Name: Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-04-14T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos at JoVE.com

Los autores agradecen a Ann Lavanway por el apoyo a las imágenes. Los autores agradecen al laboratorio de Wieschaus y al laboratorio de De Renzis por compartir reactivos y al Bloomington Drosophila Stock Center por las poblaciones de moscas. Este estudio cuenta con el apoyo de NIGMS, ESI-MIRA R35GM128745 y la Subvención de Investigación Institucional de la Sociedad Americana Contra El Cáncer #IRG-82-003-33 a BH.

1. Configurar el cruce genético y preparar la copa de recolección de óvulos
<ol><li>Seleccionar moscas hembras (vírgenes) de la línea optogenética UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) en una almohadilla de CO2 bajo un microscopio estereoscópico y se estableció un cruce con moscas macho de la línea conductora materna GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherina-GFP. NOTA: El 67 y el 15 representan la tubulina-GAL4 materna insertada en el segundo (II) y tercer (III) cromosomas, r...

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Este protocolo describe el uso combinado de la optogenética y la ablación con láser para sondear los cambios en la tensión tisular inmediatamente después de la inactivación de la contractilidad de la actomiosina. La herramienta optogenética descrita aquí aprovecha la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inhibir agudamente la contractilidad endógena de Rho1 y actomiosina dependiente de Rho1. La caracterización previa de Opto-Rho1DN en el contexto de la formación del surco ventral de Drosophila</em...

La contractilidad de la actomiosina, la fuerza contráctil ejercida por la miosina II no muscular (en adelante, «miosina») sobre la red de actina F, es una de las fuerzas más importantes en el cambio de la forma celular y en la morfogénesis a nivel tisular 1,2. Por ejemplo, la activación de la contractilidad de la actomiosina en el dominio apical de las células epiteliales da lugar a la constricción apical, lo que facilita una variedad de procesos morfogenéticos, incluido el plegamiento epitelial, la extrusión celular, la delaminación y la cicatrización de heridas 3,4,5,6,7 . La activación de la miosina requiere la fosforilación de su cadena ligera reguladora. Esta modificación alivia la conformación inhibitoria de las moléculas de miosina, permitiéndoles formar haces de filamentos de miosina bipolares con múltiples dominios de cabeza en ambos extremos. Los filamentos bipolares de miosina impulsan el movimiento antiparalelo de los filamentos de actina y dan lugar a la generación de fuerza contráctil 1,8,9.
La pequeña GTPasa RhoA (Rho1 en Drosophila), conservada evolutivamente, desempeña un papel central en la activación de la contractilidad de la actomiosina en diversos contextos celulares10,11. Rho1 funciona como un interruptor bimolecular al unirse a GTP (forma activa) o GDP (forma inactiva)12. El ciclo entre Rho1 unido a GTP o GDP está regulado por sus proteínas activadoras de GTPasa (GAPs) y factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs)13. La función de los FMAM es facilitar el intercambio del PIB por el PIB y activar así la actividad de Rho1. Los GAPs, por otro lado, mejoran la actividad GTPasa de Rho1 y, por lo tanto, desactivan Rho1. La Rho1 activada promueve la contractilidad de la actomiosina a través de la interacción y la activación de sus efectores posteriores, la quinasa asociada a Rho (Rok) y la diáfana14. Rok induce la activación de la miosina y la contractilidad de la actomiosina mediante la fosforilación de la cadena ligera reguladora de la miosina15. Además, Rok también inhibe la fosfatasa de cadena ligera reguladora de la miosina y, por lo tanto, promueve aún más el ensamblaje del filamento de miosina16. Rok también puede fosforilar las quinasas LIM, que, cuando se activan, evitan el desensamblaje de la actina al fosforilar e inhibir el factor de despolimerización de actina cofilina17,18. Diaphanous es un nucleador de actina de la familia de las forminas que promueve la polimerización de la actina, proporcionando una base para que la miosina interactúe con 19,20,21.
Si bien los mecanismos celulares que activan la contractilidad de la actomiosina han sido bien dilucidados, nuestra comprensión de su función en la regulación de la remodelación dinámica de los tejidos sigue siendo incompleta. Llenar este vacío de conocimiento requiere enfoques que puedan inactivar rápidamente la actomiosina en regiones específicas del tejido in vivo y registrar el impacto inmediato en el comportamiento y las propiedades de los tejidos. Este protocolo describe el uso de un enfoque optogenético para inhibir agudamente la contractilidad de la actomiosina durante la invaginación del mesodermo de Drosophila, seguida de la medición de la tensión epitelial mediante ablación láser. Durante la gastrulación de Drosophila, las células precursoras del mesodermo localizadas ventralmente sufren constricción apical y se invaginan desde la superficie del embrión formando un surco orientado antero-posterior22,23. La formación de surcos ventrales se ha utilizado durante mucho tiempo como modelo para estudiar el mecanismo de plegamiento epitelial. La formación del surco ventral es administrada por el sistema de patrones dorsal-ventral en Drosophila24,25,26,27. La expresión de dos factores de transcripción, Twist y Snail, localizados en el lado ventral del embrión, controla la formación del surco ventral y especifica el destino de las células mesodérmicas28. Twist y Snail activan el reclutamiento de Rho1 GEF RhoGEF2 al ápice de las células precursoras del mesodermo a través de una vía receptora acoplada a proteína G y una proteína adaptadora RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. A continuación, RhoGEF2 activa la miosina en toda la superficie apical del mesodermo potencial a través de la vía de la quinasa Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. La miosina activada forma una red supracelular de actomiosina a lo largo de la superficie apical del primordio del mesodermo, cuyas contracciones impulsan la constricción apical y dan lugar a un rápido aumento de la tensión del tejido apical 14,37,40.
La herramienta optogenética descrita en este protocolo, Opto-Rho1DN, inhibe la contractilidad de la actomiosina a través del reclutamiento en la membrana plasmática dependiente de la luz azul de una forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN)41. Una mutación T19N en Rho1DN elimina la capacidad de la proteína mutante para intercambiar GDP por GTP y, por lo tanto, hace que la proteína esté perpetuamente inactiva34. Una mutación posterior en Rho1DN, C189Y, elimina su señal de direccionamiento de membrana 42,43. Cuando Rho1DN se infunde en la membrana plasmática, se une a los GEF de Rho1 y los incauta, bloqueando así la activación de Rho1, así como la activación mediada por Rho1 de la miosina y la actina34,44. El reclutamiento de Rho1DN en la membrana plasmática se logra a través de un módulo de dimerización dependiente de la luz derivado del criptocromo 2 y su socio de unión CIB1. El criptocromo 2 es un fotorreceptor criptocromo activado por luz azul en Arabidopsis thaliana45. El criptocromo 2 se une a CIB1, una proteína básica de hélice-bucle-hélice, solo en su estado fotoexcitado45. Más tarde se descubrió que la región de homología de fotoliasa (PHR) N-terminal conservada del criptocromo 2 (CRY2PHR, en lo sucesivo denominado CRY2) y el dominio N-terminal (aa 1-170) de CIB1 (en adelante CIBN) son importantes para la dimerización inducida por la luz46. Opto-Rho1DN contiene dos componentes. El primer componente es la proteína CIBN fusionada con un anclaje CAAX, que localiza la proteína en la membrana plasmática47. El segundo componente es CRY2 marcado con mCherry fusionado con Rho1DN41. En ausencia de luz azul, CRY2-Rho1DN permanece en el citoplasma. Tras la estimulación con luz azul, CRY2-Rho1DN se dirige a la membrana plasmática a través de la interacción entre el CIBN anclado a la membrana y el CRY2 excitado. Opto-Rho1DN puede ser activado por luz ultravioleta A (UVA) y luz azul (400-500 nm, activación máxima a 450-488 nm), o por un láser pulsado de 830-980 nm cuando se realiza la estimulación de dos fotones41,46,47,48. Por lo tanto, Opto-Rho1DN es estimulado por las longitudes de onda normalmente utilizadas para excitar la GFP (488 nm para imágenes de fotón único y 920 nm para imágenes de dos fotones). Por el contrario, las longitudes de onda comúnmente utilizadas para excitar mCherry (561 nm para imágenes de fotón único y 1.040 nm para imágenes de dos fotones) no estimulan el módulo optogenético y, por lo tanto, se pueden usar para imágenes de preestimulación. El protocolo describe los enfoques utilizados para minimizar el riesgo de estimulación no deseada durante la manipulación de la muestra.
La ablación con láser se ha empleado ampliamente para detectar y medir la tensión en células y tejidos49. Estudios previos han demostrado que, cuando la intensidad del láser se controla adecuadamente, la ablación con láser de dos fotones que emplea un láser de infrarrojo cercano de femtosegundos puede dañar físicamente algunas estructuras subcelulares (por ejemplo, redes corticales de actomiosina) sin causar el éxtasis de la membrana plasmática50,51. Si el tejido está bajo tensión, la ablación con láser de una región de interés dentro del tejido da como resultado un retroceso inmediato hacia afuera de las células adyacentes a la región ablacionada. La velocidad de retroceso es una función de la magnitud de la tensión y la viscosidad del medio (citoplasma) que rodea las estructuras que sufren retroceso49. Debido a la profundidad de penetración superior de los láseres de infrarrojo cercano y la capacidad de lograr una ablación focal bien confinada, la ablación con láser de dos fotones es particularmente útil para detectar la tensión tisular in vivo. Como se demuestra en este protocolo, este método puede combinarse fácilmente con la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la contractilidad de la actomiosina para investigar el impacto directo de la contractilidad celular dependiente de Rho1 en la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm &#215; 15 mm Petri dish with lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black cloth for covering the microscope</td>
			<td>Online</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10028-048</td>
			<td>Used for embryo dechorination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>Used for cross set-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Style 5 tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-654</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22940-834</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView (Software)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td>Used for embryo stage visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ-745 stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30621-392</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)</td>
			<td>Bolioptics</td>
			<td>FM14036151</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic inhibition of rho1-mediated actomyosin contractility coupled with measurement of epithelial tension in drosophila embryos

Las fuerzas contráctiles generadas por la actina y la miosina II no muscular ("contractilidad de la actomiosina") son críticas para los cambios morfológicos de las células y los tejidos a múltiples escalas de longitud, como la división celular, la migración celular, el plegamiento epitelial y la morfogénesis ramificada. Una comprensión profunda del papel de la contractilidad de la actomiosina en la morfogénesis requiere enfoques que permitan la rápida inactivación de la actomiosina, lo cual es difícil de lograr utilizando enfoques genéticos o farmacológicos convencionales. El protocolo presentado demuestra el uso de un sistema de dimerización optogenética basado en CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inhibir la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con controles temporales y espaciales precisos. En este sistema, CRY2 se fusiona con la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), mientras que CIBN se ancla a la membrana plasmática. La dimerización mediada por luz azul de CRY2 y CIBN da lugar a una rápida translocación de Rho1DN desde el citoplasma a la membrana plasmática, donde inactiva la actomiosina mediante la inhibición endógena de Rho1. Además, este artículo presenta un protocolo detallado para acoplar la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la actomiosina con la ablación con láser para investigar el papel de la actomiosina en la generación de tensión epitelial durante la formación del surco ventral de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar a muchos otros procesos morfológicos que involucran la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con modificaciones mínimas. En general, esta herramienta optogenética es un enfoque poderoso para diseccionar la función de la contractilidad de la actomiosina en el control de la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

En los embriones no estimulados sometidos a constricción apical, Sqh-mCherry se enriqueció en la región medioapical de las células mesodérmicas ventrales, mientras que CRY2-Rho1DN-mCherry fue citosólico (Figura 1A). La ablación con láser dentro del dominio de constricción condujo a un rápido retroceso tisular a lo largo del eje A-P (Figura 1B, C). En los embriones estimulados, la señal CRY2-Rho1DN-mCherry se localizó en la membrana p...

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Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos (Video) | JoVE 

La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Nuestra investigación estudia la morfogénesis tisular, la formación de estructuras tisulares tridimensionales complejas en desarrollo. Estamos interesados en los genes y las moléculas que regulan la morfogénesis y buscamos comprender los principios físicos que subyacen a la morfogénesis. Por ejemplo, cómo se generan las fuerzas mecánicas y cómo impulsan la rehabilitación de tejidos.Las fuerzas contráctiles generadas por la actina filamentosa y la miosina II no muscular, también conocida como contractilidad de la actomiosina, es una de las fuerzas más importantes que impulsan la morfogénesis de los tejidos. Nuestra investigación actual aborda cómo la contractilidad de la actomiosina media el plegamiento de las láminas de células epiteliales de la sangre, un mecanismo de construcción de tejidos fundamental en el desarrollo. Una comprensión profunda del papel de la contractilidad de la actomiosina en el plegamiento epitelial y otros procesos morfogenéticos requiere enfoques que puedan inactivar rápidamente la actomiosina en el momento y lugar designados, y registre el impacto inmediato del comportamiento y las propiedades de los tejidos.Sin embargo, esto es difícil de lograr utilizando enfoques genéticos convencionales. El enfoque descrito en este protocolo está diseñado para abordar cómo las células y los tejidos responden a los cambios repentinos en las fuerzas mecánicas que normalmente impulsan la remodelación de los tejidos. Esta es una pregunta importante, pero ha sido difícil de abordar debido a los enfoques limitados que pueden alterar rápidamente las fuerzas mecánicas en los tejidos intactos.En este estudio, desarrollamos una herramienta optogenética para inactivar rápidamente la actomiosina en regiones específicas del tejido en embriones de Drosophila. Encontramos que la combinación de estos dos con la ablación con láser para investigar el impacto directo de la contractilidad de la actomiosina en la mecánica tisular en el plegamiento epitelial. Nuestros hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre el mecanismo mecánico de la constricción apical media al plegamiento epitelial.Con modificaciones manuales, el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar la función de la contractilidad de la actomiosina en una amplia gama de procesos morfogenéticos.