gesammelt und für die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) aufbereitet, um die Anreicherung der Histonmodifikation am GFP-Reporterlocus zu messen. Dieses Protokoll zur Untersuchung der RNAi-Vererbung kann leicht modifiziert und mit anderen Analysen kombiniert werden, um TEI-Faktoren in kleinen RNA- und Chromatin-Signalwegen weiter zu untersuchen.

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Tiere, die den Keimbahn-exprimierten GFP-Histon H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 Reporter (Abbildung 2A) trugen, wurden GFP-RNAi oder Kontroll-RNAi durch Fütterung ausgesetzt und wie im Protokoll und in Abbildung 1 beschrieben durchgelassen. Das nukleäre GFP-Signal in der Keimbahn wurde manuell mit einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop für eine Probe der Population zu jeder Generation bewertet. Die Stilllegung des Transgens war bei den bewerteten P0- und F1-Tieren, die mit GFP-RNAi behandelt wurden, vollständig penetrant (Abbildung 2B). In der F2-Generation lag der Anteil der Bevölkerung, der eine Vererbung des GFP-Silencings aufwies, bei etwa 50%. In der F5-Generation zeigte die Mehrheit der Population keine Vererbung des Silencings, und in der F10-Generation wurde keine Vererbung festgestellt, da alle Tiere GFP exprimierten.
Um die Veränderung der Histon-H3K9me3-Anreicherung zu bestimmen, die dem RNAi-induzierten Silencing entspricht, wurde eine ChIP-qPCR an Tieren der F1-Generation nach einer GFP-RNAi- oder einer Kontroll-RNAi-Behandlung durchgeführt. Wie erwartet, wies die GFP-RNAi-behandelte Population im Vergleich zu den mit RNAi behandelten Kontrolltieren höhere Histon-H3K9me3-Spiegel am GFP-Ziel und in der 1,3 kb stromabwärts gelegenen Region auf (Abbildung 2C). Die Spezifität des Histons H3K9me3 ChIP wird durch die Anreicherung an einem Positivkontrollort (clec-18) unterstützt, von dem bekannt ist, dass er in dieser Markierung angereichert ist, nicht jedoch an einem nahe gelegenen negativen Kontrollort (hrp-2). Die Histon-H3-Anreicherung und die Hintergrundanreicherung in den IgG-Kontroll-Immunpräzipitationen wurden erwartungsgemäß ebenfalls an allen qPCR-Loci nachgewiesen. Wenn die ChIP-Anreicherung am Reporter auf den clec-18-positiven Kontrolllocus normalisiert wird, zeigt sich eine höhere Histon-H3K9me3-Anreicherung auf GFP-RNAi, während die Histon-H3-Anreicherung zwischen der Kontroll- und der GFP-RNAi-Behandlung ähnlich ist (Abbildung 2D). Da nicht zu erwarten ist, dass GFP-RNAi das Histon H3K9me3 oder die Gesamtbelegung von Histon H3 am clec-18-Locus beeinflusst, mildert diese Normalisierung technische Schwankungen ab, wie z. B. Unterschiede in der ChIP-Effizienz zwischen den GFP-RNAi- und Kontroll-RNAi-Proben. Die Faltungsänderung der Histon-H3K9me3- und Histon-H3-Spiegel zwischen RNAi-Behandlungen zeigt eine GFP-Reporter-spezifische Histon-H3K9me3-Anreicherung, unabhängig von der Histonbelegung, bei GFP-RNAi-induzierter Stummschaltung (Abbildung 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> Abbildung 2: GFP-RNAi-induziertes Silencing entspricht einer erhöhten H3K9me3-Anreicherung am RNAi-Ziel. (A) Diagramm des Keimbahn-exprimierten GFP-RNAi-Reporters mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] mit markierten qPCR-Amplikonregionen. (B) Die GFP-Expression wurde über Generationen hinweg nach RNAi-Behandlungen bei 21 °C bewertet. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von zwei biologischen Replikaten dar. (C) ChIP-qPCR von H3K9me3, Histon H3 und IgG-Kontrolle bei jungen F1-Erwachsenen aus zwei biologischen Replikaten. clec-18 und HRP-2 sind die positiven bzw. negativen Kontrollloci für die H3K9me3-Anreicherung. (D) Die Anreicherung von H3K9me3 und Histon H3 am GFP-RNAi-Reporter normalisierte sich auf den clec-18-Positivkontrolllocus. (E) Veränderung der H3K9me3- und Histon-H3-Anreicherung zwischen GFP-RNAi- und Kontroll-RNAi-behandelten Tieren mit Normalisierung auf clec-18. Die gestrichelte Linie stellt eine Falzänderung von 1 dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans at JoVE.com

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Dieses Protokoll beschreibt einen RNA-Interferenz- und ChIP-Assay zur Untersuchung der epigenetischen Vererbung von RNAi-induziertem Silencing und damit verbundenen Chromatinmodifikationen in C. elegans.

Analyse der transgenerationalen epigenetischen Vererbung in C. elegans mittels Fluoreszenzreporter und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

Die Forschung in unserem Labor untersucht, wie Chromatin-assoziierte Proteine, Histonmodifikationen und kleine RNA-Signalwegfaktoren im Zusammenhang mit der Entwicklung und der transgenerationalen epigenetischen Vererbung zusammenarbeiten. Der RNA-Vererbungsassay mit einem GFP-Reporter hat sich zu einem sehr leistungsfähigen Werkzeug entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Vorbereitung, Bewertung und Passage von Würmern sowie die Vorbereitung von ChIP-Proben standardisiert werden können, was dazu beitragen kann, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.Eine der experimentellen Herausforderungen bei der Untersuchung von Keimbahn-exprimierten Transgenen ist die Isolierung der Effekte in der Keimbahn des Tieres. Wir verwenden derzeit ganze Tiere für ChIP, aber in Zukunft möchten wir Assays entwickeln, um Chromatin, insbesondere in der Keimbahn, zu untersuchen. Unser Labor interessiert sich für die Histonmethylierung und Proteine, die diese Markierungen erkennen.In Zukunft möchten wir das Zusammenspiel zwischen diesen Chromatin-Readern und kleinen RNA-Signalwegen im Zusammenhang mit der RNAi-Vererbung an Transgenen und der Regulation endogener Sequenzen untersuchen.

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