Name: A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82274364, 81673607 et 81774011); ainsi que le projet de recherche sur le bien-être public de la subvention scientifique et technologique de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Nous apprécions l’aide, le soutien technique et le soutien expérimental de la plate-forme publique du Centre de recherche médicale, de l’Académie des sciences médicales chinoises, de l’Université médicale chinoise du Zhejiang.

1. Préparation du matériel
<ol><li>Culture de 2 x 106 cellules Panc02 dans 12 mL de milieu DMEM (10 % de sérum fœtal bovin et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine), et maintenir à 37 °C et 95 % d’humidité dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air pendant 48 h.</li>
	<li>Recueillir les cellules Panc02, centrifuger à 28 x g pendant 2 min, puis jeter le surnageant. Assurez-vous que l’échantillon est d’une taille appropriée (1 x 107 c...

3D Technique to Visualize Mitochondrial Cristae in Pancreatic Cancer Cells

La méthode présentée ici est un guide étape par étape utile pour appliquer la technique de reconstruction 3D, qui implique l’application de la microscopie électronique et de la technologie de traitement d’images à l’empilement et à la segmentation d’images tomographiques 2D générées à partir de sections ultraminces en série. Ce protocole met en évidence une limitation des images 2D qui peut être abordée par la visualisation 3D de l’ultrastructure de l’organite, qui présente les avantages d’...

Les mitochondries sont l’un des organites les plus importants de la cellule. Ils servent de plaque tournante de la bioénergétique cellulaire et du métabolisme 1,2 et jouent un rôle essentiel dans le cancer3. Le cancer du pancréas (CP) est l’un des cancers les plus difficiles àtraiter4 en raison de sa propagation rapide et de son taux de mortalité élevé. Le dysfonctionnement mitochondrial, qui est principalement causé par des changements dans la morphologie mitochondriale 3,5,6,7, a été lié aux mécanismes de la maladie sous-jacents PC8. Les mitochondries sont également très dynamiques, ce qui se reflète dans les changements fréquents et dynamiques de leur connectivité réseau et de leur structurecritique 9. Le remodelage de la structure des cristae peut avoir un impact direct sur la fonction mitochondriale et l’état cellulaire 10,11, qui sont considérablement modifiés au cours de la croissance des cellules tumorales, des métastases et des changements du microenvironnement tumoral 12,13.
Ces dernières années, les scientifiques ont étudié cet organite en utilisant l’observation EM14,15,16,17; par exemple, les chercheurs ont analysé la dynamique mitochondriale à l’aide de techniques de reconstruction 3D 6,7,18,19. Le concept général et la méthode de reconstruction 3D d’images de microscopie électronique ont été formellement établis dès 196820 et impliquaient la combinaison de la microscopie électronique, de la diffraction électronique et du traitement d’images par ordinateur pour reconstruire la queue du phage T4. Jusqu’à présent, la technologie d’imagerie 3D par microscopie électronique a fait des progrès significatifs en termes de résolution d’image21, de degré d’automatisation 22 et de volume de traitement 23 et a été utilisée à une échelle de plus en plus large dans la recherche biologique, du niveau tissulaire à l’ultrastructure des organites à l’échelle nanométrique24. Ces dernières années, l’imagerie 3D par microscopie électronique est également devenue une technologie prometteuse pour un large éventail d’applications25,26,27.
L’attention croissante portée aux cristae mitochondriales illustre particulièrement les exigences essentielles de l’imagerie ultrastructurale du volume. La microscopie électronique à transmission (MET) a été utilisée pour visualiser des échantillons prélevés sur une grille de cuivre (400 mesh)28, le faisceau d’électrons traversant la section. Cependant, en raison de la portée limitée de la grille de cuivre, il est impossible d’imager complètement des tranches continues du même échantillon29. Cela complique l’étude des structures cibles lors de l’imagerie TEM. De plus, la GDT repose sur des tâches manuelles longues et sujettes aux erreurs, y compris la découpe et la collecte de plusieurs tranches et leur imagerie séquentielle21, de sorte qu’elle n’est pas adaptée aux reconstructions ultrastructurales d’échantillons de grand volume23. À l’heure actuelle, la reconstruction à haute résolution d’échantillons d’échantillons de grand volume est réalisée grâce à l’utilisation d’équipement spécialisé, comme le réseau de caméras TEM (TEMCA)30 ou deux systèmes TEMCA de deuxième génération (TEMCA2)31, qui permettent d’obtenir rapidement des images automatisées à haut débit. Cependant, ce type d’imagerie n’a pas l’avantage d’être facile à obtenir et universel en raison de la nécessité d’un équipement personnalisé.
Par rapport à la TEM, la méthode de génération automatique de milliers d’images volumétriques série pour de grandes surfaces basée sur SEM32,33 améliore l’efficacité et la fiabilité de l’imagerie série et offre des résolutions z34 plus élevées. Par exemple, la microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBF-SEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) ont toutes deux permis de réaliser la reconstruction 3D de l’ultrastructure avec une vitesse, une efficacité et une résolution élevées35,36. Cependant, il est inévitable que la surface du bloc soit rasée mécaniquement par le couteau diamanté du SBF-SEM ou par fraisage avec le faisceau d’ions focalisé de FIB-SEM33,37. En raison du caractère destructeur des deux méthodes pour les échantillons, il n’est pas possible de reconstruire la même structure cible pour une analyse plus approfondie38,39,40. De plus, peu d’études ont tenté de reconstruire l’ultrastructure 3D des organites des cellules cancéreuses en utilisant EM pour observer des changements pathologiques12. Pour ces raisons, afin d’élucider davantage les mécanismes pathologiques des cellules cancéreuses, telles que les cellules cancéreuses du pancréas, nous proposons une nouvelle technologie pour la reconstruction 3D d’images de coupe en série à l’aide d’un ultramicrotome et d’un microscope électronique à balayage par émission de champ (FE-SEM) pour analyser l’ultrastructure mitochondriale au niveau des crêtes; Grâce à cette technologie, des données haute résolution peuvent être acquises à l’aide d’une méthode efficace et accessible. Les sections ultraminces en série réalisées à l’aide d’un ultramicrotome peuvent être stockées de manière semi-permanente dans un boîtier de grille et réimagées plusieurs fois, même après plusieurs années41. FE-SEM est un outil très apprécié dans divers domaines de recherche en raison de sa capacité à fournir une imagerie haute résolution, un grossissement élevé et une polyvalence42. Dans une tentative d’afficher la structure fine des organites en 3D, la technique de production d’empilements d’images 2D en série avec une résolution utile en utilisant des électrons rétrodiffusés produits par FE-SEM 43,44 peut également être utilisée pour obtenir une imagerie à haut débit et multi-échelle des régions cibles ou de leurs structures associées sans équipement spécial 45. La génération d’artefacts de charge affecte directement la qualité des images acquises, il est donc particulièrement important de garder le temps de séjour court.
Ainsi, la présente étude développe les procédures expérimentales employées dans cette technique SEM pour reconstruire la structure 3D des cristae mitochondriales46. Plus précisément, nous montrons le processus développé pour réaliser la segmentation semi-automatique des régions mitochondriales et numériser la reconstruction 3D à l’aide du logiciel Amira, ce qui implique également de faire des échantillons de tranches en utilisant la méthode conventionnelle de préparation des échantillons OTO44,47, de compléter la collection de sections en utilisant le découpage ultramicrotome et d’acquérir des données 2D séquentielles par FE-SEM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

Comprendre les caractéristiques dynamiques de l’ultrastructure de l’organite cellulaire, qui est non seulement riche en informations inconnues, mais aussi sophistiquée d’un point de vue tridimensionnel (3D), est essentiel pour les études mécanistes. La microscopie électronique (EM) offre une bonne profondeur d’imagerie et permet la reconstruction d’empilements d’images à haute résolution pour étudier la morphologie ultrastructurale des organites cellulaires, même à l’échelle nanométrique; par conséquent, la reconstruction 3D gagne en importance en raison de ses avantages incomparables. La microscopie électronique à balayage (MEB) fournit une technologie d’acquisition d’images à haut débit qui permet de reconstruire de grandes structures en 3D à partir de la même région d’intérêt dans des tranches consécutives. Par conséquent, l’application du MEB dans la reconstruction 3D à grande échelle pour restaurer la véritable ultrastructure 3D des organites devient de plus en plus courante. Dans ce protocole, nous suggérons une combinaison de coupes ultraminces en série et de techniques de reconstruction 3D pour étudier les cristae mitochondriales dans les cellules cancéreuses du pancréas. Les détails de la façon dont ces techniques sont exécutées sont décrits dans ce protocole étape par étape, y compris la méthode osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), l’imagerie en série de la section ultramince et l’affichage de visualisation.

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Au cours de la culture cellulaire (Figure 1A), nous avons d’abord divisé les cellules cancéreuses du pancréas en un groupe témoin cultivé avec un milieu de culture complet, un groupe (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activateur de la ferroptose, 100 nM) et un groupe RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-149 (Fer-1, un inhibiteur de la ferroptose, 100 nM). Grâce aux étapes expérimentales ci-dessus, le microscope électronique à balayage a acquis 38 ...

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A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE 

Ce protocole décrit comment reconstruire des cristae mitochondriales pour obtenir une imagerie 3D avec une grande précision, une haute résolution et un débit élevé.

Une technique tridimensionnelle pour la visualisation des changements ultrastructuraux mitochondriaux dans les cellules cancéreuses du pancréas

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Ce projet vise à examiner l’effet anticancéreux des médicaments en modifiant la structure à l’échelle nanométrique subcellulaire et en établissant le lien entre la morphologie des organites et le mécanisme pathologique du cancer. Cette technologie combine la technologie traditionnelle de microscopie électronique avec la technologie de reconstruction tridimensionnelle sans équipement spécial. Par rapport à d’autres techniques, il peut améliorer l’efficacité de l’imagerie et la flexibilité de reconstruction, ainsi que la reconstruction réelle des structures cibles à tout moment.C’est donc très facile et universel. Cette technologie de reconstruction tridimensionnelle des lames ultra-minces continues peut restaurer à plusieurs reprises le stéréochimique réel sans équipement spécifique coûteux. Il peut être utilisé pour l’analyse qualitative et quantitative de tous les organites à tout moment.Il réalise le fonctionnement facile de l’observation.