Name: Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-23T12:55:00
Duration: 1 min 58 s
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Ringraziamo i membri dei laboratori Sumigray e Ameen per le loro ponderate discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per la salute del bambino della Charles H. Hood Foundation e da una sovvenzione della Cystic Fibrosis Foundation (004741P222) a KS e dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases del National Institutes of Health a NA con il numero di premio 2R01DK077065-12.

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

Lo sviluppo di un modello di organoide intestinale di ratto preserva importanti caratteristiche funzionali presenti nell'organo in vivo ed è uno strumento promettente per i test preclinici, lo screening farmacologico e i saggi funzionali. Questo modello in vitro può essere utilizzato in parallelo agli studi di gastroenterologia preclinica in vivo, per i quali i ratti sono spesso un modello preferito a causa delle loro dimensioni intestinali più grandi, degli aspetti fisiologici condivisi con l'uomo e, in alcuni casi, del fatto che sono modelli di malattia migliori38. Qui, viene delineato un robusto protocollo passo-passo per l'isolamento delle cripte intestinali di ratto, la generazione e la coltura a lungo termine di organoidi intestinali di ratto, nonché applicazioni a valle tra cui saggi di rigonfiamento funzionale della forskolina, immunofluorescenza a montaggio intero, coltura monostrato 2D e manipolazione genetica lentivirale. È probabile che gli organoidi intestinali di ratto siano rilevanti in molti contesti patologici in cui la fisiopatologia dei modelli murini è inappropriata e possono fornire un modello migliore per la fisiologia intestinale umana rispetto agli organoidi intestinali di topo.
Per stabilire colture di organoidi di lunga durata che possano essere passate ed espanse, è essenziale identificare i fattori di crescita chiave necessari per mantenere la proliferazione epiteliale intestinale. Gli organoidi di topo sono spesso coltivati in un semplice cocktail di EGF, R-spondina e Noggin, anche se è stato riportato che Noggin non è necessario per la coltura di organoidi intestinali39. I terreni condizionati possono sostituire i fattori di crescita ricombinanti e le linee cellulari più comunemente utilizzate sono L-WRN, che secerne cellule Wnt3a, Rspondina-3 e Noggin39, L-Wnt3a e HA-Rspondina1-Fc 293T40. I terreni condizionati L-WRN sono sufficienti a supportare non solo la crescita degli organoidi intestinali dei topi39 , ma anche la crescita degli organoidi intestinali di diversi animali da allevamento e da compagnia, tra cui cani, gatti, polli, cavalli, mucche, pecore e maiali12. Tuttavia, gli organoidi intestinali umani sono molto diversi nei loro requisiti di fattore di crescita, in quanto richiedono formulazioni di terreni distinti per la loro fase di crescita di espansione (cioè la progressione da sferoidi piccoli a grandi) rispetto alla loro fase di differenziazione (cioè la generazione e la maturazione di tipi cellulari differenziati)10. I requisiti dei terreni degli organoidi intestinali di ratto rispecchiano da vicino quelli dei mezzi di crescita di espansione per gli organoidi intestinali umani, tuttavia, in particolare, gli organoidi di ratto sono in grado sia di crescere che di differenziarsi in questo ambiente di terreno, semplificando notevolmente i loro requisiti di coltura. Mentre i nostri tentativi iniziali si sono concentrati sulla creazione e la crescita di organoidi intestinali di ratto in terreni condizionati da L-WRN, la coltura a lungo termine era tenue e le linee di organoidi intestinali di ratto soffrivano di una mancanza di robustezza (dati non mostrati). Ciò può essere dovuto al fatto che le linee cellulari L-WRN sono progettate per secernere R-spondina 3, mentre la linea cellulare 293T-Rspo1 qui raccomandata è progettata per secernere R-spondina 1. È possibile che gli organoidi di ratto e umani preferiscano la R-spondina 1, spiegando potenzialmente il fallimento delle linee di organoidi di ratto in terreni condizionati con L-WRN.
Per ricapitolare più da vicino l'ambiente in vivo, è importante sviluppare condizioni di coltura di organoidi che consentano la sopravvivenza, il mantenimento e la proliferazione delle cellule staminali e che possano mantenere il turnover cellulare e gli eventi di differenziazione simultanei in tipi di cellule discrete. Pertanto, le concentrazioni di proteine ricombinanti e/o proteine in terreni condizionati devono essere strettamente titolate e controllate per raggiungere questo perfetto equilibrio. In particolare, livelli ottimali di Wnt sono essenziali per evitare la perdita di colture di organoidi intestinali. Troppo poco Wnt nei terreni condizionati non sarà in grado di sostenere la crescita, portando a una perdita di cellule staminali e alla successiva morte degli organoidi; l'iperattivazione di Wnt farà sì che gli organoidi siano cistici e indifferenziati10. Anche se non è descritto in questa sede, si consiglia vivamente di testare ogni lotto di terreni condizionati con L-Wnt3a e 293T-Rspo1 utilizzando un saggio di luciferasi reporter Wnt, come una linea cellulare Topflash41. Studi precedenti hanno descritto che un lotto ottimale di terreni L-Wnt3a dovrebbe comportare un aumento del segnale di 15 volte al 12,5% e un aumento del segnale di 300 volte al 50%, rispetto all'1% di L-Wnt3a10. Poiché gli organoidi di ratto sono più sensibili degli organoidi di topo ai requisiti di coltura, in particolare ai livelli di attivazione Wnt, queste ulteriori fasi di controllo della qualità aiutano notevolmente a facilitare la robustezza e l'affidabilità delle colture di organoidi di ratto. Poiché non è disponibile una linea reporter simile per testare l'attività di Bmp e le relative concentrazioni di Noggin in terreni condizionati da Noggin, è consigliabile utilizzare Noggin ricombinante quando possibile per controllare con precisione i livelli di Noggin. Mentre gli organoidi intestinali di topo possono essere coltivati e mantenuti in assenza di Noggin39, questo non è stato tentato per le colture di organoidi intestinali di ratto.
Al di là dei requisiti di coltura cellulare, il successo della creazione iniziale di una linea di organoidi di ratto dipende in modo critico dall'efficiente esaurimento dei villi differenziati durante l'isolamento della cripta. Alti livelli di contaminazione villar causano la morte della cripta, presumibilmente a causa di segnali provenienti dalle cellule morenti o del sequestro di fattori essenziali. Per esaurire questi villi differenziati dai preparati epiteliali in modo preciso e coerente, si consiglia di eseguire isolamenti epiteliali con l'ausilio di uno stereoscopio. L'esame visivo dell'epitelio che viene rilasciato fornisce un chiaro segnale quando scartare il PBS e sostituirlo (Figura 1). Le cripte non dovrebbero essere raccolte fino a quando non c'è un sufficiente esaurimento dei villi. Le cellule di Villar sono terminalmente differenziate e non possono generare organoidi in coltura. Inoltre, il successivo passaggio di organoidi intestinali di ratto e il loro utilizzo per qualsiasi applicazione a valle richiede una cura delicata. L'incubazione nei reagenti di dissociazione per periodi di tempo più lunghi (10 min) provoca una significativa morte cellulare e la perdita della linea di organoidi.
Qui viene descritto un protocollo semplice e veloce per la generazione di monostrati intestinali da organoidi di ratto. I substrati dell'EME e del collagene I hanno effetti diversi sull'epitelio, che possono essere sfruttati a seconda dello scopo dello studio. EME consente l'adesione rapida ed efficiente di singole cellule e la formazione di proiezioni cellulari. Al contrario, rivestire la superficie con collagene I ritarda questi processi. Una volta che i monostrati raggiungono circa l'80% di confluenza, le cellule cresciute su EME ricominciano a generare strutture organoidi 3D. Tuttavia, mancano di un supporto fisico e chimico sufficiente per una crescita continua. Questo ritorno allo stato di organoide può essere evitato mantenendo i monostrati in EME ad una confluenza del 50%-80%. L'aggiunta di EME diluito alla superficie apicale dei monostrati favorisce il rapido recupero e la formazione di organoidi de novo, generando regioni di convergenza più rapidamente e prontamente. Su una superficie di collagene I, le cellule possono formare un monostrato uniforme e generare piccoli cluster. Tuttavia, l'aggiunta di collagene I sopra i monostrati non è sufficiente per indurre la formazione di organoidi. L'EME deve essere diluito quando si aggiunge alla superficie del monostrato, poiché ci sarà una maggiore resistenza meccanica per l'organoide nascente da superare. Tuttavia, questo EME diluito non consente la formazione robusta di organoidi di grandi dimensioni. Eventuali organoidi di ratto generati de novo che si staccano naturalmente dalla superficie devono essere immediatamente rimossi e trasferiti in EME non diluiti in modo che il supporto strutturale e la crescita possano essere ripristinati. A causa delle piccole dimensioni degli organoidi in questa fase, il passaggio degli organoidi non è raccomandato fino a quando non si è stabilita una crescita robusta. Il significato biologico sottostante del motivo per cui l'EME può supportare la riformazione degli organoidi, ma non è chiaro se il collagene I possa o non possa farlo. Tuttavia, è stato segnalato che le cellule cresciute nel collagene 3D non possono formare organoidi in gemma42,43 o supportare il mantenimento a lungo termine. I prodotti EME disponibili in commercio sono miscele eterogenee di proteine extracellulari, principalmente laminina e collagene IV44. Pertanto, la composizione distinta delle proteine e la capacità di una cellula epiteliale di interagire con la matrice extracellulare utilizzando diversi complessi cellulari potrebbero consentire il rimodellamento nell'EME ma non nel collagene I. Non è stato testato se i monostrati derivati dal collagene I possano essere inseriti in EME per supportare la formazione e la crescita degli organoidi.
La manipolazione genetica del modello di organoide intestinale di ratto è descritta qui, e sono delineati i protocolli per la trasduzione lentivirale di organoidi 3D e la trasfezione transitoria di monostrati 2D. Per ovviare alla bassa efficienza della trasduzione lentivirale di organoidi, è stato sviluppato un protocollo per la trasfezione transitoria di monostrati 2D. La morfologia piatta e i domini apicali esposti dei monostrati forniscono un accesso più facile ai virus e ai complessi contenenti DNA. Per la validazione di questa tecnica è stata utilizzata l'espressione di un reporter EGFP utilizzando il vettore pLJM1-EGFP. L'espressione reporter della GFP è stata osservata dopo 24 ore ed è stata mantenuta per 5-6 giorni in monostrati. È probabile che gli studi futuri incentrati sulla trasduzione lentivirale dei monostrati abbiano un'efficienza maggiore rispetto alla trasduzione di organoidi 3D. Utilizzando i protocolli di cui sopra, gli organoidi 3D possono essere riformati da monostrati 2D infetti per facilitare la creazione di linee stabili. Con cura, le linee di organoidi intestinali di ratto possono essere mantenute con successo per oltre un anno, rimanendo stabili in molti passaggi, crioconservate, scongelate con successo e geneticamente modificate utilizzando la trasduzione lentivirale, rispondendo così alla necessità di un modello di organoide intestinale in vitro accessibile e trattabile che mantenga la rilevanza fisiologica per l'uomo.

L'architettura epiteliale dell'intestino tenue umano e la composizione cellulare sono complesse e riflettono le loro funzioni fisiologiche. Il ruolo principale dell'intestino tenue è quello di assorbire i nutrienti dal cibo che passano attraverso il suo lume1. Per massimizzare questa funzione, la superficie intestinale è organizzata in sporgenze simili a dita chiamate villi, che aumentano la superficie assorbente, e invaginazioni a forma di coppa chiamate cripte, che ospitano e isolano le cellule staminali. All'interno dell'epitelio vengono generati vari tipi di cellule assorbenti e secretorie specializzate per svolgere funzioni distinte1. A causa di questa complessità, è stato difficile modellare tessuti come l'intestino in linee cellulari immortalizzate ad alto passaggio trasformato. Tuttavia, lo studio delle cellule staminali, in particolare delle cellule staminali adulte e dei loro meccanismi di differenziamento, ha permesso lo sviluppo di colture di organoidi intestinali 3D. L'uso di modelli di organoidi ha trasformato il campo, in parte a causa della loro ricapitolazione di alcune componenti architettoniche e dell'eterogeneità del tipo di cellula che si trova nell'intestino intatto. Gli organoidi intestinali possono essere coltivati a lungo termine in vitro grazie al mantenimento della popolazione attiva di cellule staminali2.
Gli organoidi intestinali sono diventati rapidamente un modello adattabile per studiare la biologia delle cellule staminali, la fisiologia cellulare, le malattie genetiche e la nutrizione3,4, nonché uno strumento per sviluppare nuovi metodi di somministrazione di farmaci5. Inoltre, gli organoidi derivati dai pazienti vengono utilizzati per la modellazione di malattie, la scoperta di farmaci e lo screening di trattamenti personalizzati, tra gli altri 6,7,8,9. Tuttavia, gli organoidi intestinali umani presentano ancora delle sfide. La disponibilità dei tessuti, i requisiti per l'approvazione dell'Institutional Review Board e le questioni etiche limitano l'uso diffuso di campioni umani. Inoltre, gli organoidi intestinali umani generati da cripte intestinali richiedono due distinte condizioni di coltura per il mantenimento di cellule staminali indifferenziate o per indurre la differenziazione di tipi di cellule mature10. Ciò contrasta con quello in vivo, in cui le cellule staminali e i tipi di cellule differenziate mature sono contemporaneamente presenti e generati/mantenuti continuamente1. D'altra parte, gli organoidi intestinali di topo, che sono cresciuti in un cocktail meno complesso di fattori di crescita, non richiedono questo cambiamento nella composizione del terreno e possono mantenere le cellule staminali e le cellule differenziate nello stesso contesto del terreno 2,11. Tuttavia, le differenze chiave nell'intestino di topo rispetto agli esseri umani possono rendere gli organoidi di topo un modello non ottimale in molti casi. Nel complesso, molti organoidi intestinali di mammiferi più grandi, tra cui cavalli, maiali, pecore, mucche, cani e gatti, sono stati generati con successo in condizioni di coltura più strettamente allineate con gli organoidi intestinali di topo rispetto alle condizioni di coltura degli organoidi intestinali umani12. Le differenze nelle condizioni del fattore di crescita tra gli organoidi di topo e umani probabilmente riflettono differenze nella composizione della nicchia delle cellule staminali e diversi requisiti per la sopravvivenza, la proliferazione e il mantenimento delle cellule staminali. Pertanto, c'è bisogno di un sistema di organoidi modello facilmente accessibile che 1) assomigli molto alla composizione delle cellule intestinali umane, 2) contenga cellule staminali con requisiti di fattore di crescita come quelli degli organoidi intestinali umani e 3) sia in grado di mantenere continuamente compartimenti indifferenziati e differenziati. Idealmente, il sistema dovrebbe provenire da un modello animale preclinico comunemente usato, in modo tale che gli esperimenti in vivo e in vitro possano essere correlati e utilizzati in tandem.
I ratti sono un modello preclinico comunemente usato per gli studi di fisiologia e farmacologia intestinale a causa della loro fisiologia e biochimica intestinale molto simili a quelle dell'uomo13, in particolare per quanto riguarda la permeabilità intestinale14. Le loro dimensioni relativamente maggiori rispetto ai topi li rendono più suscettibili alle procedure chirurgiche. Mentre a volte vengono utilizzati modelli animali di grandi dimensioni, compresi i maiali, i ratti sono un modello più economico, richiedono meno spazio per l'allevamento e hanno ceppi standard prontamente disponibili in commercio15. Uno svantaggio dell'utilizzo di modelli di ratto è che il kit di strumenti genetici per gli studi in vivo non è ben sviluppato rispetto ai topi e la generazione di nuove linee di ratti, tra cui knockout, knock-in e transgenici, è spesso proibitiva dal punto di vista dei costi. Lo sviluppo e l'ottimizzazione di un robusto modello di organoide intestinale di ratto consentirebbe la manipolazione genetica, i trattamenti farmacologici e gli studi a più alto rendimento in un modello accessibile che mantiene una rilevanza fisiologica chiave per gli esseri umani. Tuttavia, i vantaggi di un modello di organoide di roditore rispetto a un altro dipendono fortemente dal particolare processo o gene studiato; Alcuni geni trovati nell'uomo possono essere pseudogeni nei topi, ma non nei ratti16,17. Inoltre, i sottotipi di cellule specie-specifiche vengono sempre più svelati dall'RNAseq18,19,20 a singola cellula. Infine, i modelli di malattie intestinali di ratto e topo mostrano spesso variazioni considerevoli nei fenotipi21,22 in modo tale che il modello che ricapitola più fedelmente i sintomi e il processo patologico osservato nell'uomo deve essere selezionato per il lavoro a valle. La generazione di un modello di organoide intestinale di ratto offre ulteriore flessibilità e scelta ai ricercatori nella selezione di un sistema modello più appropriato per le loro circostanze. Qui, i protocolli esistenti23,24 sono ampliati per la generazione di organoidi intestinali di ratto e viene delineato un protocollo per la generazione e il mantenimento di organoidi intestinali di ratto dal duodeno o digiuno. Inoltre, vengono descritte diverse applicazioni a valle, tra cui l'infezione lentivirale, la colorazione a monte intero e i saggi di rigonfiamento della forskolina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-D Culture Matrix Rat Collagen I</td>
			<td>Cultrex/R&#38;D Systems</td>
			<td>3447-020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Molecular Probes/Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>100-0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB06021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Beantown Chemical</td>
			<td>144255-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt3a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLJM1-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine hydrochloride (PEI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>764965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine&#160;</td>
			<td>Acros Organics/Thermo Fisher</td>
			<td>417481000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J593-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF2 protein</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-250ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IGF-1 protein</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>B356441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin protein</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>6057-NG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse EGF protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PMG8041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rat</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and manipulation of rat intestinal organoids

Quando si utilizzano organoidi per valutare la fisiologia e le decisioni sul destino cellulare, è importante utilizzare un modello che ricapitoli fedelmente i contesti in vivo . Di conseguenza, gli organoidi derivati dai pazienti vengono utilizzati per la modellazione delle malattie, la scoperta di farmaci e lo screening del trattamento personalizzato. Gli organoidi intestinali di topo sono comunemente utilizzati per comprendere aspetti sia della funzione/fisiologia intestinale che delle dinamiche/decisioni di destino delle cellule staminali. Tuttavia, in molti contesti patologici, i ratti sono spesso preferiti ai topi come modello a causa della loro maggiore somiglianza fisiologica con gli esseri umani in termini di fisiopatologia della malattia. Il modello di ratto è stato limitato dalla mancanza di strumenti genetici disponibili in vivo e gli organoidi intestinali di ratto si sono dimostrati fragili e difficili da coltivare a lungo termine. Qui, ci basiamo su protocolli pubblicati in precedenza per generare in modo robusto organoidi intestinali di ratto dal duodeno e dal digiuno. Forniamo una panoramica di diverse applicazioni a valle che utilizzano organoidi intestinali di ratto, tra cui saggi di gonfiore funzionale, colorazione a montaggio intero, generazione di monostrati enteroidi 2D e trasduzione lentivirale. Il modello di organoide di ratto fornisce una soluzione pratica alla necessità del settore di un modello in vitro che mantenga la rilevanza fisiologica per gli esseri umani, possa essere rapidamente manipolato geneticamente e sia facilmente ottenuto senza le barriere coinvolte nell'approvvigionamento di organoidi intestinali umani.

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

Gli organoidi duodenali e digiunali di ratto sono stati generati utilizzando il protocollo descritto nella sezione 2. È molto importante durante le fasi di isolamento della cripta che i villi siano esauriti in modo efficiente dal PBS. Se troppi villi sono placcati nell'EME con cripte, può causare la morte dell'intera coltura e l'incapacità di stabilire una linea di organoidi. Per questo motivo, è utile isolare le cripte sotto un cannocchiale di dissezione, consentendo la conferma visiva dell'esaurimento del villar. La figura 1 illustra frammenti e cripte rappresentativi di villar (figura 1A). Si noti la dimensione significativamente più piccola delle cripte rispetto ai villi (Figura 1B). Dopo la placcatura, le cripte si espanderanno in sferoidi nei giorni successivi e inizieranno a germogliare e differenziarsi entro il 4-7° giorno (Figura 2). Una volta che gli organoidi raggiungono uno stadio estensivamente germogliato, dovrebbero essere passati. Durante il passaggio, è importante distruggere gli organoidi abbastanza da dividere le gemme della cripta, in modo che il numero di organoidi possa essere espanso (Figura 3B).
Il successo del recupero degli organoidi dopo il congelamento dipende in larga misura dallo stato in cui vengono congelati. Gli organoidi in uno stato indifferenziato altamente proliferativo si riprendono con la massima efficienza. Pertanto, si consiglia di indurli ad essere sferici e cistici invece che gemmati e differenziati. Per raggiungere questo obiettivo, Wnt può essere iperattivato aumentando la quantità del ligando Wnt R-spondina nel terreno e includendo nicotinamide nel terreno, che ha dimostrato di supportare la formazione di organoidi e la sopravvivenza cellulare in diversi sistemi di coltura30,31. La Figura 3A mostra una coltura di organoidi sana appena 2 giorni dopo lo scongelamento. L'inclusione della BSA nei terreni durante lo scongelamento ha anche contribuito alla sopravvivenza delle colture di organoidi intestinali di ratto, che si sono dimostrate più delicate degli organoidi intestinali di topo.
Mentre la coltura di organoidi 3D è spesso preferita perché ricapitola parte della normale architettura intestinale, rende altri approcci, tra cui l'imaging dal vivo, le trasfezioni e le trasduzioni lentivirali, più impegnativi dal punto di vista tecnico. L'uso di monostrati 2D generati da organoidi 3D32 (Figura 4) consente una maggiore efficienza nell'introduzione dei plasmidi. Mentre gli organoidi intestinali 3D sono tradizionalmente resistenti alle trasfezioni transitorie, i plasmidi che codificano per EGFP possono essere introdotti con successo utilizzando metodi di trasfezione a base lipidica. L'approccio più efficace in termini di costi che utilizza il PEI è descritto nella fase 6.1 (Figura 5), ma anche l'elettroporazione e i reagenti di trasfezione disponibili in commercio hanno prodotto risultati comparabili (dati non mostrati). Gli studi futuri si concentreranno sulla possibilità di utilizzare questi approcci per introdurre costrutti CRISPR nei monostrati.
Era importante essere in grado di riformare gli organoidi 3D da monostrati 2D dopo la trasfezione in modo che potessero essere mantenuti come una linea di passaggio con componenti architettonici 3D delle cripte. È interessante notare che i monostrati 2D placcati sull'EME si sono prontamente riformati in piccoli sferoidi quando l'EME è stato aggiunto di nuovo alla parte superiore delle cellule, mentre un substrato di collagene I non era sufficiente per la riformazione delle strutture 3D (Figura 6).
Mentre le trasfezioni transitorie sono utili per molti studi, la formazione di linee stabili è spesso più utile, richiedendo l'introduzione di lentivirus nelle cellule. Gli organoidi intestinali di ratto sono stati infettati con lentivirus modificando i protocolli precedentemente pubblicati (Figura 7). Un passaggio chiave del protocollo è la disgregazione degli organoidi in piccoli aggregati o cluster di cellule. Se le colture non vengono interrotte in modo efficiente e gli organoidi rimangono intatti, le particelle lentivirali non entreranno nelle cellule. Dopo l'infezione, gli organoidi devono riprendersi e ricrescere. Il protocollo qui delineato consente l'assorbimento delle particelle virali dal 10% al 48% (media: 19,4% ± 6,5%) delle cellule prima della selezione.
La colorazione dell'intero supporto degli organoidi può rivelarsi difficile a causa della rimozione incompleta dei residui EME o della penetranza incompleta degli anticorpi. Il protocollo qui delineato consente la colorazione robusta degli organoidi. Anche la visualizzazione degli organoidi su un microscopio confocale può rivelarsi difficile se sono troppo lontani dal vetrino coprioggetto. Utilizzando VALAP, si crea un pozzetto con una certa altezza in modo tale che gli organoidi non vengano schiacciati dal vetrino coprioggetto, ma si lasci comunque depositare vicino al vetrino coprioggetti per facilitare l'imaging. La colorazione rappresentativa contro il canale anionico apicale, il regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) e la falloidina per marcare la F-actina è mostrata nella Figura 8.
Infine, gli organoidi hanno utilità nei saggi funzionali. Gli organoidi derivati da pazienti affetti da fibrosi cistica sono stati utilizzati per lo screening della funzione CFTR, poiché il trattamento con l'agonista del cAMP forskolina induce una robusta secrezione fluida mediata da CFTR, causando gonfiore degli organoidi 29,33-37. Uno degli obiettivi di questo lavoro è stato quello di identificare e sviluppare un modello di organoide che possa essere utilizzato in parallelo agli studi preclinici in vivo. Pertanto, abbiamo mirato a determinare se gli organoidi intestinali di ratto subiscono un gonfiore indotto dalla forskolina. Infatti, entro 30 minuti dal trattamento con forskolina, gli organoidi di ratto si sono gonfiati, con un effetto massimo osservato entro 120 minuti (Figura 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg"> Figura 1: Frammenti e cripte di Villar durante l'isolamento epiteliale. (A) Immagine rappresentativa dei frammenti di Villar in soluzione di EDTA durante il protocollo di isolamento della cripta. Le punte di freccia gialle segnano i frammenti di villar. Le frecce rosse raffigurano cripte attaccate a un frammento di villar. Si noti la differenza nelle dimensioni relative. (B) Immagine a maggiore ingrandimento di una singola cripta (freccia rossa) in modo che la morfologia possa essere visualizzata. Barre della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg"> Figura 2: Progressione degli organoidi intestinali di ratto. Le cripte di digiuno di ratto sono state placcate in EME subito dopo l'isolamento (A,B). Nel giro di 2 giorni, le cripte divennero sferoidi (C,D). Entro il giorno 5, hanno iniziato a dare inizio alle gemme della cripta (E,F), che si sono elaborate e cresciute entro il giorno 7 (G). Barre della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg"> Figura 3: Organoidi dopo lo scongelamento e il passaggio. (A) Gli organoidi digiunali di ratto sono stati scongelati seguendo i protocolli delineati dopo la crioconservazione. Si noti la presenza sia di sferoidi che di organoidi gemmati appena 2 giorni dopo lo scongelamento. (B) La stessa linea di organoidi raffigurata in A subito dopo il passaggio seguendo il protocollo delineato. Si noti la differenza di dimensioni relative tra le strutture in A e B e la presenza di singoli domini simili a cripte in B. Barre della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg"> Figura 4: Formazione di monostrati 2D da organoidi 3D. (A-C) Progressione monostrato 2D su EME. (D-F) Progressione monostrato 2D su collagene I. Entro il giorno 5, ogni condizione ha prodotto ~80% di confluenza. Barre della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg"> Figura 5: Trasfezione transitoria di un monostrato 2D. Immagine rappresentativa di un monostrato 2D cresciuto su EME trasfettato transitoriamente con plasmide pLJM1-EGFP utilizzando PEI. (A) campo chiaro, (B) fluorescenza (GFP), (C) sovrapposizione. La linea rossa tratteggiata segna il contorno del monostrato. Barre della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg"> Figura 6: Riformazione di organoidi 3D da monostrati 2D su EME. (A) Formazione di organoidi 3D da monostrati 2D cresciuti su EME. Organoidi formati in modo efficiente entro 5 giorni dall'aggiunta di EME alla superficie apicale del monostrato. Notate l'abbondanza di cellule morte che circondano i piccoli sferoidi 3D. (B) Persistenza dei monostrati 2D 5 giorni dopo l'aggiunta di collagene I alla superficie apicale dei monostrati 2D cresciuti su collagene I. Barre della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg"> Figura 7: Infezione lentivirale di organoidi 3D. Gli organoidi di digiuno di ratto sono stati infettati con particelle lentivirali GFP nucleari utilizzando il protocollo delineato. Dopo il recupero e la crescita per 5 giorni, gli organoidi sono stati fissati e controcolorati con DAPI. (A) DAPI: grigio; nucleareGFP: verde. (B) nucleareGFP: verde. La linea rossa tratteggiata segna il confine dell'organoide. Barre graduate: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg"> Figura 8: Immunofluorescenza a montaggio intero di organoidi intestinali di ratto. (A) CFTR, (B) falloidina e (C) immunofluorescenza a montaggio intero di organoidi digiunali di ratto. Si noti l'arricchimento apicale della colorazione CFTR negli organoidi (grigio in A, magenta in C). La falloidina marca la F-actina ed etichetta in modo prominente il bordo apicale della spazzola (grigio in B, ciano in C). Barre della scala: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg"> Figura 9: Gli organoidi intestinali di ratto si gonfiano dopo la stimolazione con forskolina. Decorso temporale rappresentativo del gonfiore degli organoidi intestinali di ratto dopo l'aggiunta dell'agonista cAMP forskolina. Il tempo 0 min rappresenta il punto di tempo immediatamente precedente l'aggiunta di 10 μM di forskolina. Le immagini mostrano lo stesso organoide a intervalli di tempo di 30 minuti. Il gonfiore massimo è stato osservato a 120 minuti dopo l'aggiunta di forskolina. La linea rossa tratteggiata delinea il confine dell'organoide. Il materiale scuro al centro del lume organoide è composto da cellule morte. Barre della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Ricetta AdDMEM+. Ingredienti per creare il supporto AdDMEM+ standard, che è il supporto di base in tutti i metodi mostrati qui. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Ricetta dei terreni organoidi intestinali di ratto (rIOM). Ricetta dettagliata dei terreni organoidi intestinali standard di ratto, comprese le condizioni di solvente e conservazione per le proteine ricombinanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Soluzioni. Ricette e istruzioni per realizzare altre soluzioni utilizzate in tutto il protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 4. Terreno organoide intestinale di ratto per coltura monostrato 2D (rIOM2D). Ricetta modificata di terreni di coltura organoidi ottimizzati per la crescita 2D di monostrati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

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Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids (Video) | JoVE 

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali di ratto e utilizzarli in diverse applicazioni a valle. I ratti sono spesso un modello preclinico preferito e il robusto sistema di organoidi intestinali soddisfa la necessità di un sistema in vitro per accompagnare gli studi in vivo .

Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

When using organoids to assess physiology and cell fate decisions, it is important to use a model that closely recapitulates in vivo contexts. ...

In questo studio abbiamo stabilito un modello di organoide intestinale di ratto che è robusto nella coltura cellulare a lungo termine. Dimostriamo anche le prime manipolazioni genetiche di successo utilizzando sia l'infezione lentivirale che la trasfezione transitoria. Questo modello è uno strumento eccellente per manipolare la biologia intestinale nel ratto, dove gli strumenti genetici disponibili in vivo sono limitati.Gli organoidi intestinali di ratto sono stati precedentemente difficili da coltivare a lungo termine. Generando un modello di organoide di ratto robusto e geneticamente manipolabile, stiamo fornendo ai ricercatori ulteriore flessibilità e scelta per selezionare un modello di organoide più adatto alle loro particolari circostanze. Gli organoidi intestinali di topo sono utilizzati per studiare il comportamento, il destino e la fisiologia delle cellule staminali, ma possono essere un modello non ottimale.Poiché ci sono differenze fondamentali tra la biologia del topo e quella umana. D'altra parte, gli organoidi intestinali umani possono essere difficili da ottenere e hanno requisiti di coltura cellulare complessi. Il modello di organoide di ratto che descriviamo qui mantiene una rilevanza fisiologica chiave per la biologia umana, pur essendo notevolmente più facile da accedere e curare rispetto agli organoidi intestinali umani.Lo sviluppo e l'ottimizzazione del modello di organoide intestinale di ratto consente la manipolazione genetica, i trattamenti farmacologici e gli studi di biologia intestinale e il modello accessibile con rilevanza fisiologica chiave per gli esseri umani. Inoltre, questi organoidi di ratto consentiranno lo studio della fisiologia specie-specifica, dei destini cellulari, delle variazioni fenotipiche e dei modelli di malattia nell'intestino.