Name: normothermic ex vivo liver machine perfusion in mouse
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00
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在撰写本文的整个过程中，我得到了大量的支持和帮助。我特别要感谢我的队友陈新培，感谢他在我手术过程中的出色合作和耐心支持。

动物实验是根据现行的德国动物福利法规和指南以及ARRIVE动物研究报告指南进行的。动物实验方案由德国图林根州Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz批准（批准号：UKJ - 17 - 106）。
注意：将体重34±4g（平均值[SEM]的平均±标准误差）的雄性C57BL / 6J小鼠用作肝脏供体。它们在受控的环境条件下（50%湿度和18 - 23°C）下保持，并自由获取标准小鼠食物和水。在整个手术过程中，呼吸?...

协议中的关键步骤 肝植的两个关键步骤是门静脉插管（PV）和随后的胆管插管（BD）。这些步骤对于确保成功的器官取回和随后的灌注或移植程序至关重要。
挑战和解决方案 PV插管存在三个挑战：血管壁的损伤，导管的移位和插入过程的实用性。PV血管壁的脆弱性质使其在插管过程中不小心处理，容易被刺穿和随后的出血。此外，PV的任何失血都?...

肝移植是终末期肝病患者的金标准治疗。令人遗憾的是，对捐献器官的需求超过了现有供应，导致严重短缺。2021 年，约有 24,936 名患者在等待肝移植的名单上，而只有 9,234 例移植成功进行1。肝移植物供需之间的巨大差异凸显了研究替代策略以扩大供体库和提高肝移植物可及性的迫切需要。扩大捐助者库的一种方法是使用边际捐助者2.边缘捐赠者包括高龄、中度或重度脂肪变性的人。尽管边缘器官移植可能会产生有利的结果，但总体结果仍然不理想。因此，目前正在制定旨在增强边际捐赠者功能的治疗策略3,4。
其中一种策略是利用机器灌注，特别是常温氧合机灌注，来改善这些边缘器官的功能5。然而，对常温氧合机灌注（NEVLP）有益作用的分子机制仍然了解有限。小鼠具有丰富的转基因菌株，是研究分子途径的宝贵模型。例如，自噬途径在减轻肝缺血再灌注损伤中的重要性已得到越来越多的认可6,7。肝缺血再灌注损伤中一条重要的分子途径是 miR-20b-5p/ATG7 途径8。目前，有许多ATG敲除和条件敲除小鼠品系可用，但没有相应的大鼠品系9。
基于这一背景，目的是为小鼠肝脏移植物生成小型化的NEVLP平台。该平台将有助于探索和评估旨在改善供体肝脏功能的潜在转基因策略。此外，该系统必须适合长期灌注，使肝脏能够 离体 治疗，通常称为“器官修复”。
考虑到小鼠肝脏灌注的相关 体外 数据有限，文献综述侧重于在大鼠中进行的研究。使用“正常体温肝灌注”、“体外 或 体外”和“大鼠”等关键词对 2010 年至 2022 年的文献进行了系统检索。该搜索旨在确定啮齿动物的最佳条件，使我们能够确定最合适的方法。
灌注系统由密封的水套玻璃缓冲储液罐、蠕动辊泵、氧合器、气泡阱、热交换器、风琴室和封闭循环管系统组成（图 1）。该系统确保使用专用的恒温机器精确保持 37 °C 的恒定灌注温度。蠕动辊泵驱动灌注液在整个回路中的流动。灌注回路在绝缘水套储液罐处启动。随后，灌注液被引导通过氧合器，氧合器从专用气瓶中接收95%氧气和5%二氧化碳的气体混合物。充氧后，灌注液通过气泡阱，其中任何被困住的气泡都通过蠕动泵重定向回储液器。剩余的灌注液流经热交换器并进入器官室，从那里返回储液器。
在这里，我们报告了我们为小鼠肝脏建立NEVLP的经验，并分享了使用不含氧载体的含氧培养基进行的试点实验的有希望的结果。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 ml Micro Tube PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Fr Rubber Cannula</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>Sample Cannula</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Micro Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Fr Rubber Cannula</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>Sample Cannula</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G Butterfly Cannula</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR+OF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G Butterfly Cannula</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR+DU2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needle</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>100246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Syringe Pump</td>
			<td>Braun</td>
			<td>110356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Perma-Hand Seide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>639H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arterial Clip</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BH014R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Moist Chamber</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big Cotton Applicator&#160;</td>
			<td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td>
			<td>974018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Hugo-Sachs-Elektronik</td>
			<td>V83163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenovet (0.3 mg / ml)</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIDEX OPA solution (2 L)</td>
			<td>Cilag GmbH</td>
			<td>20391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO&#174; 50 C</td>
			<td>ERBE</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(500 ml)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Mixture (95 % oxygen &#38; 5 % carbon dioxide)</td>
			<td>House Supply</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Circulating Baths</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>75-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000 (I.E. /5 ml)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1708.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>15427276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin(100 IE / ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran (250 ml)</td>
			<td>Cp-Pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Oxygenator</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>T18728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Retractor Set&#160;</td>
			<td>Carfil Quality</td>
			<td>180000056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges&#160;</td>
			<td>Kompressen</td>
			<td>866110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)&#160;</td>
			<td>C.C.Pro</td>
			<td>Z-13-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Extension Tube (30 cm)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4256000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>P-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishc 100x15 mm</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>391-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td>
			<td>Livisto</td>
			<td>799-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducer Simulator</td>
			<td>UTAH Medical Products</td>
			<td>650-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Blood Pressure Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT-0380/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S &#38; T Vessel Cannulation Forceps</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>00608-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Cotton Applicator</td>
			<td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td>
			<td>974116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps 10 cm&#160;</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>00632-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Tying Forceps</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50ml Original Perfusor</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728810F-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UT - 03 Cannula</td>
			<td>Unique Medical, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary Saline (500 ml)</td>
			<td>WDT</td>
			<td>18X1807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed Reservoir&#160; 2 L</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>73-3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Medium (500 ML)</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>A1217601</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

normothermic ex vivo liver machine perfusion in mouse

该协议提出了使用小鼠肝脏的优化的无红细胞NEVLP系统。小鼠肝脏的 离 体保存是通过采用改良的插管和改编自传统商业 离体 灌注设备的技术来实现的。该系统用于评估灌注12 h后的保存结果。C57BL / 6J小鼠作为肝脏供体，通过插管门静脉（PV）和胆管（BD）排出肝脏，随后用温（37°C）肝素化盐水冲洗器官。然后，将移出的肝脏转移到灌注室并进行常温氧合机灌注（NEVLP）。每隔3小时收集入口和出口灌注液样品进行灌注分析。灌注完成后，获得肝脏样本进行组织学分析，并通过苏木精 - 伊红（HE）染色使用改良的铃木评分评估形态完整性。优化实验得出以下结果：（1）体重超过30g的小鼠由于其胆管（BD）的尺寸较大，被认为更适合实验。（2） 与聚丙烯插管相比，2 Fr（外径 = 0.66 mm）聚氨酯插管更适合插管门静脉 （PV）。这归因于聚氨酯材料增强了抓地力，从而减少了从身体转移到器官室过程中导管打滑。（3）对于胆管（BD）的插管，发现1Fr（外径= 0.33mm）聚氨酯套管比聚丙烯UT-03（外径= 0.30mm）套管更有效。通过这种优化的方案，小鼠肝脏成功保存了12小时，对组织学结构没有显着影响。苏木精-伊红 （HE） 染色显示肝脏形态结构保存完好，其特征是主要存活的肝细胞，具有清晰可见的细胞核和肝窦的轻度扩张。

建立外科手术 本实验共使用17只动物：14只小鼠用于优化器官获取过程，包括门静脉（PV）和胆管（BD）的插管，而3只小鼠用于验证该程序（表1）。比较组织学结果（图3）以方便确定最佳灌注条件。
灌注液的选择 本研究选择了以前使用的肝细胞培养基10,11。William's E?...

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Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

为小鼠肝脏创建了常温 离体 肝灌注（NEVLP）系统。该系统需要显微外科手术经验，但允许可重复的灌注结果。利用小鼠肝脏的能力有助于研究分子途径以鉴定新型灌注添加剂，并能够执行专注于器官修复的实验。

小鼠常母离 体 肝机灌注

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

小鼠正常体外肝机灌注。常态氧合肝灌注是一种有前途的挽救边缘器官的策略，最近已引入临床实践。然而，潜在的分子机制尚不清楚。需要小鼠模型来进一步研究分子途径，利用转基因动物，如转基因小鼠，因此等待建立小鼠肝脏的常温氧合机灌注系统。这是我们整个系统的方案。首先，整个系统由恒温控制器通过水循环控制在37摄氏度。灌注液通过蠕动泵从储液罐泵入氧合器。氧合器中有95%氧气和5%二氧化碳的不间断气流。然后灌注液通过气泡捕集器。带有气泡的灌注液在压力下被泵回储液罐。剩余的灌注液流向器官室，管子连接到门静脉。灌注液通过上腔从肝脏排出到器官室。从器官腔室流出的灌注液通过蠕动泵引导回储液器。胆汁引流管连接到器官室以收集胆汁。这是我们的手术台。所有手术都在显微镜下进行。我们在整个手术过程中保持半无菌操作条件。用镊子握住法式管套管。用30G针在距离套管末端一厘米的距离内穿透套管壁。将针头推入套管，直到针尖可见。这是26G导管和自制套管的对比图;两者都适用于鼠标门插管。准备25毫升肝素化盐水，终浓度为每毫升2， 500国际单位，并将注射器置于40摄氏度的培养箱中。以下是离体常温机灌注系统的主要组成部分。部件主要包括风琴室、恒温机、滚筒泵、氧合器和储液罐。在这里，您可以看到我们风琴室的详细设置。基本上，它由器官室体，压力传感器，热交换器和气泡阱组成。我们设置了一个灌注液入口、一个灌注出口和一个胆汁引流口。这是我们用来监测门静脉压力的ADI监测系统。ADI系统由压力传感器、中央控制器和显示器组成。打开LabChart程序进行压力监测。每次使用压力传感器之前都需要校准和归零。使用零毫米汞柱和20毫米汞柱作为标记来校准压力传感器以进行两步校准。基于对门静脉压力的持续监测，我们可以根据压力变化调整门静脉。在向储液槽和器官室灌注等量以灌注系统时，必须特别注意在灌装过程中保持无菌。将感应室与墙上插座连接。将氧气调至每分钟 0.5 升。将异氟醚转至3%将动物放入室内直至达到深度麻醉。使用微型注射器应用体重适应剂量的镇痛药。这里，七微升丁丙诺啡。现在，我们开始手术。在小鼠的腹部区域做一个横向切口。皮肤切口延伸到两侧的双侧肉腋线。小心地沿着白线做一个纵向切口。用电凝和剪刀切开腹肌层。小心地放置一块湿纱布，以保护肝脏免受电凝。完全暴露小鼠的腹腔。用湿棉签小心地将小肠移出腹腔，以充分暴露肺门。这里显示的是门静脉插管和胆管插管的示意图。基本上，我们根据鼠标的大小选择合适的套管，我们使用6-0丝缝合线来固定套管。使用没有牙齿的细弯曲镊子小心地释放胆总管。胆总管很容易损坏和断裂。一旦断裂，就无法插管。由于解剖位置的方向，弯曲的镊子更容易操作。在胆总管上放置两个6-0丝线环，为下一步做准备。用30G针头小心地刺穿胆管。用尖弯曲的镊子把小孔扩大，这样就可以喂胆管插管了。使用血管插管钳穿过胆管插管并将其推入胆管。注意。在插管的那一刻，你会感受到胆汁带来的阻力。如果力控制不好，套管会被胆汁流出的压力推出胆道。小心调整套管的深度。如果太深，可能会损坏胆管，如果不够深，可能会滑出。插管成功后，可以在套管中观察到胆汁流动。用扁平镊子夹住门静脉，并用弯曲的镊子小心地释放结缔组织。不要在这里用力拉扯，以免导致门静脉撕裂。门静脉一旦受损，就很难对门静脉进行插管。将两个6-0丝线环放在自由门静脉上。使用动脉夹闭合门静脉远端静脉。非常小心地用上述门静脉套管之一刺穿门静脉。成功穿刺后，可以清楚地观察到套管内的血流。从培养箱中取预热的肝素盐水溶液。清除所有气泡。将装有预热肝素盐水的注射器固定到注射泵中。将注射泵的延长管连接到门静脉的套管。将速度调整到每分钟两毫升，然后开始肝脏冲洗。将异氟醚增加至5%，并用过量的异氟烷吸入对小鼠实施安乐死。在冲洗程序结束时观察肝脏的颜色。一旦颜色变成均匀的黄色，就切除肝脏。使用培养皿小心地将肝脏转移到器官室中。在培养皿中保留少量盐水，以防止肝脏被压碎。注意。在此过程中，门静脉和胆管很容易扭曲，这可能会影响肝脏灌注和胆汁收集。用注射器缓慢将生理盐水注入门静脉套管，以排出套管中的气泡。将门静脉插管连接到器官室的灌注流出管中。小鼠胆管套管通过器官室的瓣膜引导，该瓣膜用橡胶帽封闭。然后，将胆管插入预先制备的0.5毫升微管中，引线上有一个小孔。连接好所有设备后，打开蠕动泵。检查门静脉压力读数以调整流速。通过调节流速将门静脉压力保持在 7 到 10 毫米汞柱之间。注意。标称流量可能因管子的使用年限和位置而略有不同。这是基于正常温氧合大鼠肝机灌注研究的文献检查，对灌注介质、灌注量和灌注压力的选择。这是建立小鼠灌注模型的分步试验。大约需要14个实验来选择最合适的导管。在我们手中，门静脉使用两根法国橡胶导管，胆管使用一根法国橡胶导管，是在所有导管就位的情况下实现均匀灌注的最佳组合。pH值和钾水平在整个12小时灌注期间保持稳定。pH值范围为7.26至7.71，钾水平范围为每升5.9至6.8毫摩尔。HE染色表明，灌注12 h后，小鼠肝脏的组织学完整性保存得比较好。综上所述，我们在这里展示了小鼠肝脏常温氧合机灌注系统的成功建立。小鼠肝脏灌注12小时导致肝脏形态的良好保存，尽管不是整个器官。需要进一步努力才能在较长时间内实现完全均匀灌注。一旦实现了这一点，就可以考虑使用转基因动物，例如使用IL-2敲除小鼠来研究炎症的作用。

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