Name: A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

Bu araştırma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (Z23H290001, LY19H280001) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (82274364, 81673607 ve 81774011); Huzhou Bilim ve Teknoloji Hibesi'nin Kamu Refahı Araştırma Projesi'nin yanı sıra (2021GY49, 2018GZ24). Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Tıbbi Araştırma Merkezi Kamu Platformu'ndan gelen büyük yardım, teknik destek ve deneysel destek için teşekkür ederiz.

1. Malzeme hazırlığı
<ol><li>12 mL DMEM ortamında (%10 fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin-streptomisin) 2 x 106 Panc02 hücresini kültürleyin ve 48 saat boyunca %5 karbondioksit ve %95 hava atmosferinde 37 °C ve %95 nemde muhafaza edin.</li>
	<li>Panc02 hücrelerini toplayın, 28 x g'de 2 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Numunenin uygun boyutta (1 x 107 hücre) olduğundan emin olun, aksi takdirde aşağıdaki fiksasyon ve dehidras...

3D Technique to Visualize Mitochondrial Cristae in Pancreatic Cancer Cells

Burada sunulan yöntem, seri ultra ince kesitlerden oluşturulan 2D tomografik görüntülerin istiflenmesine ve segmentasyonuna elektron mikroskobu ve görüntü işleme teknolojisinin uygulanmasını içeren 3D rekonstrüksiyon tekniğini uygulamak için adım adım yararlı bir kılavuzdur. Bu protokol, yapıların yüksek çözünürlük düzeyinde güçlü tekrarlanabilirliği ve daha yüksek doğrulukta avantajlarına sahip olan organel üst yapısının 3D görselleştirilmesi ile ele alınabilecek 2D görüntüle...

Mitokondri, hücredeki en önemli organellerden biridir. Hücresel biyoenerjetik ve metabolizmanın merkezi olarak hizmet ederler 1,2 ve kanserde kritik bir rol oynarlar3. Pankreas kanseri (PK), hızlı yayılımı ve yüksek ölüm oranı nedeniyle tedavisi en zor kanserlerdenbiridir. Esas olarak mitokondriyal morfolojideki 3,5,6,7 değişikliklerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyon, PC8'in altında yatan hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendirilmiştir. Mitokondriler de oldukça dinamiktir, bu da ağ bağlantılarındaki ve cristae yapılarındaki sık ve dinamik değişikliklerle yansıtılır9. Cristae yapısının yeniden şekillendirilmesi, tümör hücresi büyümesi, metastaz ve tümör mikroçevre değişiklikleri sırasında önemli ölçüde değişen mitokondriyal fonksiyonu vehücresel durumu 10,11 doğrudan etkileyebilir12,13.
Son yıllarda, bilim adamları bu organeli EM gözlemi14,15,16,17; örneğin, araştırmacılar 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak mitokondriyal dinamiklerianaliz ettiler 6,7,18,19. Elektron mikroskobu görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için genel konsept ve yöntem resmi olarak 196820 gibi erken bir tarihte oluşturuldu ve T4 faj kuyruğunu yeniden yapılandırmak için elektron mikroskobu, elektron kırınımı ve bilgisayar görüntü işlemenin birleştirilmesini içeriyordu. Şimdiye kadar, elektron mikroskobu 3D görüntüleme teknolojisi, görüntü çözünürlüğü 21, otomasyon derecesi22 ve işlem hacmi 23 açısından önemli ilerlemeler kaydetmiş ve biyolojik araştırmalarda doku seviyesinden nanometre ölçeğindeorganel ultrayapı seviyesine kadar giderek daha geniş bir ölçekte kullanılmaktadır24. Son yıllarda, elektron mikroskobu 3D görüntüleme de çok çeşitli uygulamalar için umut verici bir teknoloji haline gelmiştir25,26,27.
Mitokondriyal kristalara artan ilgi, özellikle ultrastrüktürel hacim görüntüleme için temel gereksinimleri göstermektedir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), bir bakır ızgara (400 mesh)28 üzerinde toplanan numuneleri, kesitten geçen elektron ışını ile görselleştirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bakır ızgaranın sınırlı aralığı nedeniyle, aynı numunenin sürekli dilimlerini tam olarak görüntülemekimkansızdır 29. Bu, TEM görüntüleme sırasında hedef yapıların incelenmesini zorlaştırır. Ek olarak, TEM, birden fazla dilimin kesilmesi ve toplanması ve bunların sırayla görüntülenmesi21 dahil olmak üzere zaman alıcı ve hataya açık manuel görevlere dayanır, bu nedenle büyük hacimli numunelerin ultrastrüktürel rekonstrüksiyonları için uyarlanmamıştır23. Şu anda, büyük hacimli numune görüntülemenin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonu, TEM kamera dizisi (TEMCA)30 veya iki ikinci nesil TEMCA sistemi (TEMCA2)31 gibi kısa sürede otomatik yüksek verimli görüntülemeye olanak tanıyan özel ekipmanların kullanılmasıyla gerçekleştirilmektedir. Bununla birlikte, bu tür görüntüleme, özelleştirilmiş ekipman gereksinimi nedeniyle elde edilmesi kolay ve evrensel olma avantajına sahip değildir.
TEM ile karşılaştırıldığında, SEM32,33'e dayalı geniş alanlar için otomatik olarak binlerce seri hacimsel görüntü oluşturma yöntemi, seri görüntülemenin verimliliğini ve güvenilirliğini artırır ve daha yüksek z-çözünürlükleri sunar 34. Örneğin, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) ve odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM), yüksek hız, verimlilik veçözünürlük 35,36 ile ultrayapının 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır. Bununla birlikte, blok yüzeyinin SBF-SEM'in elmas bıçağı ile veya FIB-SEM33,37'nin odaklanmış iyon ışını ile frezelenerek mekanik olarak traşlanması kaçınılmazdır. İki yöntemin numunelere zarar vermesi nedeniyle, daha fazla analiz için aynı hedef yapıyı tekrar oluşturmak mümkün değildir38,39,40. Ek olarak, az sayıda çalışma, patolojik değişiklikleri gözlemlemek için EM kullanarak kanser hücrelerinin 3D organel ultrayapısını yeniden yapılandırmaya çalışmıştır12. Bu nedenlerden dolayı, pankreas kanseri hücreleri gibi kanser hücrelerinin patolojik mekanizmalarını daha fazla aydınlatmak için, mitokondriyal üst yapıyı kristae seviyesinde analiz etmek için bir ultramikrotom ve bir alan emisyon taramalı elektron mikroskobu (FE-SEM) kullanarak seri kesit görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için yeni bir teknoloji öneriyoruz; Bu teknoloji ile verimli ve erişilebilir bir yöntem kullanılarak yüksek çözünürlüklü veriler elde edilebilir. Bir ultramikrotom kullanılarak yapılan seri ultra ince kesitler, bir ızgara kutusunda yarı kalıcı olarak saklanabilir ve birkaç yıl sonra bile birden çok kez yeniden görüntülenebilir41. FE-SEM, yüksek çözünürlüklü görüntüleme, yüksek büyütme ve çok yönlülük sağlama yeteneği nedeniyle çeşitli araştırma alanlarında bir araç olarak oldukça değerlidir42. Organellerin ince yapısını 3D olarak sergilemek amacıyla, FE-SEM43,44 tarafından üretilen geri saçılan elektronları kullanarak faydalı çözünürlüğe sahip seri 2D görüntü yığınları üretme tekniği, özel ekipman olmadan hedef bölgelerin veya bunlarla ilişkili yapıların yüksek verimli ve çok ölçekli görüntülemesini elde etmek için de kullanılabilir 45. Yük artefaktlarının oluşturulması, elde edilen görüntülerin kalitesini doğrudan etkiler, bu nedenle bekleme süresini kısa tutmak özellikle önemlidir.
Bu nedenle, bu çalışma, mitokondriyal cristae46'nın 3 boyutlu yapısını yeniden yapılandırmak için bu SEM tekniğinde kullanılan deneysel prosedürleri detaylandırmaktadır. Spesifik olarak, mitokondriyal bölgelerin yarı otomatik segmentasyonunu elde etmek ve geleneksel OTO numune hazırlama yöntemi44,47 kullanılarak dilim numuneleri yapmayı da içeren Amira yazılımını kullanarak 3D rekonstrüksiyonu dijitalleştirmek için geliştirilen süreci gösteriyoruz, ultramikrotom dilimleme kullanarak kesit koleksiyonunu tamamlama ve FE-SEM ile sıralı 2D veriler elde etme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

Sadece bilinmeyen bilgiler açısından zengin değil, aynı zamanda üç boyutlu (3D) bir bakış açısıyla da sofistike olan hücre organeli üst yapısının dinamik özelliklerinin anlaşılması, mekanik çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Elektron mikroskobu (EM) iyi bir görüntüleme derinliği sunar ve nanometre ölçeğinde bile hücresel organellerin ultrastrüktürel morfolojisini araştırmak için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarının yeniden yapılandırılmasına izin verir; bu nedenle, 3D rekonstrüksiyon, eşsiz avantajları nedeniyle önem kazanmaktadır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), aynı ilgi bölgesinden büyük yapıların ardışık dilimler halinde 3D olarak yeniden yapılandırılmasına olanak tanıyan yüksek verimli bir görüntü elde etme teknolojisi sağlar. Bu nedenle, organellerin gerçek 3D ultrayapısını eski haline getirmek için büyük ölçekli 3D rekonstrüksiyonda SEM uygulaması giderek daha yaygın hale geliyor. Bu protokolde, pankreas kanseri hücrelerinde mitokondriyal kristaları incelemek için seri ultra ince kesit ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerinin bir kombinasyonunu öneriyoruz. Bu tekniklerin nasıl uygulandığının ayrıntıları, osmiyum-tiyokarbohidrazid-osmiyum (OTO) yöntemi, seri ultra ince kesit görüntüleme ve görselleştirme ekranı dahil olmak üzere bu protokolde adım adım açıklanmaktadır.

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Hücre kültürü sırasında (Şekil 1A), önce pankreas kanseri hücrelerini tam kültür ortamı ile kültürlenmiş bir kontrol grubuna, bir (1S, 3R)-RSL348 (RSL3, bir ferroptoz aktivatörü, 100 nM) grubuna ve bir RSL3 (100 nM) artı ferrostatin-149 (Fer-1, bir ferroptoz inhibitörü, 100 nM) grubuna ayırdık. Yukarıdaki deneysel adımlar sayesinde, taramalı elektron mikroskobu kontrol grubu, RSL3 grubu ve inhibitör grubu (RSL3 + Fer-1...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells (Video) | JoVE 

Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Bu proje, ilaçların anti-kanser etkisini, hücre altı nano ölçekte yapıyı değiştirerek ve organel morfolojisi ile kanser patolojik mekanizması arasındaki bağlantıyı kurarak gözden geçirmeyi amaçlamaktadır. Bu teknoloji, geleneksel elektron mikroskobu teknolojisini özel ekipman olmadan üç boyutlu rekonstrüksiyon teknolojisi ile birleştirir. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, görüntüleme verimliliğini ve rekonstrüksiyon esnekliğini ve hedef yapıların gerçek hayattaki rekonstrüksiyonunu herhangi bir zamanda artırabilir.Bu yüzden son derece kolay ve evrenseldir. Sürekli ultra ince slaytların üç boyutlu rekonstrüksiyonu teknolojisi, belirli pahalı ekipman olmadan gerçek stereokimyasalı tekrar tekrar geri yükleyebilir. Herhangi bir zamanda tüm organellerin kalitatif ve kantitatif analizi için kullanılabilir.Gözlemin kolay çalışmasını gerçekleştirir.