Name: A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of Zhejiang Province (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China subsidies (82274364, 81673607 en 81774011); evenals het Public Welfare Research Project van Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). We waarderen de geweldige hulp, technische ondersteuning en experimentele ondersteuning van het Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.

1. Materiaalvoorbereiding
<ol><li>Kweek 2 x 106 Panc02-cellen in 12 ml DMEM-medium (10% foetaal runderserum en 100 U / ml penicilline-streptomycine) en houd gedurende 48 uur op 37 °C en 95% vochtigheid in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 95% lucht.</li>
	<li>Verzamel Panc02-cellen, centrifugeer gedurende 2 minuten op 28 x g en gooi het supernatant vervolgens weg. Zorg ervoor dat het monster de juiste grootte heeft (1 x 107 cellen), omdat anders de volgende fixatie...

3D Technique to Visualize Mitochondrial Cristae in Pancreatic Cancer Cells

De hier gepresenteerde methode is een nuttige stapsgewijze handleiding voor het toepassen van de 3D-reconstructietechniek, waarbij elektronenmicroscopie en beeldverwerkingstechnologie worden toegepast op het stapelen en segmenteren van 2D-tomografische beelden die zijn gegenereerd uit seriële ultradunne secties. Dit protocol benadrukt een beperking van 2D-beelden die kunnen worden aangepakt door 3D-visualisatie van de organel-ultrastructuur, wat de voordelen heeft van een sterke reproduceerbaarheid van de structuren op ...

Mitochondriën zijn een van de belangrijkste organellen in de cel. Ze dienen als de centrale hub van cellulaire bio-energetica en metabolisme 1,2 en spelen een cruciale rol bij kanker3. Alvleesklierkanker (PC) is een van de moeilijkste kankers4 om te behandelen vanwege de snelle verspreiding en het hoge sterftecijfer. Mitochondriale disfunctie, die voornamelijk wordt veroorzaakt door veranderingen in de mitochondriale morfologie 3,5,6,7, is in verband gebracht met de ziektemechanismen die ten grondslag liggen aan PC8. Mitochondriën zijn ook zeer dynamisch, wat wordt weerspiegeld door de frequente en dynamische veranderingen in hun netwerkconnectiviteit en cristae-structuur9. De hervorm van de cristae-structuur kan rechtstreeks van invloed zijn op de mitochondriale functie en cellulaire toestand 10,11, die aanzienlijk worden veranderd tijdens tumorcelgroei, metastase en tumormicro-omgevingsveranderingen 12,13.
In de afgelopen jaren hebben wetenschappers dit organel bestudeerd met behulp van EM-observatie14,15,16,17; onderzoekers hebben bijvoorbeeld de mitochondriale dynamiek geanalyseerd met behulp van 3D-reconstructietechnieken 6,7,18,19. Het algemene concept en de methode voor de 3D-reconstructie van elektronenmicroscopiebeelden werden al in 1968 formeel vastgesteld20 en omvatten het combineren van elektronenmicroscopie, elektronendiffractie en computerbeeldverwerking om de T4-faagstaart te reconstrueren. Tot nu toe heeft de 3D-beeldvormingstechnologie voor elektronenmicroscopie aanzienlijke vooruitgang geboekt in termen van beeldresolutie 21, mate van automatisering 22 en verwerkingsvolume23 en is het op steeds grotere schaal gebruikt in biologisch onderzoek, van weefselniveau tot organel ultrastructuurniveau op nanometerschaal24. In de afgelopen jaren is elektronenmicroscopie 3D-beeldvorming ook een veelbelovende technologie geworden voor een breed scala aan toepassingen25,26,27.
De groeiende aandacht voor mitochondriale cristae illustreert vooral de essentiële vereisten voor ultrastructurele volumebeeldvorming. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is gebruikt om monsters te visualiseren die zijn verzameld op een koperen rooster (400 mesh)28, waarbij de elektronenbundel door de sectie gaat. Vanwege het beperkte bereik van het koperen rooster is het echter onmogelijk om continue segmenten van hetzelfde monster volledig in beeld te brengen29. Dit bemoeilijkt de studie van doelstructuren tijdens TEM-beeldvorming. Bovendien vertrouwt TEM op tijdrovende en foutgevoelige handmatige taken, waaronder het snijden en verzamelen van meerdere plakjes en deze sequentieel in beeld brengen21, zodat het niet is aangepast voor ultrastructurele reconstructies van monsters met een groot volume23. Op dit moment wordt de reconstructie met hoge resolutie van grootvolume-beeldvorming bereikt door het gebruik van gespecialiseerde apparatuur, zoals de TEM-camera-array (TEMCA)30 of twee TEMCA-systemen van de tweede generatie (TEMCA2)31, die geautomatiseerde high-throughput imaging in korte tijd mogelijk maken. Dit type beeldvorming heeft echter niet het voordeel dat het gemakkelijk te verkrijgen en universeel is vanwege de vereiste voor aangepaste apparatuur.
In vergelijking met TEM verbetert de methode voor het automatisch genereren van duizenden seriële volumetrische beelden voor grote gebieden op basis van SEM 32,33 de efficiëntie en betrouwbaarheid van seriële beeldvorming en levert hogere z-resoluties34. Bijvoorbeeld, seriële block-face scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM) en gefocusseerde ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM) hebben het beide mogelijk gemaakt om de 3D-reconstructie van ultrastructuur te bereiken met hoge snelheid, efficiëntie en resolutie35,36. Het is echter onvermijdelijk dat het blokoppervlak mechanisch wordt afgeschoren door het diamantmes van de SBF-SEM of door te frezen met de gefocusseerde ionenbundel van FIB-SEM33,37. Vanwege de destructiviteit van de twee methoden voor de monsters, is het niet mogelijk om dezelfde doelstructuur opnieuw te reconstrueren voor verdere analyse38,39,40. Bovendien hebben weinig studies geprobeerd om de 3D-organel-ultrastructuur van kankercellen te reconstrueren met behulp van EM om pathologische veranderingen te observeren12. Om deze redenen, om de pathologische mechanismen van kankercellen, zoals alvleesklierkankercellen, verder op te helderen, stellen we een nieuwe technologie voor voor de 3D-reconstructie van seriële sectiebeelden met behulp van een ultramicrotoom en een veldemissiescanning elektronenmicroscoop (FE-SEM) om de mitochondriale ultrastructuur op cristae-niveau te analyseren; Met deze technologie kunnen gegevens met een hoge resolutie worden verkregen met behulp van een efficiënte en toegankelijke methode. De seriële ultradunne secties gemaakt met behulp van een ultramicrotoom kunnen semi-permanent worden opgeslagen in een rasterbehuizing en meerdere keren opnieuw worden afgebeeld, zelfs na enkele jaren41. FE-SEM wordt zeer gewaardeerd als een hulpmiddel in verschillende onderzoeksgebieden vanwege het vermogen om beeldvorming met hoge resolutie, hoge vergroting en veelzijdigheid te bieden42. In een poging om de fijne structuur van organellen in 3D weer te geven, kan de techniek voor het produceren van seriële 2D-beeldstapels met nuttige resolutie met behulp van terugverstrooide elektronen geproduceerd door FE-SEM 43,44 ook worden gebruikt om hoge doorvoer en multi-scale beeldvorming van doelgebieden of hun bijbehorende structuren te bereiken zonder speciale apparatuur 45. Het genereren van ladingartefacten heeft direct invloed op de kwaliteit van de verkregen afbeeldingen, dus het is vooral belangrijk om de verblijftijd kort te houden.
De huidige studie gaat dus dieper in op de experimentele procedures die in deze SEM-techniek worden gebruikt om de 3D-structuur van mitochondriale cristae46 te reconstrueren. In het bijzonder tonen we het proces dat is ontwikkeld om de semi-automatische segmentatie van mitochondriale regio's te bereiken en de 3D-reconstructie te digitaliseren met behulp van Amira-software, waarbij ook slice-monsters worden gemaakt met behulp van de conventionele OTO-monstervoorbereidingsmethode44,47, de sectieverzameling wordt voltooid met behulp van ultramicrotoomsegmentering en sequentiële 2D-gegevens worden verkregen door FE-SEM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

Het begrijpen van de dynamische kenmerken van de ultrastructuur van het celorganel, die niet alleen rijk is aan onbekende informatie, maar ook geavanceerd vanuit een driedimensionaal (3D) perspectief, is van cruciaal belang voor mechanistische studies. Elektronenmicroscopie (EM) biedt een goede beelddiepte en maakt de reconstructie van beeldstapels met hoge resolutie mogelijk om de ultrastructurele morfologie van cellulaire organellen te onderzoeken, zelfs op nanometerschaal; daarom wint 3D-reconstructie aan belang vanwege de onvergelijkbare voordelen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) biedt een high-throughput beeldacquisitietechnologie die het mogelijk maakt om grote structuren in 3D te reconstrueren vanuit hetzelfde interessegebied in opeenvolgende segmenten. Daarom wordt de toepassing van SEM in grootschalige 3D-reconstructie om de echte 3D-ultrastructuur van organellen te herstellen steeds gebruikelijker. In dit protocol stellen we een combinatie van seriële ultradunne sectie en 3D-reconstructietechnieken voor om mitochondriale cristae in pancreaskankercellen te bestuderen. De details van hoe deze technieken worden uitgevoerd, worden in dit protocol stapsgewijs beschreven, inclusief de osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) -methode, de seriële ultradunne sectiebeeldvorming en de visualisatieweergave.

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Tijdens de celkweek (figuur 1A) verdeelden we de alvleesklierkankercellen eerst in een controlegroep gekweekt met volledig kweekmedium, een (1S,3R)-RSL348 (RSL3, een ferroptose-activator, 100 nM) groep, en een RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, een ferroptoseremmer, 100 nM) groep. Door de bovenstaande experimentele stappen verkreeg de scanning elektronenmicroscoop 38 (aanvullende figuur 1), 43 (aanvullende figuur 2) en 44 (aanv...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE 

Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale cristae kan worden gereconstrueerd om 3D-beeldvorming te bereiken met hoge nauwkeurigheid, hoge resolutie en hoge doorvoer.

Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Dit project heeft tot doel het antikankereffect van geneesmiddelen te beoordelen door de structuur op subcellulair nanoschaalniveau te veranderen en het verband te leggen tussen organelmorfologie en het pathologische mechanisme van kanker. Deze technologie combineert traditionele elektronenmicroscopietechnologie met driedimensionale reconstructietechnologie zonder speciale apparatuur. In vergelijking met andere technieken kan het de beeldvormingsefficiëntie en de reconstructieflexibiliteit verbeteren, en de real-life reconstructie van doelstructuren op elk moment.Het is dus zeer eenvoudig en universeel. Deze technologie van driedimensionale reconstructie van de continue ultradunne dia's kan herhaaldelijk de echte stereochemische stof herstellen zonder specifieke dure apparatuur. Het kan worden gebruikt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van alle organellen op elk moment.Het realiseert de eenvoudige werking van observatie.