Name: Studying Host-Microbe Interactions in Wound Biofilm Formation (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-16T14:00:00
Duration: 2 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Host-Microbe Interactions in Wound Biofilm Formation at JoVE.com

Nos gustaría agradecer al Centro de Recursos para Animales de Laboratorio (LARC) de la Universidad de Indiana por su apoyo y el cuidado veterinario de los animales durante el estudio. Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud NR015676, NR013898 y DK125835 y la subvención W81XWH-11-2-0142 del Departamento de Defensa. Además, este trabajo se benefició de los siguientes premios de los Institutos Nacionales de Salud: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 y NS42617.

Developing a Long-Term Swine Model for Biofilm-Infected Burn Wound Studies

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Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Este informe proporciona un protocolo detallado para establecer un modelo porcino de infección crónica por biofilm de heridas para estudios experimentales. Varios modelos de biopelícula porcina han sido reportados previamente 22,23,24,25,26, pero ninguno de ellos es un modelo porcino que involucre estudios a largo plazo de 8 semanas. Las heridas crónicas son aquellas que permanecen abiertas durante 4 semanas o más 14,27,28. No hay otros modelos de biopelícula de heridas crónicas reportados en la literatura. Este trabajo aborda la noción de cierre funcional de heridas 2,7,13,15,17,29. Un estudio realizado en 2014 fue el primero en reportar que las heridas infectadas con biofilm pueden cerrarse sin la restauración de la función de barrera7. En este trabajo se reporta la medición de la función de barrera cutánea en la herida cicatrizante mediante pérdida de agua transepidérmica (TEWL).
Anatómica y fisiológicamente, la piel porcina, en comparación con la piel de otros animales pequeños, es más parecida a la piel humana32,33,34. Tanto la piel del cerdo como la humana tienen una epidermis gruesa 33, y la relación de grosor dérmico-epidérmico oscila entre 10:1 y13:1 en el cerdo, que es comparable a la humana34,35. Desde el punto de vista histológico y biomecánico, la piel de humanos y cerdos muestra similitudes en las crestas de la red, la grasa subdérmica, el colágeno dérmico, la distribución del pelo, las estructuras anexiales y el tamaño y la distribución de los vasos sanguíneos36,37,38. Funcionalmente, tanto los cerdos como los humanos comparten similitudes en la composición de los componentes lipídicos, proteicos y de queratina de la capa epidérmica, así como patrones inmunohistológicos comparables37,38. El sistema inmunitario porcino, en comparación con el de otros animales pequeños, comparte mayores similitudes con el sistema inmunitario humano, lo que significa que los cerdos son un modelo apropiado para los estudios sobre las interacciones del huésped que son parte integral de las complejidades de la biopelícula patológica en las infecciones de heridas39. La evaluación crítica de los pros y los contras que ofrecen diversos modelos animales ha llevado al consenso de que los cerdos representan un modelo eficiente para el estudio de la cicatrización de heridas34,38. Además, los cerdos domésticos desarrollan espontáneamente infecciones bacterianas crónicas, como se observa en los seres humanos10. El dispositivo de quemaduras utilizado para crear las heridas es un dispositivo de quemaduras avanzado y automatizado que suministra energía térmica basada en una lectura de temperatura del sitio de la piel objetivo22,40. Este enfoque mejora el rigor y la reproducibilidad de la lesión por quemadura. El uso de aislados clínicos humanos de bacterias para infectar las heridas de cerdo añade valor como modelo preclínico.
Las lesiones por quemaduras son complejas y causan varias perturbaciones sistémicas20,41. Por lo tanto, es importante reanimar al cerdo con líquidos adecuados y prevenir la hipotermia durante la anestesia y la recuperación. Varios factores pueden interferir con la cicatrización de la herida, incluida la nutrición posterior a la quemadura, los líquidos y el dolor42. Por lo tanto, es importante realizar un seguimiento estrecho de las evaluaciones nutricionales y del dolor. El dolor posterior a la quemadura puede ser intenso e influir en el comportamiento y la dieta del animal. Las intervenciones para abordar los problemas de comportamiento deben considerarse activamente. Es imprescindible una puntuación y un tratamiento regulares y continuos del dolor. En este protocolo se incluye una hoja de evaluación del dolor exhaustiva con un plan de manejo del dolor muy detallado. Para evitar la contaminación cruzada entre las heridas, se debe prestar especial atención a aplicar la primera capa del apósito en cada herida por separado. Se debe tener un cuidado crítico al manipular todos los materiales biopeligrosos y al realizar la desinfección completa del equipo, las herramientas y toda la sala quirúrgica. La aplicación de múltiples capas del apósito evita que el cerdo exponga las heridas durante su esfuerzo por frotar o rascarse la espalda con picazón.
El cerdo en el modelo actual no estaba comprometido por trastornos metabólicos subyacentes (por ejemplo, diabetes) y, por lo tanto, el efecto que se estaba estudiando era puramente el impacto de la infección bacteriana de la biopelícula en la cicatrización de heridas. Sin embargo, el modelo se presta a la inducción de diabetes (usando estreptozotocina, por ejemplo) y podría usarse para estudiar la infección de la biopelícula en relación con un trastorno metabólico subyacente. La otra limitación del modelo es el entorno de infección controlada utilizando P. aeruginosa, una bacteria. Se espera que la microflora normal de la piel del cerdo también pueda estar creciendo en la herida y podría afectar la cicatrización. Es necesario realizar más análisis utilizando NGS u otras técnicas avanzadas para delinear el contenido microbiano de la herida. El modelo actual también podría aplicarse a infecciones mixtas con diferentes especies microbianas (por ejemplo, fúngicas, virales, etc.). Este es un elemento importante, ya que es probable que las heridas clínicamente relevantes estén pobladas por microbios mixtos, lo que puede afectar la cicatrización de las heridas de manera diferente.
Hay muchas ventajas potenciales en este modelo, incluida la similitud con la complejidad y las secuelas a largo plazo de las heridas crónicas humanas, el proceso de quemadura automatizado y reproducible, y el uso de especies bacterianas clínicamente aisladas. El uso de múltiples modalidades de imagen no invasivas representa un enfoque poderoso para recopilar datos fisiológicos útiles que caractericen la herida. Por último, la evaluación de la cicatrización funcional de heridas a través de la restauración de la función de barrera cutánea basada en TEWL es fundamental. En conclusión, en este trabajo se muestra un protocolo robusto, simple, detallado y fácil de usar para desarrollar una lesión por quemadura severa infectada con biopelícula utilizando un sistema modelo porcino.

La infección por biofilm complica las quemaduras y las heridas crónicas y causa cronicidad 1,2,3,4,5. En microbiología, se estudian principalmente los mecanismos de las biopelículas, con un enfoque en los microbios 1,6. Las lecciones aprendidas de estos estudios son de suma importancia desde el punto de vista de las ciencias biológicas, pero no necesariamente pueden ser aplicables a biopelículas patógenas clínicamente relevantes 6,7,8. Los agregados estructurales de biopelículas clínicamente relevantes deben incluir factores microbianos y del huésped 8,9,10. Este microambiente permite la inclusión de interacciones iterativas huésped-microbio, que son fundamentales para el desarrollo de una biopelícula clínicamente relevante 7,8. En este proceso, la participación de las células inmunitarias y de los factores transmitidos por la sangre es fundamental11,12. Las interacciones huésped-microbio que subyacen a las biopelículas patógenas clínicas, como se observa en las heridas crónicas, ocurren durante un largo período de tiempo. Por lo tanto, cualquier enfoque experimental dirigido a desarrollar un modelo traslacionalmente relevante de infección por biopelícula debe tener en cuenta estos factores. Por lo tanto, buscamos desarrollar un modelo de infección crónica por biopelícula porcina clínicamente reproducible.
Si bien los estudios en humanos representan claramente el mejor enfoque para estudiar los resultados de la curación, a menudo no son los más adecuados para abordar los mecanismos subyacentes y los nuevos paradigmas mecanicistas. Las preocupaciones éticas limitan el uso de diseños de estudios que requieren la recolección de múltiples biopsias de una herida crónica en diferentes momentos. Por lo tanto, es fundamental contar con un modelo animal bien establecido y reproducible que permita realizar estudios invasivos para el examen exhaustivo del destino de la biopelícula 7,13. La selección de un modelo animal depende de varios factores, entre ellos la relevancia científica/traslacional y la logística. El sistema porcino es ampliamente reconocido como el modelo experimental más valioso desde el punto de vista traslacional para estudiar las heridas de la piel humana7. Por lo tanto, este trabajo reporta un modelo porcino establecido de lesión por quemaduras de espesor total infectadas con biopelícula. Este trabajo se basa en varias publicaciones originales reportadas en la literatura 2,7,13,14,15,16,17. En este estudio, se eligió un aislado clínico de Pseudomonas aeruginosa multirresistente (PA01) para infectar la herida. P. aeruginosa es una causa frecuente de infecciones de heridas 2,18,19,20. Es una bacteria Gram negativa que puede ser difícil de tratar debido a su resistencia a algunos antibióticos11,19,21. Ninguno de los modelos de biopelícula porcina reportados hasta el momento involucró estudios a largo plazo de 8 semanas 22,23,24,25,26. Las heridas crónicas son aquellas que permanecen abiertas durante 4 semanas o más 14,27,28. No hay otros modelos de biopelícula de heridas crónicas reportados en la literatura. Este trabajo aborda la noción de cierre funcional de heridas 2,7,13,15,17,29.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Sedation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>10004027</td>
			<td>100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telazol</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>106-111</td>
			<td>100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>04606-6750-02</td>
			<td>100mg/ml Anased</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3ml syringe w/ 20g needle</td>
			<td>Covidien-Monoject</td>
			<td>8881513033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged infusion set 21g</td>
			<td>Jorgensen Labs</td>
			<td>J0454B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>21295097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>Church and Dwight Co. Inc</td>
			<td>70506572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine Solution</td>
			<td>First Priority Inc.</td>
			<td>179925722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution</td>
			<td>ICU Medical</td>
			<td>&#160;RL-7282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven gauze</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>21295051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>455531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#34; Elastic tape</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>21300869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-22g Intravenous Angiocath</td>
			<td>SurVet</td>
			<td>(01)14806017512306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spay hook</td>
			<td>Jorgensen Labs</td>
			<td>J0112A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile lube</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>16-8942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laryngoscope</td>
			<td>Jorgensen Labs</td>
			<td>J0449S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roll gauze</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>21295032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotracheal tube (7-9mm)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>86112</td>
			<td>Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15gtt/ml IV administration set</td>
			<td>ICU Medical</td>
			<td>12672-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LRS 1000ml bag</td>
			<td>ICU Medical</td>
			<td>07953-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three Quarter Drape Sheet</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>16-i80-12110G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>RX Generics</td>
			<td>42023-0179-05</td>
			<td>0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl Transdermal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>21294548</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>50mg/ml Levafen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent film dressing 26x30</td>
			<td>Genadyne Biotechnologies</td>
			<td>A4-S00F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>886408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetrap</td>
			<td>3M</td>
			<td>1410BK BULK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic tape 4&#34;</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>21300931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kerlix Roll Gauze</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>3324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon EOS 80D</td>
			<td>Canon</td>
			<td>1263C004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedlight 600EX II-RT</td>
			<td>Canon</td>
			<td>1177C002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EFS 17-55mm Ultrasonic</td>
			<td>Canon</td>
			<td>1242B002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Logiq E9</td>
			<td>GE</td>
			<td>5197104-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML6-15 Probe</td>
			<td>GE</td>
			<td>5199103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeriCamPSI</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>90-00070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DermaLab</td>
			<td>Cortex Technologies Inc</td>
			<td>4608D78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy/Tissue Collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6mm punch biopsy</td>
			<td>Integra Lifesciences</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bupivicaine 0.5%</td>
			<td>Auromedics Pharma</td>
			<td>55150017030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 10 Disposable Scalpel</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>16-63810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>21294806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tooth thumb tissue forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD512R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-adherent Dressing</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2132</td>
			<td>Telfa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf/microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Woven Gauze 4x4</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>21295051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt LB agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low salt LB broth</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF-351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyprophyline round bottom tubes (14 ml)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>REF-352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas Agar Base (Dehydrated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OXCM0559B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, powder (Lennox L agar)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td>
			<td>22700025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#8482; DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-22g Intravenous Angiocath</td>
			<td>SurVet</td>
			<td>(01)14806017512306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatal Plus</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>9373</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swine model of biofilm infection and invisible wounds

La infección por biofilm es uno de los principales factores que contribuyen a la cronicidad de las heridas. El establecimiento de una infección experimental de biofilm de heridas clínicamente relevante requiere la participación del sistema inmunitario del huésped. Los cambios iterativos en el huésped y el patógeno durante la formación de dicha biopelícula clínicamente relevante solo pueden ocurrir in vivo. El modelo de herida porcina es reconocido por sus ventajas como un poderoso modelo preclínico. Existen varios enfoques reportados para el estudio de las biopelículas de heridas. Los sistemas in vitro y ex vivo son deficientes en cuanto a la respuesta inmunitaria del huésped. Los estudios in vivo a corto plazo implican respuestas agudas y, por lo tanto, no permiten la maduración de la biopelícula, como se sabe que ocurre clínicamente. El primer estudio de biopelícula de heridas porcinas a largo plazo se publicó en 2014. El estudio reconoció que las heridas infectadas con biopelícula pueden cerrarse según lo determinado por la planimetría, pero la función de barrera de la piel del sitio afectado puede no restaurarse. Posteriormente, esta observación fue validada clínicamente. Así nació el concepto de cierre funcional de heridas. Las heridas cerradas pero deficientes en la función de barrera de la piel pueden ser vistas como heridas invisibles. En este trabajo, buscamos reportar los detalles metodológicos necesarios para reproducir el modelo porcino a largo plazo de lesión por quemaduras severas infectadas con biofilm, que es clínicamente relevante y tiene valor traslacional. Este protocolo proporciona una guía detallada sobre cómo establecer una infección por biofilm de la herida a las 8 semanas utilizando P. aeruginosa (PA01). Se crearon ocho heridas por quemaduras de espesor total simétricamente en el dorso de cerdos blancos domésticos, que fueron inoculados con (PA01) en el día 3 después de la quemadura; posteriormente, se realizaron evaluaciones no invasivas de la cicatrización de la herida en diferentes momentos mediante imágenes de moteado láser (LSI), ultrasonido de alta resolución (HUSD) y pérdida de agua transepidérmica (TEWL). Las quemaduras inoculadas se cubrieron con un apósito de cuatro capas. Las biopelículas, según lo establecido y confirmado estructuralmente por SEM en el día 7 después de la inoculación, comprometieron el cierre funcional de la herida. Un resultado adverso de este tipo está sujeto a reversión en respuesta a las intervenciones adecuadas.

Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds

Se utilizó un dispositivo de quemadura estandarizado para crear heridas por quemaduras de espesor total a 150 °C durante 1 min, lo que resultó en una quemadura profunda homogénea con un margen uniforme de eritema e inflamación (Figura 3 y Figura 7). Cada cerdo recibió ocho quemaduras de espesor completo en la espalda, como se muestra en la Figura 3C. 
La evaluación no invasiva en tiempo real de las heridas por quemaduras mediante ecografía de alta resolución en modo B para confirmar la profundidad de la herida y la progresión de la cicatrización de la herida a lo largo del tiempo mostró la destrucción de todas las capas de la piel hasta la grasa subcutánea (Figura 4). Se utilizó la imagen de moteado láser (LSI) para una mayor caracterización de la perfusión de la herida (Figura 4A).
Las heridas por quemaduras mostraron una gruesa membrana piógena en la superficie de la herida al día 7 después de la inoculación, lo que confirmó la infección y el establecimiento de la biopelícula de la herida por quemadura (Figura 7A). La planimetría digital mostró un aumento del área de la herida en el día 3 después de la inoculación con PAO1 debido a la respuesta inflamatoria en el sitio de la herida y los márgenes (Figura 7A,B). Aunque el área de la herida comenzó a reducirse en el día 14 después de la inoculación, se observó una cicatrización incompleta de aproximadamente el 25% del tamaño original de la herida en el día 56, lo que indica la cronicidad de las heridas (Figura 7B). La cronicidad de la herida y el deterioro de la cicatrización de la herida fueron confirmados por el TEWL, que mostró una alta pérdida de agua transepidérmica. Los resultados de TEWL reflejaron la pérdida de la función de barrera de la piel en comparación con la piel normal en todos los puntos de tiempo medidos, lo que indica un deterioro funcional de la cicatrización de la herida de la quemadura (Figura 7B). Esto también se confirmó por la supresión de las proteínas de unión estrecha ZO-1 y 213 y el deterioro de la restauración de la función de barrera cutánea, como se refleja en los altos valores de TEWL observados en el día 35 (medio) y el día 56 (tardío) a pesar del cierre visual de la herida (Figura 7I).
La profundidad de la quemadura se validó aún más mediante tinción de H&E, que mostró distorsión y necrosis de todas las capas histológicas de la piel, como se muestra en la Figura 7C. La biopelícula establecida de PA01 se validó aún más en el día 7 después de la inoculación mediante UFC (Figura 7E, F), imágenes SEM (Figura 7G) y tinción de inmunofluorescencia (Figura 7H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig01.jpg"> Figura 1: Configuración del procedimiento . (A) Preparación de la mesa quirúrgica. (B) Canulación de las venas del oído para líquidos intravenosos y administración de fármacos. (C) Manta térmica para proteger al cerdo de la hipotermia durante el procedimiento. (D) Configuración del quemador y del temporizador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig02.jpg"> Figura 2: Esterilización y marcaje del sitio quirúrgico . (A) Corte y esterilización del cabello. (B) Marcado del sitio de la quemadura con una plantilla estándar estéril de ocho heridas (cada herida mide 2 pulgadas x 2 pulgadas). (C) Marcado final con un marcador cutáneo estéril. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig03.jpg"> Figura 3: Inducción de la herida por quemadura. (A,B) Quemador estandarizado con un manómetro y una unidad controladora automatizada (2 pulgadas x 2 pulgadas) aplicada al sitio de la herida previamente marcado. (C) Toda la espalda mostrando las ocho heridas de quemaduras de espesor completo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes y evaluación no invasivas de heridas por quemaduras. (A) En la imagen del lado izquierdo se muestran imágenes de moteado láser (LSI) con la orientación adecuada del indicador del rayo láser hacia el centro de la herida; la imagen del lado derecho muestra el dispositivo LSI y el mapa de perfusión vascular de la piel en tiempo real. (B) La aplicación de la sonda de pérdida de agua transepidérmica (TEWL) en el sitio de la herida en cinco puntos diferentes (cuatro esquinas de la herida y el centro que se muestra en la imagen de la esquina inferior derecha) se muestra en la imagen del lado izquierdo; la imagen del lado derecho es una pantalla representativa capturada en tiempo real de la medición TEWL. (C) La exploración por ultrasonido armónico de la herida quemada utilizando una sonda de ultrasonido de alta resolución de 16 MHz se muestra en el lado izquierdo; La imagen del lado derecho muestra el dispositivo de ultrasonido y la grabación de pantalla en tiempo real. (D) Imágenes estructurales (imágenes en modo B, ultrasonido en escala de grises) y biomecánicas (elastografía, ultrasonido en color) del sitio de la herida de la quemadura en el día de inoculación y el día 7 después de la inoculación. La profundidad de la herida se indica mediante la línea discontinua amarilla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig05.jpg"> Figura 5: Apósito y vendaje de la herida. (A) Aplicación del apósito de película transparente para cada herida por separado. (B) Todas las heridas por quemaduras inoculadas dorsales se cubren con la primera capa de apósito. (C) Se coloca un apósito de película transparente más grande sobre toda el área de la herida. (D) Aplicación de la segunda capa de gasa y una capa suelta de vendaje elástico elástico alrededor de todo el tronco del cerdo para absorber cualquier exudado de líquido que provenga de las heridas. (E) Cubrir toda el área de la herida con una capa final de 4 en apósito adhesivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig06.jpg"> Figura 6: Inoculación bacteriana . (A) Configuración para la inoculación de Pseudomonas aeruginosa (PA01) en el día 3 después de la quemadura. (B) Aplicación tópica del inóculo con una pipeta utilizando un volumen de 500 μL para cada herida. (C) El inóculo se dispersa uniformemente por la superficie de la herida utilizando un esparcidor desechable estéril. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig07.jpg"> Figura 7: Evolución de la cicatrización de la herida y confirmación del biofilm. (A) Imágenes representativas del cierre de la herida a lo largo de la línea de tiempo del estudio. Barra de escala = 1 cm. (B) Cuantificación del área de la herida y de las mediciones de TEWL a lo largo de la línea de tiempo del estudio (n = 6). Los datos se representan como media ± SD. N.S. se refiere al valor TEWL de la piel normal. (C) Diagrama esquemático que muestra los diferentes sitios de biopsia de la herida. D. Tinción H&E con su correspondiente tinción tricrómica de Masson que muestra distorsión y necrosis de todas las capas de la piel en el día 3 post-quemadura y en el día 7 post-inoculación. Barra de escala = 500 μm. (E) Imágenes digitales representativas de agar no selectivo (agar Luria-Bertani) y agar selectivo (agar de aislamiento de Pseudomonas) con colonias bacterianas cultivadas a partir de tejido del lecho de heridas porcinas. El medio selectivo permite el recuento preciso de las colonias de PA01 solamente. (F) Se muestra un cálculo de la unidad formadora de colonias (UFC) de la muestra a partir de los recuentos de colonias tomados de las biopsias de heridas procesadas después de la inoculación del día 7. (G) Imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido (SEM) de las heridas por quemaduras inoculadas en el día 7 después de la inoculación que muestren la biopelícula PA01 establecida, con una imagen ampliada en el lado derecho. Barra de escala = 1 μm. Las puntas de flecha rojas apuntan a sustancias poliméricas extracelulares (EPS). (H) P. aeruginosa en las heridas por quemaduras se visualizaron utilizando anticuerpos anti-Pseudomonas (verde); las imágenes de inmunofluorescencia de las biopsias de heridas posteriores a la inoculación del día 7 muestran una fuerte colonización de los tejidos de la herida por P. aeruginosa. Barra de escala = 100 μm. (I) Mosaico representativo (barra de escala = 200 μm) e imágenes ampliadas correspondientes (barra de escala = 50 μm) de secciones teñidas con ZO-1 y ZO-2 en el día 35 y el día 56 después de la inoculación, que demuestran una expresión reducida de las proteínas después de la infección inducida. Las secciones congeladas incluidas en OCT (10 μm) se tiñeron con anti-ZO-1 (verde) o anti-ZO-2 (verde). Las secciones se contratiñeron con DAPI. Los gráficos de barras presentan la cuantificación de la intensidad de la señal ZO-1 y ZO-2. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3); * p < 0,05 en comparación con los espontáneos. Se realizaron pruebas de análisis de varianza unidireccional de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis para probar la significación. La Figura 7H,I ha sido modificada a partir de Roy et al.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Studying Host-Microbe Interactions in Wound Biofilm Formation (Video) | JoVE

Las heridas crónicas resistentes a los antibióticos son una gran amenaza para el sistema sanitario. Las infecciones por biofilm son persistentes y hostiles y pueden causar un cierre funcional deficiente de la herida. Presentamos un modelo porcino clínicamente relevante de heridas crónicas de espesor total infectadas con biofilm. Este modelo es poderoso para estudios mecanicistas, así como para probar intervenciones.

Modelo porcino de infección por biofilm y heridas invisibles

Biofilm infection is a major contributor to wound chronicity. The establishment of clinically relevant experimental wound biofilm infection requires the ...

La infección por biofilm contribuye significativamente a la cronicidad de la herida. Este modelo preclínico infecta heridas porcinas de espesor completo con patógenos clínicamente aislados para estudiar la formación de biopelículas en las heridas y los cambios dependientes de la biopelícula en los resultados de las heridas. Al incluir tanto factores microbianos como del huésped, nuestro objetivo es investigar las complejas interacciones entre el huésped y el microbio que subyacen a las biopelículas patógenas en heridas crónicas.Aunque la literatura actual no discrimina entre los dos, los agregados de biopelícula de heridas difieren significativamente de los agregados de biopelícula encontrados por interacciones microbianas en ausencia de defensas humanas del huésped. Por ejemplo, biopelícula cultivada en una superficie de plástico o, por ejemplo, en piel muerta. La interacción iterativa entre los procesos microbianos y los sistemas de defensa inmunitaria del huésped conduce a la formación de agregados de biopelículas en las heridas.Dado que este proceso tarda varios días, es crucial tener un modelo a largo plazo de infección de la herida. Tanto los sistemas in vitro como ex vivo carecen de la respuesta inmunitaria necesaria del huésped necesaria para estudiar la biopelícula de la herida. Si bien los estudios in vivo a corto plazo producen una respuesta aguda y que no permiten la maduración de la biopelícula, nuestro sistema experimental preclínico estandarizado con hallazgos clínicamente relevantes aborda estas brechas.Si bien la herida infectada con biopelícula puede cerrarse estructuralmente, es posible que no logre un cierre funcional de la herida, ya que la incrustación reparada a menudo no logra restablecer la función de barrera. La piel afectada rota con la función de barrera comprometida constituye una herida abierta e invisible que está estructuralmente cubierta, pero funcionalmente abierta. Nuestro estudio destaca la importancia de medir la función de barrera de la piel en el sitio de reparación de la herida para determinar el cierre funcional de la herida.La función de barrera se mide mediante la medición clínicamente validada en el punto de atención de la pérdida de agua transepidérmica.