Name: A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من خلال منح مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ (Z23H290001 ، LY19H280001) ؛ منح المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274364 و 81673607 و 81774011) ؛ بالإضافة إلى مشروع أبحاث الرفاهية العامة لمنحة هوتشو للعلوم والتكنولوجيا (2021GY49 ، 2018GZ24). نحن نقدر المساعدة الكبيرة والدعم الفني والدعم التجريبي من المنصة العامة لمركز البحوث الطبية ، أكاديمية العلوم الطبية الصينية ، جامعة تشجيانغ الطبية الصينية.

1. إعداد المواد
<ol><li>مزرعة 2 × 106 خلايا Panc02 في 12 مل من وسط DMEM (10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين) ، والحفاظ على 37 درجة مئوية ورطوبة 95٪ في جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء لمدة 48 ساعة.</li>
	<li>جمع خلايا Panc02 ، وأجهزة الطرد المركزي في 28 × غرام لمدة 2 دقي?...

3D Technique to Visualize Mitochondrial Cristae in Pancreatic Cancer Cells

الطريقة المعروضة هنا هي دليل مفيد خطوة بخطوة لتطبيق تقنية إعادة الإعمار 3D ، والتي تتضمن تطبيق المجهر الإلكتروني وتكنولوجيا معالجة الصور على تكديس وتجزئة الصور المقطعية 2D المتولدة من المقاطع التسلسلية فائقة النحافة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على قيود على صور 2D التي يمكن معالجتها من خلال ?...

الميتوكوندريا هي واحدة من أهم العضيات في الخلية. إنها بمثابة المحور المركزي للطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 1,2 وتلعب دورا مهما في السرطان3. سرطان البنكرياس (PC) هو واحد من أصعب أنواع السرطان4 لعلاج بسبب انتشاره السريع وارتفاع معدل الوفيات. تم ربط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والذي يحدث بشكل رئيسي بسبب التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا3،5،6،7 ، بآليات المرض الكامنة وراء PC8. الميتوكوندريا هي أيضا ديناميكية للغاية ، وهو ما ينعكس في التغييرات المتكررة والديناميكية في اتصال الشبكة وهيكل cristae9. يمكن أن تؤثر إعادة تشكيل بنية cristae بشكل مباشر على وظيفة الميتوكوندريا والحالة الخلوية 10,11 ، والتي تتغير بشكل كبير أثناء نمو الخلايا السرطانية ، ورم خبيث ، وتغيرات البيئة الدقيقة للورم 12,13.
في السنوات الأخيرة ، درس العلماء هذه العضية باستخدام مراقبة EM14،15،16،17 ؛ على سبيل المثال ، قام الباحثون بتحليل ديناميكيات الميتوكوندريا باستخدام تقنيات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد6،7،18،19. تم تأسيس المفهوم العام وطريقة إعادة بناء 3D لصور المجهر الإلكتروني رسميا في وقت مبكر من 196820 وتضمنت الجمع بين المجهر الإلكتروني وحيود الإلكترون ومعالجة صور الكمبيوتر لإعادة بناء ذيل العاثية T4. حتى الآن ، حققت تقنية التصوير المجهري الإلكتروني 3D تقدما كبيرا من حيث دقة الصورة 21 ، ودرجة الأتمتة22 ، وحجم المعالجة23 ، وقد تم استخدامها على نطاق واسع بشكل متزايد في البحوث البيولوجية ، من مستوى الأنسجة إلى مستوى البنية التحتية للعضيات على مقياسنانومتر 24. في السنوات الأخيرة ، أصبح التصوير المجهري الإلكتروني 3D أيضا تقنية واعدة لمجموعة واسعة من التطبيقات25،26،27.
يوضح الاهتمام المتزايد بكريستا الميتوكوندريا بشكل خاص المتطلبات الأساسية لتصوير حجم البنية الفائقة. تم استخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتصور العينات التي تم جمعها على شبكة نحاسية (400 شبكة)28 ، مع مرور حزمة الإلكترون عبر القسم. ومع ذلك ، نظرا للنطاق المحدود للشبكة النحاسية ، من المستحيل تصوير شرائح مستمرة من نفس العينة29 بشكل كامل. هذا يعقد دراسة الهياكل المستهدفة أثناء التصوير TEM. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد TEM على المهام اليدوية المستهلكة للوقت والمعرضة للخطأ ، بما في ذلك قص وجمع شرائح متعددة وتصويرها بالتتابع21 ، لذلك لا يتم تكييفه لإعادة بناء البنية التحتية للعينات كبيرةالحجم 23. في الوقت الحاضر ، يتم تحقيق إعادة بناء عالية الدقة لتصوير العينات كبيرة الحجم من خلال استخدام معدات متخصصة ، مثل صفيف كاميرا TEM (TEMCA) 30 أو نظامين من الجيل الثاني من TEMCA (TEMCA2) 31 ، مما يتيح التصوير الآلي عالي الإنتاجية في وقت قصير. ومع ذلك ، لا يتمتع هذا النوع من التصوير بسهولة الحصول عليه وعالمي بسبب متطلبات المعدات المخصصة.
بالمقارنة مع TEM ، فإن طريقة إنشاء الآلاف من الصور الحجمية التسلسلية تلقائيا لمناطق كبيرة استنادا إلى SEM 32,33 تعزز كفاءة وموثوقية التصوير التسلسلي وتوفر دقة z أعلى34. على سبيل المثال ، أتاح كل من المجهر الإلكتروني الماسح التسلسلي للوجه (SBF-SEM) والمجهر الإلكتروني الماسح الأيوني المركز (FIB-SEM) تحقيق إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبنية التحتية بسرعة عالية وكفاءة ودقة35,36. ومع ذلك ، فمن المحتم أن يتم حلق سطح الكتلة ميكانيكيا بواسطة سكين الماس في SBF-SEM أو عن طريق الطحن باستخدام الحزمة الأيونية المركزة ل FIB-SEM33,37. نظرا لتدمير الطريقتين للعينات ، لا يمكن إعادة بناء نفس الهيكل المستهدف مرة أخرى لمزيد من التحليل38،39،40. بالإضافة إلى ذلك ، حاولت دراسات قليلة إعادة بناء البنية التحتية للعضيات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية باستخدام EM لمراقبة التغيرات المرضية12. لهذه الأسباب ، من أجل زيادة توضيح الآليات المرضية للخلايا السرطانية ، مثل خلايا سرطان البنكرياس ، نقترح تقنية جديدة لإعادة بناء 3D لصور المقطع التسلسلي باستخدام المجهر الفائق والمجهر الإلكتروني الماسح للانبعاثات الميدانية (FE-SEM) لتحليل البنية التحتية للميتوكوندريا على مستوى cristae ؛ باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على بيانات عالية الدقة باستخدام طريقة فعالة ويمكن الوصول إليها. يمكن تخزين المقاطع التسلسلية فائقة النحافة المصنوعة باستخدام ultramicrotome بشكل شبه دائم في علبة شبكية وإعادة تصويرها عدة مرات ، حتى بعد عدة سنوات41. تحظى FE-SEM بتقدير كبير كأداة في مختلف المجالات البحثية نظرا لقدرتها على توفير تصوير عالي الدقة وتكبير عالي وتعدد الاستخدامات42. في محاولة لعرض البنية الدقيقة للعضيات في 3D ، يمكن أيضا استخدام تقنية إنتاج مكدسات صور 2D التسلسلية بدقة مفيدة باستخدام الإلكترونات المبعثرة الخلفية التي تنتجها FE-SEM 43,44 لتحقيق تصوير عالي الإنتاجية ومتعدد المقاييس للمناطق المستهدفة أو الهياكل المرتبطة بها بدون معدات خاصة 45. يؤثر إنشاء القطع الأثرية المشحونة بشكل مباشر على جودة الصور التي تم الحصول عليها ، لذلك من المهم بشكل خاص الحفاظ على وقت المكوث قصيرا.
وهكذا ، توضح الدراسة الحالية الإجراءات التجريبية المستخدمة في تقنية SEM هذه لإعادة بناء بنية 3D لكريستي الميتوكوندريا46. على وجه التحديد ، نعرض العملية التي تم تطويرها لتحقيق التجزئة شبه التلقائية لمناطق الميتوكوندريا ورقمنة إعادة الإعمار 3D باستخدام برنامج Amira ، والذي يتضمن أيضا عمل عينات شرائح باستخدام طريقة تحضير عينة OTO التقليدية44,47 ، واستكمال مجموعة الأقسام باستخدام تشريح ultramicrotome ، والحصول على بيانات 2D متسلسلة بواسطة FE-SEM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

إن فهم السمات الديناميكية للبنية الفائقة لعضية الخلية ، والتي ليست غنية بالمعلومات غير المعروفة فحسب ، بل متطورة أيضا من منظور ثلاثي الأبعاد (3D) ، أمر بالغ الأهمية للدراسات الميكانيكية. يوفر المجهر الإلكتروني (EM) عمق تصوير جيد ويسمح بإعادة بناء مكدسات الصور عالية الدقة للتحقيق في التشكل الفائق للعضيات الخلوية حتى على مقياس النانومتر. لذلك ، تكتسب إعادة الإعمار 3D أهمية بسبب مزاياها التي لا تضاهى. يوفر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) تقنية الحصول على الصور عالية الإنتاجية التي تسمح بإعادة بناء الهياكل الكبيرة في 3D من نفس المنطقة ذات الاهتمام في شرائح متتالية. لذلك ، أصبح تطبيق SEM في إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع لاستعادة البنية التحتية ثلاثية الأبعاد الحقيقية للعضيات شائعا بشكل متزايد. في هذا البروتوكول ، نقترح مزيجا من المقطع التسلسلي فائق النحافة وتقنيات إعادة البناء 3D لدراسة cristae الميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس. يتم وصف تفاصيل كيفية تنفيذ هذه التقنيات في هذا البروتوكول بطريقة خطوة بخطوة ، بما في ذلك طريقة الأوزميوم - ثيوكربوهيدرازيد - الأوزميوم (OTO) ، والتصوير التسلسلي للمقطع فائق النحافة ، وعرض التصور.

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

أثناء زراعة الخلايا (الشكل 1 أ) ، قمنا أولا بتقسيم خلايا سرطان البنكرياس إلى مجموعة تحكم مستزرعة بوسط زراعة كامل ، ومجموعة (1S ، 3R) -RSL348 (RSL3 ، منشط فيروبتوسيس ، 100 نانومتر) ، ومجموعة RSL3 (100 نانومتر) بالإضافة إلى فيروستاتين -149 (Fer-1 ، مثبط داء الحديديات ، 100 ...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE 

يصف هذا البروتوكول كيفية إعادة بناء cristae الميتوكوندريا لتحقيق التصوير 3D بدقة عالية ودقة عالية وإنتاجية عالية.

تقنية ثلاثية الأبعاد لتصور التغيرات الهيكلية للميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

يهدف هذا المشروع إلى مراجعة التأثير المضاد للسرطان للأدوية عن طريق تغيير البنية على مستوى مقياس النانو تحت الخلوي ، وإنشاء صلة بين مورفولوجيا العضيات وآلية أمراض السرطان. تجمع هذه التقنية بين تقنية المجهر الإلكتروني التقليدية وتقنية إعادة البناء ثلاثية الأبعاد بدون معدات خاصة. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى ، يمكنه تحسين كفاءة التصوير ومرونة إعادة البناء ، وإعادة بناء الحياة الحقيقية للهياكل المستهدفة في أي وقت.لذلك فهي سهلة للغاية وعالمية. يمكن لهذه التقنية لإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد للشرائح الرقيقة للغاية المستمرة استعادة المادة الكيميائية المجسمة الحقيقية بشكل متكرر دون معدات باهظة الثمن محددة. يمكن استخدامه للتحليل النوعي والكمي لجميع العضيات في أي وقت.إنه يدرك سهولة تشغيل المراقبة.