Name: Mitochondrial Remodeling in Skeletal Muscle (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00
Duration: 1 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Remodeling in Skeletal Muscle at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af School of Medicine og Institute for Obesity Research of Tecnologico de Monterrey. Figur 3A blev oprettet med Scientific Image og Illustration software.

Alle dyreforsøgsprocedurer blev evalueret og godkendt af Animal Use and Care Committee (CICUAL) under Tecnologico de Monterrey (protokol 2019-007). Zucker-hanrotter (+/+ og fa/fa) i alderen 12 til 13 uger blev anvendt til denne undersøgelse. Dyrene blev holdt under almindelige opdrætsforhold (12 timer/12 timers lys/mørk cyklus, 40-60% fugtighed) og havde adgang til mad (standard rotte chow) og vand ad libitum.
1. Opløsningens sammensætning
<ol><li>Forbered frisk Relax-opløsning ved at blande komponenterne i tabel 1. Juster pH til 7,3 ved hjælp af natriumhydroxid (NaOH).</li>
	<li>Beregn koncentrationen af frit calcium i Relax-opløsningen ved hjælp af et simuleringsprogram til bestemmelse af koncentrationen af frit metal.</li>
	<li>Der fremstilles en 5 mM tetramethylrhodaminmethylester (TMRE) i dimethylsulfoxid (DMSO) og en efterfølgende fortynding på 0,1 mM i DMSO.</li>
</ol>2. Dissektion af gastrocnemius muskelfiberbundter
<ol><li>Placer dyret inde i induktionskammeret og luk låget. Tænd for iltkilden, indstil gasstrømningshastigheden til 0,5 l / min, og indstil fordamperen til 4% sevofluran for at inducere anæstesi.</li>
	<li>Når rotten sover, skal du placere den uden for kammeret i liggende stilling, mens du opretholder anæstesi. Klem tåen eller halen for at kontrollere manglen på reflekser.</li>
	<li>Skær med saks gennem mavens hud og muskler. Skær derefter brystkassen for at få adgang til hjertet.</li>
	<li>For at udføre en kardioktomi skal du gribe hjertet fra de øverste vener og arterier med tang og skære blodkarrene med en saks. Fjern hjertet.</li>
	<li>Umiddelbart efter eutanasi desinficeres bagbenet med ethanol og barberes ved hjælp af en barbermaskine.</li>
	<li>Hold bagfoden og lav et snit med en saks gennem huden på niveau med akillessenen.</li>
	<li>Skær bagbenet med en saks på niveau med den proksimale skinneben. Overfør den til en 60 mm petriskål indeholdende 3 ml iskold Relax-opløsning i rygposition. Dæk det med tilstrækkelig opløsning for at forhindre musklerne i at tørre ud.</li>
	<li>Identificer akillessenen, hæv den forsigtigt med tang og disseker musklerne væk fra knoglen med irissaks. Brug et stereomikroskop fra dette trin og frem for dissektionen.</li>
	<li>Identificer og adskil hele gastrocnemius muskel, hovedmassen på bagsiden af bagbenet.</li>
	<li>Disseker og kassér binde- og fedtvævet, der omgiver musklen, med pincet med fine spidser. Overfør muskelens laterale hoved til en ny petriskål med iskold Relax-opløsning (se figur 2A).</li>
	<li>Hold forsigtigt musklen med tang fra den ene ende og adskil den forsigtigt i bundter med mikrosaks. Manipuler altid bundter ved forsigtigt at holde dem i den ene ende med pincet. BEMÆRK: Bundter er ca. 10 mm lange og 2 mm brede.</li>
	<li>Overfør fiberbundterne til en ny petriskål med 2 ml iskold Relax-opløsning. Vælg kun dem, der har et glat udseende, er komplette fra den ene ende til den anden og ikke forkortes (figur 2B).</li>
</ol>3. Levende cellebilleddannelse erhvervelse af mitokondrier i skeletmuskulatur ved konfokal mikroskopi
<ol><li>Inkuber fibrene i 2,5 × 10-4 mM TMRE i Relax-opløsning i 20 minutter ved stuetemperatur. BEMÆRK: Med de anbefalede arbejdskoncentrationer af TMRE forventes det at være i en ikke-slukningstilstand. Beskyt mod lyseksponering fra dette tidspunkt og fremefter.</li>
	<li>I inkubationstiden:<ol><li>Åbn standardsoftwaren til konfokalmikroskopet, vælg konfigurationsrammen, og vælg laser i dialogboksen til hardwarekonfiguration, og kontroller HeNe 543-indstillingen.</li>
		<li>I anskaffelsesstrukturen skal du vælge dialogboksen Anskaffelse og i anskaffelsestilstand vælge XYZ-panel. </li>
		<li>I dialogboksen XY skal du vælge 512 x 512-formatet, 400 Hz hastighed og kontrollere pinhole-panelet. I den viste pinhole-dialogboks skal du vælge AU for enhed og tilføje en værdi på 3 Airy for pinhole. BEMÆRK: Overvej at reducere pinhole-størrelsen tættest på 1 Airy optimal kriteriet, hvis der bevares et tilstrækkeligt fluorescenssignal.</li>
		<li>Vælg et vandnedsænkningsmål på 20x og numerisk blænde (NA) på 0,7 (20x/0,7 IMM) i dialogboksen Indstillinger for strålebane, og vælg emissionsbølgelængdevinduet 576-700 nm. Vælg DD488/543 og 15 % lasereffekt til 543-laseren. BEMÆRK: Et objektiv til vandnedsænkning til live billedscanning anbefales kraftigt (hvis tilgængelig). Da et lignende brydningsindeks for nedsænkningsmediet og inkubationsmediet opnås.</li>
	</ol></li>
	<li>Efter 20 minutters inkubation udskiftes inkubationsmediet to gange. Sørg for, at de konfokale billeder erhverves inden for 20-30 minutter efter inkubation.</li>
	<li>Klargør optagekammeret med et 0,15 mm dæksel af borosilikatglas. BEMÆRK: Vælg tykkelsen på dækselen i henhold til det tilgængelige optagekammer, i betragtning af at tykkelsen normalt varierer fra 0,15 til 0,22 mm for optimal ydeevne.</li>
	<li>Tilsæt 200 μL Relax-opløsning til optagekammeret, og overfør fiberbundterne.</li>
	<li>I konfokalmikroskopet skal du bruge brightfield-tilstanden til at identificere levedygtige fibre til fluorescerende optagelse af mitokondrier. Levedygtige fibre er komplette, ikke kontraherede og har et intakt striationsmønster.</li>
	<li>Adskil fiberbundterne fra hinanden og juster dem med tang. Vælg dem, der er tættest på følgesedlen.</li>
	<li>Scan fluorescensen ved hjælp af live-knappen for at justere forstærkning og forskydning i kontrolpanelkonsollen under hensyntagen til følgende:<ol><li>Vælg værdier for lav fluorescerende intensitet for en baggrund på næsten 0 vilkårlige enheder (AU).</li>
		<li>Vælg et forstærkningsniveau mellem 100 og 200 A.U. for at undgå mætning af registreringssystemet. Optag derfor ikke de højeste fluorescensniveauer.</li>
		<li>Vælg en pixelstørrelse på 150-190 nm for at opnå fiberens fulde bredde, og juster zoomfaktoren i dialogboksen XY . BEMÆRK: Overvej at bruge pixelstørrelsen tættere på Nyquist-kriterierne (90 nm), som tillader scanning af fiberens fulde bredde.</li>
	</ol></li>
	<li>I dialogboksen Z-stakken skal du justere Z-afstanden for at hente fluorescenssignalet, der starter ved en fiberdybde på 15 μm (startknap) op til 22 μm (slutknap). Vælg 3 μm som Z-trinstørrelse.</li>
	<li>Klik på Start-knappen for at hente de konfokale billeder. Få en Z-stak sammensat af tre konfokale billeder erhvervet ved 15, 18 og 21 μm dybde.</li>
</ol>4. Analyse af mitokondrietæthed
<ol><li>I open source-platformen til biologisk billedanalyse18 skal du åbne Z-stack-filen og rotere billederne for at placere fiberen vandret, som vist i figur 3B.</li>
	<li>Vælg tilfældigt et rektangulært interesseområde (ROI), der inkluderer det område, der er besat af mitokondrierne (ROImito). Vælg ROI mito størrelser fra 65 til 90 μm for X. For Y afhænger størrelsen af fiberbredden og undgår dens periferi.</li>
	<li>Dupliker Z-stakken med den valgte ROImito og gem den som en ny Z-stack (Mito-stack) i TIFF-format. Gem den mito-position, der er valgt på den oprindelige stak, med ROI Manager-værktøjet.</li>
	<li>Beregn tærsklen for baggrundssubtraktion som følger:<ol><li>Brug genvejskommandoen + skift + t til at åbne dialogboksen Tærskel .</li>
		<li>Vælg tærskelalgoritmen Otsu |Sort/hvid | Mørk baggrund mulighed. Bemærk, at billedet nu er binariseret.</li>
		<li>I dialogboksen Tærskel skal du observere histogrammet for fluorescensintensitetsfordelingen og den tærskelværdi, der vises. BEMÆRK: Mitokondrier-positive pixels har fluorescensintensitetsværdier, der er større end tærsklen, og vises som hvide pixel i det binære billede.</li>
		<li>Anvend tærsklen på den binære billedstak ved at vælge Anvend. I den viste dialogboks Konverter stak til binær skal du vælge indstillingerne Beregn tærskel for hvert billede, sort baggrund, Opret ny stak og klikke på OK.</li>
	</ol></li>
	<li>Bemærk, at der genereres en stak med de tre binære billeder (BinDMito-stack). Gem det i TIFF-format.</li>
	<li>Beregn mitokondrietætheden i BinDMito-stakken som følger:<ol><li>Vælg menuen Analysér . Klik derefter på Histogram. Klik på Ja i dialogboksen Det viste histogram for at medtage alle billederne af stakken til analyse.</li>
		<li>Klik på Liste i dialogboksen Histogram of Stack for at hente histogramdataene. Overfør histogramdataene til et regneark.</li>
		<li>I et regneark skal du identificere Mito-pixels, der er dem med værdien 255 . Beregn mitokondrietæthed ved hjælp af ligning (1): Mitokondriel tæthed = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65306/65306eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100 (1) Det samlede antal pixel identificeres som N i dialogboksen Histogram eller beregnes ved at opsummere histogrammets pixelantal i regnearket.</li>
		<li>For at beregne det område, der er optaget af mitokondrier (μm2), multipliceres Mito-pixels i BinDMito-stakken med pixelstørrelsen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse af mitokondriefordeling ved Fast Fourier Transform
<ol><li>I open source-platformen til biologisk billedanalyse skal du åbne BinDMito-stakken og tegne et rektangulært investeringsafkast på 256 pixels bredde og 5 μm højde. Placer et investeringsafkast i en central position og et andet i en lateral position, som vist i figur 4A,B.</li>
	<li>Brug værktøjet ROI Manager til at konfigurere ROI'erne til FFT-analyse og gemme det. BEMÆRK: I henhold til analysens nødvendigheder kan andre ROI'er vælges i forskellige positioner, og deres størrelser kan ændres. Ikke desto mindre skal bredden være lig med 2n pixels for at udføre FFT (f.eks. 128, 256, 512 pixels).</li>
	<li>Hent plotprofilen for ROI'erne ved hjælp af genvejskommandoen + k , og overfør dataene til et regneark.</li>
	<li>I regnearket skal du udfylde B - og C-kolonnerne med de data, der er opnået fra plotprofilen. B-kolonnen indeholder afstanden i μm, og C-kolonnen den tilsvarende grå værdi af fluorescensintensiteten (A.U.).</li>
	<li>D-kolonnen svarer til FFT-frekvensen (event/μm), som udfyldes som følger:<ol><li>Beregn prøveudtagningsfrekvensen (Fs): Fs = 1/Δ d, hvor Δd er afstandstrinnet (den anden værdi af B). </li>
		<li>Beregn Δ Fs: Δ Fs= Fs / N, hvor N er antallet af datapunkter for B (256).</li>
		<li>Beregn stopværdien for FFT-frekvensen (S): S = (N/2) ×ΔFs.</li>
		<li>Udfyld D-kolonnen som følger:<ol><li>Den første værdi af D-kolonnen er lig med 0.</li>
			<li>Vælg den anden celle i D-kolonnen , gå til startmenuen, vælg udfyld, og klik på serie. Vælg kolonner. For trinværdien skal du bruge den beregnede Δ Fs. For stopværdien skal du bruge den beregnede S.</li>
		</ol></li>
		<li>Udfyld derefter E-kolonnen med FFT-komplekse værdier som følger:<ol><li>Indsæt 0 i den første celle i C-kolonnen, fordi afstanden 0 skal falde sammen med et signal 0 til beregning af FFT.</li>
			<li>Gå derefter til menuen Data , klik på Dataanalyse, og vælg Fourieranalyse.</li>
			<li>I det nye vindue skal du vælge dataområdet for det fluorescerende signal, der er beskrevet i kolonne C for indgangsområdet. BEMÆRK: Antallet af datapunkter skal være 2n (f.eks. 256 eller 128 datapunkter med fluorescerende signal).</li>
			<li>Vælg det tilsvarende område for E for outputområdet.</li>
			<li>Vælg OK , og lad FFT-komplekse værdier udfyldes automatisk.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Udfyld kolonnen F med FFT-størrelsen som følger:<ol><li>Brug funktionen IMABAS til at returnere den absolutte værdi i F fra det komplekse tal i E og gange med 2/N for at normalisere (ligning (2)): FFT-størrelsesorden = (IM.ABS (E1... En) × (2/N) (2)</li>
	</ol></li>
	<li>FFT-spektret plottes ved hjælp af FFT-størrelsen i F som funktion af FFT-frekvensen i D, indtil S. Find punktet for den maksimale top og dens tilsvarende FFT-frekvens.</li>
	<li>Omregn FFT-frekvensen for den maksimale top til afstand med ligning (3). Denne beregnede afstand repræsenterer den langsgående afstand af mitokondriefordelingen. Afstand (μm) = 1/FFT-frekvens (3) BEMÆRK: På grund af FFT-symmetri må FFT-frekvensen ikke plottes ud over S-værdien, hvilket svarer til halvdelen af datapunkterne, så duplikering af FFT-spektret undgås.</li>
</ol>6. Valgfri forbehandlingstrin for at reducere billedstøj før billedanalyse
<ol><li>Anvend et medianfilter eller en 2D-dekonvolution som følger:<ol><li>For medianfilter:<ol><li>Vælg Proces | Filtrerer og klik på Median-indstillingen .</li>
			<li>I den viste mediandialogboks skal du vælge 2,0 for Radius og klikke på OK. Vælg Ja for at anvende processen på alle billeder i Mito-stakken.</li>
			<li>Overhold reduktionen af støj i billederne.</li>
		</ol></li>
		<li>Til 2D-dekonvolution:<ol><li>Generer en teoretisk punktspredningsfunktion (PSF).</li>
			<li>Download plugin-PSF_Generator.jar, og placer filen i mappen "Plugins".</li>
			<li>I dialogboksen PSF-generator skal du klikke på indstillingen Born & Wolf optisk 3D-model, indtaste nedsænkningsværdien for brydningsindeks på 1,33 , der bruges under konfokal scanning, og vælge Bedst for indstillingen Nøjagtighedsberegning .</li>
			<li>Optag 576 nm for emissionsbølgelængde, NA for det anvendte objektivobjektivobjektiv på 0,7 og Z-trinnet på 3.000 nm.</li>
			<li>Optag pixelstørrelsen XY for det konfokale billede, der skal devikles, samt størrelsen XYZ , der angiver antallet af pixels X og Y og antallet af Z-trin (3 for denne protokol).</li>
			<li>I PSF-generatorens skærmmenu skal du klikke på indstillingen lineær, vælge 8 bit opløsning og derefter vælge indstillingen grå for opslagstabellen (LUT).</li>
			<li>PSF-generatoren køres, og den teoretiske PSF, der er oprettet i TIFF-format, gemmes.</li>
			<li>Lav en sum af udsnit af PSF oprettet ved at åbne Z-projektværktøjet for indstillingen Stakke , der er placeret i menuen Billede .</li>
			<li>Vælg Sum udsnit for projektionstypen i den viste ZProjection-dialogboks, og klik på OK. Gem den nye PSF i TIFF-format. BEMÆRK: En PSF fremstillet eksperimentelt ved konfokal scanning fluorescerende mikroperler med en kendt diameter kan anvendes i stedet for den teoretiske PSF.</li>
			<li>Download pluginet "DeconvolutionLab_2.jar"19 og placer det i plugin-mappen.</li>
			<li>Klik på menuen Plugins. Klik derefter på DeconvolutionLab2.</li>
			<li>Adskil de konfokale billeder fra Mito-stakken ved hjælp af værktøjet Billeder til stabling fra indstillingen Stakke i menuen Billede og gem den i TIFF-format.</li>
			<li>I dialogboksen DeconvolutionLab2 skal du vælge et af de billeder, der er hentet fra Mito-stakken. Vælg den teoretiske PSF oprettet, og vælg algoritmen Richardson-Lucy med 15 iterationer.</li>
			<li>Kør DeconvolutionLab2, kontroller signalforbedring og støjreduktion i billedet, og gem det i TIFF-format.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Fortsæt med trin 4.4 for billedanalyse.</li>
	<li>Til tærskelskæring af de deindviklede billeder skal du konvertere dem til en 8-bit maske under tærskelprocessen. Opret en stak med de binære og deindviklede billeder ved at vælge Billeder, der skal stables i stakværktøjet i menuen Billede.</li>
	<li>Til FFT-analyse af dekonvoluerede billeder indeholder plotprofilen afstand i pixelenheder. Transformér pixelenhederne til μm på følgende måde:<ol><li>I regnearket, efter at have gennemført trin 5.4, skal du overføre dataene fra B til A. Udfyld derefter B med afstanden i μm ved at gange hvert pixeltal fra A med pixelstørrelsen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Confocal Microscopic Analysis of Rat Muscle Mitochondria

<ol>
	<li>Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+dynamic+mitochondrial+network.">Shaping the dynamic mitochondrial network.</a> BMC Biology. 12, 35 (2014).</li><li>De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mitochondria+in+health+and+disease.">Skeletal muscle mitochondria in health and disease.</a> Cell Calcium. 94, 102357 (2021).</li><li>Chang, C. R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+mitochondrial+fission+through+modification+of+the+dynamin-related+protein+Drp1.">Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).</li><li>Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+specialization+of+mitochondrial+form+and+function+in+skeletal+muscle+cells.">Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305 (2021).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+subpopulations+and+heterogeneity+revealed+by+confocal+imaging:+possible+physiological+role.">Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).</li><li>D&#237;az-Vegas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+increase+induced+by+RyR1+and+IP3R+channel+activation+after+membrane+depolarization+regulates+skeletal+muscle+metabolism.">Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism.</a> Frontiers in Physiology. 9, 791 (2018).</li><li>Boncompagni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+are+linked+to+calcium+stores+in+striated+muscle+by+developmentally+regulated+tethering+structures.">Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).</li><li>Reggiani, C., Marcucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controversial+issue:+Can+mitochondria+modulate+cytosolic+calcium+and+contraction+of+skeletal+muscle+fibers.">A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167 (2022).</li><li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2++release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium.">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 26 (2011).</li><li>P&#233;rez-Trevi&#241;o, P., P&#233;rez-Trevi&#241;o, J., Borja-Villa, C., Garc&#237;a, N., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+T-tubules+and+sarcoplasmic+reticulum+in+ventricular+myocytes+in+early+cardiac+hypertrophy+in+a+pressure+overload+rat+model.">Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).</li><li>Celestino-Montes, A., P&#233;rez-Trevi&#241;o, P., Sandoval-Herrera, M. D., G&#243;mez-V&#237;quez, N. L., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+role+of+T-tubules+disruption+and+decreased+SERCA2+on+contractile+dynamics+of+isolated+rat+ventricular+myocytes.">Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes.</a> Life Sciences. 264, 118700 (2021).</li><li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orphaned+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart.">Orphaned ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li><li>Houzelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+mitochondrial+dynamics+in+relation+to+oxidative+capacity+and+insulin+sensitivity.">Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity.</a> Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).</li><li>Call, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulk1-mediated+autophagy+plays+an+essential+role+in+mitochondrial+remodeling+and+functional+regeneration+of+skeletal+muscle.">Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).</li><li>Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mitochondrial+network+dynamics+in+metabolic+disorders+and+aging.">Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).</li><li>Rivera-Alvarez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+session+of+physical+activity+restores+the+mitochondrial+organization+disrupted+by+obesity+in+skeletal+muscle+fibers.">A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers.</a> Life Sciences. 256, 117965 (2020).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes,+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li><li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy,+mitochondrial+homeostasis,+and+cell+fate.">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).</li><li>Meinild, L. A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+training+increases+skeletal+muscle+mitochondrial+volume+density+by+enlargement+of+existing+mitochondria+and+not+de+novo+biogenesis.">Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis.</a> Acta Physiologica. 222 (1), (2018).</li><li>Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+and+mitochondrial+health.">Exercise and mitochondrial health.</a> Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).</li><li>Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mitochondrial+remodeling+in+exercise+and+diseases.">Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases.</a> Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).</li><li>Schiaffino, S., Hanzl&#237;kov&#225;, V., Pierobon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers.">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li><li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+mitochondrial+ultrastructural+defects+in+mitochondria+myopathy.">The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy.</a> Scientific Reports. 6, 30610 (2016).</li><li>Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+is+a+distinguishing+feature+of+skeletal+muscle+fiber+types+and+regulates+organellar+compartmentalization.">Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization.</a> Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).</li><li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+isolation,+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+[Ca2+]+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers.">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li><li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function,+structure,+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+Muscles.">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252 (2022).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+limits+in+confocal+microscopy.">Fundamental limits in confocal microscopy.</a> In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Otsu, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+selection+method+from+gray-level+histogram.">Threshold selection method from gray-level histogram.</a> IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Br&#252;ser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+of+mitochondria+at+the+nanoscale.">Light microscopy of mitochondria at the nanoscale.</a> Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

Mitokondrier er organeller med høj ombygningskapacitet. Deres indhold, densitet og fordeling kan hurtigt ændres gennem aktivering af mitokondriefusions- og fissionsmekanismerne, kendt som mitokondriedynamik1, og balancen mellem mitokondrieomsætningsmekanismerne: mitokondriebiogenesen og den specialiserede mitokondrienedbrydningsvej, mitofagien21,22. Mitokondrieindhold og morfologi kan variere alt efter celletype og udviklingsstadium og kan ombygges under forskellige fysiologiske og patologiske stimuli 17,22,23,24. Derfor har undersøgelsen af mitokondriel morfologi været relevant i over et halvt århundrede25. Især har analysen af mitokondrier gennem elektronmikroskopi været standardteknikken anvendt i flere undersøgelser26.
Fluorescerende undersøgelser ved konfokalmikroskopi har fået relevans i de sidste par år på grund af deres kapacitet til levende cellebilleddannelse af mitokondrier ved forskellige fiberdybder, hvilket kan hjælpe med bedre at forstå mitokondriernes rolle i skeletmuskulatur under forskellige adaptive og maladaptive forhold27. I denne undersøgelse beskrives en metode til analyse af mitokondriers tæthed og fordeling i levende skeletmuskelfibre ved konfokal mikroskopi. En af de største udfordringer ved at arbejde med levende skeletmuskelfibre er at undgå sammentrækning fra isolationsprocesserne op til mitokondriekonfokal optagelse. For at nå dette mål bruges en høj Mg- og ATP Relax-opløsning17 til at holde fibrene afslappede i mindst 2 timer, hvilket giver tilstrækkelig tid til at udføre fiberisoleringsprocessen, fluoroforbelastningen og erhvervelsen af mitokondriesignal ved konfokal mikroskopi. Et kritisk punkt i protokollen er at opnå fibrene mekanisk, da det kræver høj præcision og frisk væv; Det er dog muligt at opnå levedygtige fiberbundter fra rottemuskler med denne tidligere anvendte og rapporterede teknik28. Opnåelse af intakte fibre gør det muligt at bevare sarcolemma og det intracellulære miljø og holde den metaboliske og funktionelle krydstale mellem cellestrukturer28,29.
I modsætning til at arbejde med væv eller faste celler muliggør erhvervelsen af levende cellebilleddannelse fluorescerende billeder ved konfokal mikroskopi realtidsovervågning af effekten af forskellige eksperimentelle tilstande. Denne protokol kan bruges til at udforske ændringer i mitokondrietæthed og fordeling i realtid og udforske forskelle mellem eksperimentelle grupper, såsom eksemplerne præsenteret her mellem Lean og Ob-afledte fibre (figur 3 og figur 4). Det bør altid overvejes, at levende cellebilleddannelse indebærer standardisering af optimale arbejdsforhold med mindre celleskader. Arbejdstiden, kvaliteten af de anvendte opløsninger, anskaffelsesparametrene og eksponeringen af lasere skal kontrolleres fint. Derfor er væsentlige overvejelser nævnt nedenfor.
Mitokondrier af muskelfibre kan ikke registreres helt i længderetningen ved konfokal mikroskopi på grund af fiberens størrelse og beskadigelsen af fiberen, der kan være forårsaget af lang lasereksponering. Ikke desto mindre registreres en repræsentativ prøve af fiberen under denne teknik. Selvom det er muligt at registrere hele tykkelsen af skeletmuskelfiberen hos en rotte ved konfokal mikroskopi, indebærer dette en længere registreringstid og eksponering for laserstrålen. I tilfælde af kontrolrotter er der ikke stødt på problemer med disse optagelser. Imidlertid kan fibre fra patologiske tilstande være mere modtagelige for skader som observeret i fibrene fra Ob-rotter. Derfor foretrækkes erhvervelse af en stak repræsentative konfokale billeder opnået ved forskellige Z-afstande. Når kun et afsnit af fibertykkelse registreres, anbefales det at tage stakken i samme dybde på alle testede fibre, da mitokondriefordeling og densitet kan variere alt efter dens position i fiberen. Det anbefales at opfange signalet i en dybde over 15 μm for at opnå repræsentative konfokale billeder af IMF, så man undgår SSM-populationer, der ligger tæt på periferien.
Under den konfokale erhvervelse skal der tages hensyn til nogle vigtige overvejelser. Først valget af nedsænkningsobjektivobjektivet under hensyntagen til forstørrelsen, høj NA og nedsænkningsmedium. Da celler opretholdes i et hydrofilt inkubationsmedium, skal brydningsindekset for inkubations- og nedsænkningsmediet være ens for at opnå et godt signal og scanne dybt ind i vævet. Normalt opnås ved hjælp af en objektivlinse til nedsænkning i vand. Konfokale billeder af figur 3 og figur 4 blev erhvervet med et 20x, 0,7 NA, vandnedsænkningsmål. Dette mål tillader registrering af fiberen i al dens dybde, men scanning ved 15, 18 og 21 μm blev besluttet, da repræsentative konfokale billeder af IMF kan opnås med signal med høj fluorescensintensitet og mindre fiberskader. Anden forstørrelse, såsom 40x og olie som nedsænkningsmedium, kan overvejes, men skal evalueres.
For det andet beregnes pixelstørrelsen til billedoptagelse i henhold til Nyquist-sætningen, som gør det muligt at vælge en passende pixelstørrelse, der undgår oversample (højere lasereksponering) og undersample (fører til mindre opløsning)30. Beregningen afhænger af egenskaberne for den valgte objektivlinse og bølgelængden (~ 90 nm). Det kan justeres med zoom; Derfor giver kun én zoomindstilling en optimal pixelstørrelse30. Ikke desto mindre afhænger zoomen i praksis også af det område af prøven, der skal analyseres. At finde balance gør det således muligt at arbejde med en pixelstørrelse, der er tættest på Nyquist-kriteriet, og som også passer til det område, der skal analyseres. Figur 3 og figur 4 blev erhvervet med en pixelstørrelse på 150 og 190 nm, hvilket muliggjorde analyse af fiberens fulde bredde, som er ~ 50-80 μm.
For det tredje skal der anvendes en passende pinholediameter, der forhindrer lys ude af fokus i at nå detektoren. Typisk betragtes 1 Airy som den optimale pinhole-størrelse, da den tillader detektion af ~ 80% af fotoner, der stammer fra fokusplanet30. Ikke desto mindre kræver nogle farvede biologiske prøver, der viser lave fluorescensniveauer, en pinhole stigning30. Konfokale billeder af figur 3 og figur 4 blev erhvervet med en pinhole størrelse på 3 Airy på grund af et lavt signal fanget med en lavere Airy. Det er vigtigt at overveje, at stigningen i signalintensiteten som følge af at øge pinhole-størrelsen fører til reduktion af opløsningen på grund af øget ude af fokus fanget lys. Af denne grund anbefalede vi at bruge en pinhole størrelse så tæt på 1 luftig som muligt.
Når de er tilstrækkeligt erhvervet, kan konfokale billeder behandles for at opnå kvantitativ information om mitokondrietæthed og fordeling. Uanset hvad skal det kritiske behandlingsbilledtrin med tærskelværdi udføres før analyse for at forbedre kvantificeringen af signalet. Under dette afgørende trin defineres fluorescensintensitetsværdien, der adskiller de positive pixels for mitokondrier fra baggrundens. Tærsklen kan defineres ved en Gaussisk pasform af toppen, der repræsenterer mitokondrier, når billedets histogram viser to toppe, den ene svarende til baggrunden og den anden til mitokondrierne. Der opnås imidlertid ikke altid en bimodal fordeling i hvert af billederne, så andre tærskelværdier skal anvendes.
I denne protokol beskrives implementeringen af Otsu's tærskelværdi, som er en ikke-parametrisk og uovervåget metode designet til at finde tærskelværdien, når de to toppe ikke er adskilt, eller andre toppe er til stede31. Otsu kan let anvendes ved hjælp af en open source-platform til biologisk billedanalyse; Andre tærskelværdier kan dog testes. Den samme tærskelmetode skal anvendes på alle konfokale billeder og skal beregnes uafhængigt for hvert konfokalbillede. Anvendelse af tærsklen på en hel stak fører til forkerte resultater. Når de binære billeder er opnået efter tærskelprocessen, kan analysen af mitokondrietæthed og FFT let udføres ved at følge instruktionerne beskrevet i denne protokol. Ved udførelse af begge analyser bør man dog være omhyggelig med at undgå at medtage kerner og kapillærer, da det ville føre til kvantificeringsfejl. Med hensyn til tæthed er det nok at trække pixels eller det område, der er optaget af kernerne eller kapillærerne, fra pixels eller det samlede areal, der skal analyseres. Derudover skal det ved udførelse af FFT-analysen verificeres, at mitokondriesignalet er lige. Omvendt, når mitokondriesignalet vippes, kan det producere profiler, der ikke repræsenterer mitokondriefordelingen i længderetningen, hvilket giver forkerte FFT-spektrumdata. Derudover kan der anvendes et forbehandlingstrin for at reducere støj i billederne. Denne protokol beskriver to valgfrie forbehandlingstrin ved hjælp af et medianfilter og 2D-dekonvolution. Virkningerne af disse forbehandlingsmetoder på billed- og mitokondrietæthedsindholdet er vist i supplerende figur S1. Det er vigtigt at overveje, at selvom disse forprocesser kan forbedre billedkvaliteten, kan de også resultere i tab af visse billeddetaljer. Derfor bør de bruges med forsigtighed og konsekvent anvendes på alle de billeder, der analyseres.
På trods af dets fordele er konfokalmikroskopi begrænset af en lateral opløsning (XY) på 180-250 nm, når de optimale betingelser for erhvervelse implementeres32. Mitokondriediameter er ~ 200-700 nm, tæt på diffraktionsgrænsen for konfokal mikroskopi; Submitokondriestrukturer kan således ikke påvises tilstrækkeligt33 og kan ikke evalueres ved densitets- og FFT-analyser vist i denne protokol. Andre superopløsningsteknikker til mikroskopi, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimuleret emissionsudtømning (STED) nanoskopi eller struktureret belysningsmikroskopi (SIM), kan undersøges for at løse submitokondriestrukturer32. I denne protokol opnås de konfokale billeder af mitokondrier under anvendelse af fluoroforen TMRE, som afhænger af mitokondriemembranpotentialet. Derfor kan mitokondriel fluorescerende intensitet variere alt efter deres membranpotentiale. En tærskelproces udføres før dataanalysen for at løse dette problem. Alle pixels over en defineret tærskel betragtes som positive for mitokondriesignal uafhængigt af deres fluorescensværdi. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at mitokondrier med et meget lavt membranpotentiale ikke kan løses med denne teknik. Det anbefales derfor at gennemføre komplementære undersøgelser af kvantificering af mitokondrieproteinindholdet. En fordel ved at bruge TMRE er, at konfokale billeder også kan bruges til mitokondriemembranpotentialeanalyse, men der skal udføres tilstrækkelig kontrol med afkoblingsmidler, såsom carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP). Derudover kan instruktionerne til mitokondriel densitet og distributionsanalyse opnås ved hjælp af grønne fluorescerende indikatorer for mitokondrier, som belaster mitokondrier uanset deres membranpotentiale, men inkubationsstrategi og konfokale erhvervelsesindstillinger skal standardiseres.
I betragtning af at mitokondriestruktur er relateret til væsentlige mitokondrie og cellulære funktioner, kan protokollen beskrevet her give værdifuld information om deres ombygning under sygdom eller ved en bestemt stressfornærmelse. Det kan bidrage til en bedre forståelse af nøglefunktioner i skeletmuskulatur, der styres af mitokondrier, såsom energiproduktion, eller hvor mitokondrier spiller en vigtig rolle i samspillet med andre organeller, såsom sammentrækning-metabolisme-kobling. At følge protokolinstruktionerne tillader estimering af mitokondriel tæthed og fordeling i levende skeletmuskulatur. Protokoltrinnene er opdelt i tre hovedfaser med fokus på dissektion af skeletmuskelbundter, konfokal mikroskopiscanning og billedanalyse, hvor detaljerede instruktioner og vigtige overvejelser er inkluderet. Især kan protokollen optimeres yderligere for at udforske yderligere Z-trin til fuld mitokondriel rekonstruktion i fiberen i henhold til brugerens fornødenheder. For eksempel kan de konfokale billed- og analysetrin testes for at studere cellulære strukturer med lignende fordeling, såsom TT i levende og faste prøver.

Mitokondrier danner meget dynamiske netværk, der hovedsageligt reguleres af balancen mellem dens forlængelse (fusion) og fragmentering (fission)1,2, som moduleres af ekspression og aktivitet af proteiner som Mitofusin 1 og 2 (Mfn1 og Mfn2) og optisk proteinatrofi 1 (Opa1), som regulerer fusionen af den ydre mitokondriemembran og indre membran, henholdsvis 1,2. Dynaminrelateret protein (Drp1) regulerer overvejende mitokondriefission, når det fosforyleres i Ser6163.
I skeletmuskulaturen er det veletableret, at mitokondrienetværket er arrangeret i strukturelt veldefinerede subpopulationer baseret på deres nærhed til forskellige celleregioner (myofibriller, sarcolemma og kerner)4,5. Disse mitokondrier placeret lige under sarcolemma kaldes subsarcolemmal mitokondrier (SSM), dem placeret mellem kontraktile filamenter kaldes intermyofibrillære mitokondrier (IMF), og mitokondrie-subpopulationen omkring kernerne kaldes perinukleære mitokondrienetværk (PMN). Desuden er det blevet foreslået, at disse mitokondrie subpopulationer har regionsspecifikke funktioner og er metabolisk specialiserede 4,5.
Vedligeholdelsen af cellulær energihomeostase, som tillader metabolisk og kontraktil funktion, afhænger i vid udstrækning af interaktionen og kommunikationen på specifikke steder gennem mitokondrienetværket (f.eks. IMF og SSM-interaktion)4,6. Ud over mitokondrier netværksinteraktioner kan mitokondriet også interagere med andre organeller, der danner strukturelle og funktionelle komplekser. I denne henseende har det vist sig, at IMF kan placeres ved siden af det sarkoplasmatiske retikulum (SR) og i nærheden af Ca2+ frigivelsesenhederne (CRU), dannet af de tværgående rør (TT)7. Denne kendsgerning er relevant på grund af mitokondriel Ca2+ optagelse i reguleringen af ATP-syntese og apoptose. For nylig er en potentiel rolle i reguleringen af cytosoliske Ca2+ transienter også blevet foreslået8.
TT er invaginationer af sarcolemma, der har en periodisk fordeling langs længdeaksen af kardiomyocytter og skeletmuskelfibre 9,10, svarende til IMF-fordelingen 5. Ændringer i fordelingen af TT har vigtige fysiologiske implikationer på grund af deres rolle i kontraktil funktion. Disse ændringer er imidlertid hovedsageligt blevet evalueret i kardiomyocytter. Brug af Fast Fourier Transform (FFT) analyse tillader konvertering af periodiske signaler fra afstandsdomænet til frekvensdomænet, hvilket resulterer i et FFT-spektrum, der angiver frekvensen og regelmæssigheden af signalet11,12,13. Selvom der er tegn på, at organiseringen af mitokondrienetværket i skeletmuskelfibre er afgørende for tilpasning til forskellige metaboliske forhold, som under regenerering efter muskelskade14,15, udføres de fleste analyser kvalitativt.
Da mitokondriel dysfunktion desuden har været forbundet med flere skeletmuskelrelaterede (f.eks. atrofi uden brug)2 og ikke-muskelsygdomme, især stofskiftesygdomme, og det dermed forbundne tab af muskelmasse (dvs. atrofi)16, er den kvantitative evaluering af mitokondrienetværket og fordelingen i skeletmuskulaturen relevant. For nylig er en signifikant forskel i den langsgående fordeling af mitokondrier af gastrocnemius muskelfibre mellem en overvægtig gruppe (Ob; Zucker fa/fa rotter), og en mager gruppe (Lean; Zucker +/+ rotter) blev identificeret gennem FFT17. Denne undersøgelse viste nytten af FFT til analyse af mitokondriefordelingen. Derfor præsenterer denne protokol en metode til undersøgelse af mitokondrier i levende skeletmuskelfibre fra billeder opnået ved fluorescenskonfokal mikroskopi. Mitokondrietæthed kvantificeres ved baggrundstærskel, og analysen af langsgående mitokondriefordeling ved FFT-analyse beskrives også. Et workflow-skema er vist i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass coverslip</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope software Leica Application Suite&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.7.3.9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td>
			<td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#180;N&#180;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>MH-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(-)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxchelator</td>
			<td>UC Davis Health</td>
			<td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-source platform for biological-image analysis Fiji&#160;</td>
			<td>Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSF Generator (PSF_Generator.jar)</td>
			<td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, ethyl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T669</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the mitochondrial density and longitudinal distribution in rat live-skeletal muscle fibers by confocal microscopy

Mitokondriet er en organel, der kan forlænges, fragmenteres og renoveres i henhold til cellernes metaboliske krav. Ombygningen af mitokondrienetværket gør det muligt for sunde mitokondrier at imødekomme cellulære krav; Tabet af denne kapacitet har imidlertid været relateret til udviklingen eller progressionen af forskellige patologier. I skeletmuskulatur observeres mitokondrietæthed og distributionsændringer i fysiologiske og patologiske tilstande som motion, aldring og fedme, blandt andre. Derfor kan undersøgelsen af mitokondrienetværket give en bedre forståelse af mekanismer relateret til disse forhold.
Her beskrives en protokol for mitokondriebilleddannelse af levende skeletmuskelfibre fra rotter. Fibre dissekeres manuelt i en afslappende opløsning og inkuberes med en fluorescerende levende cellebilleddannelsesindikator for mitokondrier (tetramethylrhodamin ethylester, TMRE). Mitokondriesignalet registreres ved konfokalmikroskopi ved hjælp af XYZ-scanningstilstanden for at opnå konfokale billeder af det intermyofibrillære mitokondrie (IMF) netværk. Derefter behandles de konfokale billeder ved tærskel og binarisering. Det binariserede konfokale billede tegner sig for de positive pixels for mitokondrier, som derefter tælles for at opnå mitokondrietætheden. Mitokondrienetværket i skeletmuskulatur er kendetegnet ved en høj tæthed af IMF-population, som har en periodisk langsgående fordeling svarende til T-tubuli (TT). Fast Fourier Transform (FFT) er en standardanalyseteknik, der udføres for at evaluere fordelingen af TT, der gør det muligt at finde distributionsfrekvensen og niveauet for deres organisation. I denne protokol beskrives implementeringen af FFT-algoritmen til analyse af den langsgående mitokondriefordeling i skeletmuskulatur.

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

Efter denne protokol kan analysen af mitokondriernes tæthed og fordeling opnås i levende skeletmuskulatur. Protokollen er opdelt i tre hovedfaser: Dissektion af skeletmuskelbundt, konfokal mikroskopiscanning og billedanalyse. Oversigten over arbejdsgange vises i figur 1. Figur 2A viser en hel rotte gastrocnemius muskel i en petriskål, der markerer sidehovedet, hvorfra fibrene opnås, mens figur 2B viser fiberbundterne i Relax-opløsningen. Ved konfokal mikroskopi kan mitokondrierne registreres langs dybden af levende skeletmuskelfibre ved hjælp af fluorescerende indikator TMRE. TMRE er en lipofil kationisk fluorofor, der selektivt akkumuleres i mitokondrier i henhold til mitokondriemembranpotentialet20.
Et optimalt konfokalbillede af IMF kan opnås ved at vælge en Z-afstand over 15 μm dybde i fiberen (figur 3A). Figur 3B viser repræsentative XY-konfokale billeder af mitokondrier fyldt med TMRE erhvervet langs gastrocnemius muskelfibres Z-afstand (15 til 21 μm). De konfokale billeder blev behandlet ved tærskelværdi for at omdanne dem til binære billeder for at muliggøre mitokondrieanalyse. Figur 3B (venstre panel) viser en fiber fra en trænet mager rotte. Det repræsenterer en forventet konfokal registrering af skeletmuskelfibermitokondrier, da den har et konsistent mønster langs fiberen. I modsætning hertil valgte vi en fiber fra en Ob-rotte (figur 3B, højre panel), der viser betydelige ændringer i mitokondrieindhold og distribution. Figur 3C viser kvantificeringen af fiberarealet optaget af mitokondrierne udtrykt som mitokondrietæthed, opnået fra hvert binariseret billede (vist i panel B). Som forventet præsenterede Ob-fiberen en lavere mitokondrietæthed. Det blev kvantificeret konsekvent langs den analyserede Z-afstand, hvilket også observeres i figur 3D , når mitokondrietætheden beregnes pr. Stak i overensstemmelse med de tre konfokale billeder erhvervet ved 15, 18 og 21 μm.
I lighed med mitokondriedensitetsanalysen giver den konfokale scanning af en fluorescerende indikator for levende cellebilleddannelse, såsom TMRE, mulighed for at studere den langsgående organisering af mitokondrier i levende skeletmuskulatur. IMF præsenterer en periodisk organisation i I-båndet tæt på TT7, som kan analyseres af FFT for at kvantificere frekvensen af mitokondriesignalet og organisationsniveauet17. Figur 4 viser forskellene i IMF's organisation fundet i gastrocnemius afledt af Lean og Ob rotter, og hvordan FFT gør det muligt at finde ændringerne i fordelingen af mitokondriesignalet. Figur 4A, B udviser langsgående ROI'er valgt i en central og lateral position i fiberen til FFT-analyse. Før FFT udføres, beregnes tærsklen for baggrundssubtraktion. Derefter binariseres billedet; Disse procedurer eliminerer variationerne i mitokondriesignalets fluorescensintensitetsniveauer. Det binære billede giver plotprofilen for fluorescensfordeling, der er nødvendig for at udføre FFT.
Figur 4C,D viser de valgte investeringsafkast i panel A og B med deres plotprofiler (øverste paneler). Fra plotprofilerne kan der observeres forskelle i fluorescensfordelingen mellem fibrene afledt af Lean og Ob-rotter såvel som variationerne mellem ROI'er inden for samme fiber. For hver områdeprofil præsenteres deres respektive FFT-spektrum (nederste paneler). Toppen af det maksimale FFT-spektrum angiver FFT-frekvensen (X-aksen) for mitokondriesignalfordelingen langs længdeaksen. Det kan omdannes til en afstandsværdi tæt på 2 μm i de laterale og centrale ROI'er fra Lean-rotten. Især er FFT-størrelsen af toppen et indeks for mitokondriesignalets regelmæssighed, og ændringer i denne amplitude afslører ændringer i mitokondriefordelingen.
Figur 4E, F viser forskellene i FFT-spektret mellem Lean og Ob-afledte fibre, hvor laterale og centrale ROI'er blev analyseret, henholdsvis. I laterale ROI'er (figur 4E) var hyppigheden af mitokondriel langsgående fordeling ens i de magre og obafledte fibre; ikke desto mindre var amplituden af den maksimale FFT-top i de obafledte fibre højere, hvilket er i overensstemmelse med den højere regelmæssighed af signalet, der observeres på billedet i figur 4B. Ikke desto mindre observeres den centrale ROI (figur 4F) af Ob som et eksempel på en kritisk reduktion af FFT-toppen sammenlignet med Lean, når en vigtig ændring af mitokondriefordelingen er til stede.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> Figur 1: Skema til mitokondrieanalyse i skeletmuskulatur ved konfokal mikroskopi. Denne ordning opsummerer protokollens vigtigste trin i tre separate faser. Den første fase, dissektion af gastrocnemius muskelfiberbundter, er opdelt i tre efterfølgende trin, gastrocnemius muskelisolering, efterfulgt af muskelmekanisk dissektion i bundter for endelig at foretage et visuelt valg af de levedygtige. Den anden fase består af levende cellebilleddannelse erhvervelse ved konfokal mikroskopi, som består af inkubation med fluoroforen (TMRE) i 20 minutter ved stuetemperatur for at placere fibrene i kammeret. Derefter foretages de relevante indstillinger i mikroskopet for at foretage erhvervelsen af de konfokale billeder. I tredje fase udføres konfokal billedbehandling og dataanalyse. Startende med billedbehandling, hvor der kræves en tærskel for at generere binære billeder, hvorfra mitokondriedensitetsberegninger og mitokondriefordeling med FFT udføres. Forkortelser: TMRE = tetramethylrhodamin ethylester; FFT = Hurtig Fourier-transformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> Figur 2: Dissektion af skeletmuskelbundt. (A ) Dissekeret rotte lateral gastrocnemius hoved (sort pil) i en petriskål med Relax opløsning. (B) Repræsentativt billede af gastrocnemius muskelfiberbundter i Relax-opløsning før TMRE-indlæsning. Forkortelse: TMRE = tetramethylrhodamin ethylester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> Figur 3: Mitokondrietæthedsanalyse. (A) Illustration, der repræsenterer den Z-afstand, der anbefales til konfokal scanning af IMF-mitokondrier i skeletmuskelfibre. (B) Serie af konfokale billeder af mitokondrier fyldt med TMRE i skeletmuskelfibre, opnået fra en trænet Zucker +/+ rotte (Lean) og fra en overvægtig Zucker fa /fa-rotte (Ob) optaget i Z-afstanden (fra 15 til 21 μm dybde). Billederne blev behandlet ved tærskelværdi og omdannet til binære billeder. C) Beregnet mitodensitet af de konfokale skiver opnået ved forskellige Z-afstande observeret i panel B. D) Mitodensiteten opnået fra stakken, der består af billederne observeret i panel B. Billeder i panel B er 65 x 50 μm. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: Mitodensitet = Mitokondrietæthed; IMF = intermyofibrillære mitokondrier; Ob = Overvægtig; SSM = subsarcolemmal mitokondrier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> Figur 4: Mitokondriefordelingsanalyse ved FFT. Repræsentative konfokale billeder af mitokondrier fyldt med fluorescerende indikator TMRE erhvervet ved 21 μm af dybden af skeletmuskelfibre opnået fra en trænet Zucker +/+ rotte (Lean, panel A) og fra en overvægtig Zucker fa /fa-rotte (Ob, panel B). Billederne blev behandlet ved tærskelværdi og omdannet til binære billeder. Laterale og centrale ROI'er fra panel A (panel C) og panel B (panel D) med deres respektive områdeprofiler af fluorescensintensitet (øvre plot) og FFT-spektrum (nedre plot). FFT blev beregnet ud fra ROI'er med 256 pixels bredde, hvilket svarer til en ROI-størrelse på 39 x 5 μm i panel A og en ROI-størrelse på 50 x 5 μm i panel B. Panel E viser forskellene i FFT-spektret fundet mellem mitokondrier afledt af Lean og Ob-rotter i lateral ROI, mens panel F viser forskellene i FFT-spektret af central ROI. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: A.U. = vilkårlige enheder; FFT = hurtig Fourier-transformation; ROI'er = interesseregioner Ob = Overvægtig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration i 100 ml</td>
			<td>Lager </td>
		</tr><tr><td>K-aspartat</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>KCl</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-glutaminsyre</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Æblesyre</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM fri Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2 Annoncer</td>
			<td>0,00002 mM gratis Ca2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fosfokreatin di-Na</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr><tr><td>Kreatinkinase</td>
			<td>5 U/ml</td>
			<td>200 U/ml</td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7,3 (med NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Slap af opløsningsreagenser og koncentration.
Supplerende figur S1: Virkning af billedbehandlingsmetoder. (A) Repræsentative konfokale billeder af mitokondrier fyldt med fluorescerende indikator TMRE erhvervet i en dybde på 18 μm i skeletmuskelfibre opnået fra en trænet Zucker +/+ rotte (Lean, øverste panel) og fra en overvægtig Zucker fa /fa-rotte (nederste panel) sammen med deres respektive billeder opnået efter forbehandling ved hjælp af Otsu' tærskelværdi, medianfilter og Otsu' tærskelværdi, og 2D deconvolution og Otsu' tærskelværdi. B) Mitodensitetens plotprofil opnået ud fra de konfokale billeder (panel A) efter forbehandling med forskellige metoder. Billeder i panel A er 65 x 50 μm. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: 2D-Decon = 2D dekonvolution; Mito-densitet = mitokondriel tæthed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Remodeling in Skeletal Muscle at JoVE.com

Mitochondrial Remodeling in Skeletal Muscle (Video) | JoVE

Her præsenterer vi en protokol til analyse af ændringer i mitokondrietæthed og langsgående fordeling ved billeddannelse af levende skeletmuskler ved hjælp af konfokalmikroskopi til mitokondrienetværksscanning.

Analyse af mitokondrietæthed og langsgående fordeling i rotte levende skeletmuskelfibre ved konfokal mikroskopi

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

Ombygningen af mitokondrienetværket forekommer i fysiologisk stress og patologiske tilstande. Imidlertid forbliver virkningerne af mitokondriel remodellering i en skeletmuskel ufuldstændigt forstået. Denne protokol muliggør kvantificering af ændringer i mitokondrier i levende skeletmuskulatur, hvilket forbedrer vores forståelse af samspillet mellem mitokondrieændringer og cellulær funktion.Arbejde med levende skeletmuskler giver udfordringer på grund af fiberkontraktion under isolering og følsomhed over for billede under konfokal scanning. Denne protokol beskriver en isolationsproces ved hjælp af en afslapningsløsning, der muliggør analyse af levedygtige muskelfibre til mitokondrievurdering via konfokal mikroskopi. Vores protokol adresserer manglen på arbejdsgange til at analysere kvantitativt mitokondrienetværk i skeletmuskelfibre.De trin, der er beskrevet her, giver brugerne mulighed for at drage større fordel af billeder opnået ved konfokal mikroskopi ved hjælp af billedbehandling ved tærskelværdi og hurtig Fourier-analyse for at opnå kvantificering af mitokondrietæthed og distribution. Vi er interesserede i undersøgelsen af skeletmuskelændring, især mitokondriedynamik og mitokondriel strukturel ombygning under modgang, og hvordan kan de moduleres gennem intervention som motion og mellemliggende faste.