Name: Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-02T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability at JoVE.com

Agradecemos al Dr. J. Vergara (Universidad de California, Los Ángeles) por compartir el plásmido de tipo salvaje EGFP-CaV1.1 (conejo). Agradecemos al Laboratorio de Electrónica del Departamento de Fisiología de Yale y especialmente a Henrik Abildgaard por el diseño y la construcción del fotodiodo con circuito de seguimiento y retención. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01-AR075726 y R01-NS103777 de los Institutos Nacionales de Salud

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Maryland. El siguiente protocolo se ha dividido en múltiples subsecciones, que consisten en (1) diseño de constructo molecular y selección de colorante de reacción a cisteína, (2) electroporación in vivo , (3) disección muscular y aislamiento de fibras, (4) descripción de la configuración de adquisición, (5) evaluación de la actividad eléctrica de fibra positiva de proteína fluorescente verde m...

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Skeletal Muscle Cells

Aquí, se describe un protocolo paso a paso para realizar FSDF en fibras musculares para el estudio de movimientos individuales del sensor de voltaje del canal CaV1.1. Aunque el número de pasos y la diversidad de enfoques que se combinan en esta técnica pueden parecer complejos, la mayoría de estas técnicas a menudo se utilizan de forma rutinaria en laboratorios de biofísicos / biólogos celulares. Por lo tanto, la complejidad aparente reside principalmente en la combinación de todos los diversos enfoque...

La capacidad de rastrear reordenamientos conformacionales del canal iónico en respuesta a un estímulo eléctrico conocido en una célula viva es una fuente de información valiosa para la fisiología molecular1. Los canales iónicos dependientes de voltaje son proteínas de membrana que detectan cambios en el voltaje transmembrana, y su función también se ve afectada por los cambios de voltaje2. El desarrollo de técnicas de pinza de voltaje en el siglo pasado permitió a los fisiólogos estudiar, en tiempo real, las corrientes iónicas transportadas por canales iónicos dependientes de voltaje en respuesta a la despolarización de la membrana3. El uso de la tecnología de pinza de voltaje ha sido crucial para comprender las propiedades eléctricas de las células excitables, como las neuronas y los músculos. En la década de 1970, el refinamiento de la abrazadera de voltaje permitió la detección de corrientes de entrada (o movimiento de carga) en los canales de calcio (Ca V) y sodio (NaV) dependientes de voltaje 4,5. Las corrientes de activación son corrientes capacitivas no lineales que surgen del movimiento de los sensores de voltaje en respuesta a cambios en el campo eléctrico a través de la membrana celular6. Las corrientes de activación se consideran una manifestación eléctrica de los reordenamientos moleculares que preceden o acompañan a la apertura del canal iónico7. Si bien estas mediciones de corriente proporcionan información valiosa sobre la función del canal, tanto las corrientes iónicas como las corrientes de compuerta son lecturas indirectas de reordenamientos conformacionales intermoleculares e intramoleculares de canales dependientes de voltaje7.
La fluorometría funcional dirigida al sitio (FSDF; también conocida como fluorometría de pinza de voltaje, VCF) se desarrolló a principios de la década de 19908 y, por primera vez, proporcionó la capacidad de ver directamente los cambios conformacionales locales y la función de una proteína de canal en tiempo real. Utilizando una combinación de mutagénesis de canales, electrofisiología y sistemas de expresión heterólogos, es posible etiquetar y rastrear fluorescentemente las partes móviles de canales o receptores específicos en respuesta al estímulo activador 9,10. Este enfoque se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de detección de voltaje en canales iónicos dependientes de voltaje 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Para revisiones autorizadas, véase 10,20,21,22,23.
Los canales Ca V y NaV, críticos para la iniciación y propagación de señales eléctricas, están compuestos por una subunidad principal α1, que posee un poro central y cuatro dominios de detección de voltaje no idénticos2. Además de su estructura primaria distinta, los canales Ca V y NaV se expresan como complejos multisubunidades con subunidades auxiliares24. Los canales de potasio dependientes del voltaje (K V) consisten en cuatro subunidades que se parecen a un solo dominio de Na V o CaV25. La subunidad α1 formadora de poros y sensible a voltaje de los canales Ca V y NaV está formada por un único polipéptido que codifica cuatro dominios individuales de seis segmentos transmembrana únicos (S1-S6; Figura 1A) 24,26. La región compuesta por segmentos transmembrana S1 a S4 forma el dominio de detección de voltaje (VSD) y los segmentos transmembrana S5 y S6 forman el dominio poro26. En cada CIV, la hélice α S4 contiene arginina o lisina cargadas positivamente (Figura 1A,B) que se mueven en respuesta a la despolarización de la membrana7. Varias décadas de investigación y los resultados de enfoques experimentales muy diversos apoyan la premisa de que los segmentos S4 se mueven hacia afuera, generando corrientes de compuerta, en respuesta a la despolarización de la membrana6.
FSDF mide los cambios de fluorescencia de un colorante tiol-reactivo conjugado a un residuo específico de cisteína (es decir, la α-hélice S4) en un canal iónico u otra proteína, diseñada a través de mutagénesis dirigida al sitio, ya que el canal funciona en respuesta a la despolarización de la membrana u otros estímulos10. De hecho, FSDF se desarrolló originalmente para investigar si el segmento S4 en los canales KV, propuesto para ser el sensor de voltaje principal del canal, se mueve cuando las cargas de compuerta se mueven en respuesta a cambios en el potencial de membrana 8,10. En el caso de canales iónicos dependientes de voltaje, FSDF puede resolver reordenamientos conformacionales independientes de los cuatro VSD (rastreando un VSD en un momento dado), simultáneamente con mediciones de función de canal. De hecho, utilizando este enfoque, se ha demostrado que los VSD individuales parecen estar involucrados diferencialmente en aspectos específicos de la activación e inactivación de canales 12,27,28,29,30. La identificación de la contribución de cada VSD a la función de los canales es de gran relevancia y se puede utilizar para dilucidar aún más el funcionamiento del canal y potencialmente identificar nuevos objetivos para el desarrollo de fármacos.
El uso de FSDF en sistemas de expresión heterólogos ha sido extremadamente útil para ampliar nuestra comprensión de la función del canal desde una perspectiva reduccionista10,23. Como muchos enfoques reduccionistas, presenta ventajas pero también tiene limitaciones. Por ejemplo, una limitación importante es la reconstitución parcial del nanoambiente del canal en el sistema heterólogo. A menudo, los canales iónicos interactúan con numerosas subunidades accesorias y muchas otras proteínas que modifican su función31. En principio, diferentes canales y sus subunidades accesorias pueden expresarse en sistemas heterólogos con el uso de múltiples constructos codificantes de proteínas o plásmidos policistrónicos, pero su ambiente nativo no puede ser completamente reconstituido30,32.
Nuestro grupo publicó recientemente una variante de FSDF en fibras musculares esqueléticas disociadas nativas para el estudio de los primeros pasos del acoplamiento excitación-contracción (ECC)33,34, el proceso por el cual la despolarización eléctrica de la fibra muscular está vinculada a la activación de la contracción muscular 35,36. Por primera vez, este enfoque permitió el seguimiento del movimiento de sensores de voltaje S4 individuales del canal Ca2+ tipo L activado por voltaje (CaV1.1, también conocido como DHPR) en el ambiente nativo de una fibra muscular diferenciada adulta37. Esto se logró considerando múltiples características de este tipo de célula, incluida la actividad eléctrica de la célula que permite la despolarización autopropagada inducida por estimulación rápida, la capacidad de expresar plásmido de ADNc a través de electroporación in vivo, la alta expresión natural y la organización compartimental de los canales dentro de la célula, y su compatibilidad con dispositivos de imagen de alta velocidad y grabación electrofisiológica. Anteriormente, utilizamos un microscopio confocal de barrido lineal de alta velocidad como dispositivo de detección37. Ahora, se presenta una variación de la técnica utilizando un fotodiodo para la adquisición de señales. Este sistema de detección basado en fotodiodos podría facilitar la implementación de esta técnica en otros laboratorios.
Aquí, se describe un protocolo paso a paso para utilizar FSDF en celdas nativas para el estudio del movimiento individual del sensor de voltaje de CaV1.1. Si bien el canal CaV1.1 se ha utilizado como ejemplo a lo largo de este manuscrito, esta técnica podría aplicarse a dominios extracelularmente accesibles de otros canales iónicos, receptores o proteínas de superficie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>H3884-50mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EP022363719-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z683531-100EA</td>
			<td>tuberculine slip tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#8221; long 29-gauge sterile insulin needle and syringe</td>
			<td>Becton Dikinson</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm non coated plastic plate</td>
			<td>Falcon, Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcoholic whip</td>
			<td>PDI</td>
			<td>B60307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-533 cube LP</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49907</td>
			<td>Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arc lamp</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>LB-LS 672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears cream</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>203895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type I</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWR-76048-960-BG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double electrode array&#160; (for electroporation)</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>45-0120</td>
			<td>10mm 2 needle array tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGFP cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39002AT</td>
			<td>Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation apparatus device</td>
			<td>BTX harvard apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPC10</td>
			<td>HEKA Elektronik GmbH&#160; (Harvard Bioscience)</td>
			<td>895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biotechne,&#160; R&#38;D Systems</td>
			<td>RND-S11150H</td>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip 35 mm dish</td>
			<td>MatTek Life Science</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation</td>
			<td>502017-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal heating pad</td>
			<td>Braintree scientific inc</td>
			<td>39DP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>INV-23017015</td>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex bulb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 530 nm</td>
			<td>Sutter Instrumets</td>
			<td>5A-530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding protein 0.2 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Pall</td>
			<td>FG4579</td>
			<td>acrodisk&#160; syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>89410-784</td>
			<td>MTS-5-TAMRA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro Analysis Software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>OriginPro 2022 (64-bit) SR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo 60x oil&#160; 1.4 N.A/&#8734;/0.17</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BFPC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>267228-1G</td>
			<td>To manufacyte field stimulation electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Generator</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Pulsemaster A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shutter drive controller</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>100-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttter</td>
			<td>Uniblitz</td>
			<td>VS2582T0-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>INV-11380037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DSI-B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>SIGMA ALDRICH</td>
			<td>S8776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1419447-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer for Anesthesia</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage generator</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional site-directed fluorometry in native cells to study skeletal muscle excitability

La fluorometría funcional dirigida al sitio ha sido la técnica elegida para investigar la relación estructura-función de numerosas proteínas de membrana, incluidos los canales iónicos dependientes de voltaje. Este enfoque se ha utilizado principalmente en sistemas de expresión heterólogos para medir simultáneamente las corrientes de membrana, la manifestación eléctrica de la actividad de los canales y las mediciones de fluorescencia, informando reordenamientos de dominio local. La fluorometría funcional dirigida al sitio combina electrofisiología, biología molecular, química y fluorescencia en una sola técnica de amplio alcance que permite el estudio de reordenamientos estructurales en tiempo real y la función a través de la fluorescencia y la electrofisiología, respectivamente. Por lo general, este enfoque requiere un canal de membrana dependiente de voltaje diseñado que contenga una cisteína que pueda ser probada por un tinte fluorescente reactivo al tiol. Hasta hace poco, la química tiol-reactiva utilizada para el marcado fluorescente dirigido al sitio de proteínas se llevaba a cabo exclusivamente en ovocitos y líneas celulares de Xenopus , restringiendo el alcance del enfoque a las células primarias no excitables. Este informe describe la aplicabilidad de la fluorometría funcional dirigida al sitio en células musculares esqueléticas adultas para estudiar los primeros pasos del acoplamiento excitación-contracción, el proceso por el cual la despolarización eléctrica de la fibra muscular está relacionada con la activación de la contracción muscular. El presente protocolo describe las metodologías para diseñar y transfectar canales de Ca2+ dependientes de voltaje diseñados con cisteína (CaV1.1) en fibras musculares del flexor digitorum brevis de ratones adultos utilizando electroporación in vivo y los pasos posteriores requeridos para mediciones funcionales de fluorometría dirigida al sitio. Este enfoque se puede adaptar para estudiar otros canales iónicos y proteínas. El uso de la fluorometría funcional dirigida al sitio del músculo de mamífero es particularmente relevante para estudiar los mecanismos básicos de excitabilidad.

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Cuando los potenciales de acción de propagación se activan en respuesta a la estimulación repetitiva del campo, es posible rastrear el movimiento específico del sensor de voltaje en respuesta a una frecuencia específica de despolarización. Como se muestra en la Figura 6A, el movimiento de las hélices marcadas con VSD-II se puede rastrear en respuesta a cada una de las dos despolarizaciones sucesivas aplicadas a 10 Hz (es decir, espaciadas por 100 ms). El blanqueamiento de la señal se...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability at JoVE.com

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability (Video) | JoVE 

La fluorometría funcional dirigida al sitio es un método para estudiar los movimientos del dominio de la proteína en tiempo real. La modificación de esta técnica para su aplicación en células nativas ahora permite la detección y el seguimiento de movimientos de un solo sensor de voltaje de canales Ca2+ dependientes de voltaje en fibras musculares esqueléticas aisladas murinas.

Fluorometría funcional dirigida al sitio en células nativas para estudiar la excitabilidad del músculo esquelético

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

CaV1.1, un miembro de los canales iónicos dependientes de voltaje, tiene cuatro sensores de voltaje distintos. La evidencia sugiere que algunos sensores de voltaje contribuyen más a la activación del receptor de rianodina o a la corriente de calcio. Nuestro objetivo es poder identificar el papel preciso de cada sensor de voltaje en el acoplamiento excitación-contracción y la activación del canal de calcio.El acoplamiento excitación-contracción se ha estudiado desde principios de los años 50, sin embargo, los detalles moleculares de cómo ocurre este proceso aún se desconocen. El reciente avance en la estructura microscópica ciroelectrónica del canal, la caracterización de la nueva proteína accesoria CaV1.1, el descubrimiento de la variante de empalme alternativo del canal y la identificación de mutaciones causantes de enfermedades han reavivado el interés en este campo. Muchas técnicas se utilizan en nuestro campo, desde la electrofisiología clásica y la biología molecular hasta técnicas más novedosas como la microscopía crioelectrónica, la simulación dinámica molecular, la degradación de proteínas dirigidas y la fluorometría funcional dirigida al sitio, así como células modificadas o modelos animales.Actualmente, el combustible enfrenta varios desafíos experimentales. En un músculo esquelético, el tráfico adecuado y la comunicación entre CaV1.1 y RyR1, junto con muchas proteínas reguladoras, es crucial para apoyar el acoplamiento excitación-contracción. Los métodos para estudiar directamente estas interacciones proteína-proteína entre CaV1.1 y RyR1 faltan o están incompletos.El laboratorio del Dr. Martin Schneider ha estado trabajando en el acoplamiento excitación-contracción durante décadas, caracterizando los mecanismos de detección de voltaje en CaV1.1, la liberación de calcio y los eventos localizados de liberación de calcio, conocidos como chispas de calcio. Recientemente, nuestro laboratorio ha estado implementando nuevas técnicas ópticas para investigar varios pasos del acoplamiento excitación-contracción y el movimiento del sensor de voltaje en células musculares adultas funcionales. Si bien esto se ha hecho anteriormente en un sistema de expresión heterólogo, nuestro protocolo ahora permite rastrear cambios conformacionales en sensores de voltaje CaV1.1 durante un potencial de acción propagado en su entorno nativo.Nuestra nueva técnica nos permitirá investigar el movimiento preciso del sensor de voltaje necesario para el acoplamiento excitación-contracción. Queremos saber qué residuo de carga en cada S4 es crítico para su función, o exactamente cada translocación de S4, y toda esa translocación está relacionada con la apertura de CaV1.1 o la activación del receptor de rianodina.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigación

Biología

Construct Design for Transfecting Cysteine-Engineered Voltage-Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers

Construct Design for Transfecting Cysteine-Engineered Voltage-Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers (Video) | JoVE 

Diseño de construcción para transfectar canales de Ca2+ dependientes de voltaje diseñados con cisteína en fibras musculares esqueléticas aisladas murinas