Name: normothermic ex vivo liver machine perfusion in mouse
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00
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Während des Schreibens dieses Artikels habe ich viel Unterstützung und Hilfe erhalten. Besonders bedanken möchte ich mich bei meinem Teamkollegen XinPei Chen für die wunderbare Zusammenarbeit und die geduldige Unterstützung während meiner Operation.

Die Tierversuche wurden nach den aktuellen deutschen Vorschriften und Richtlinien für den Tierschutz und den ARRIVE-Richtlinien für die Berichterstattung über Tierversuche durchgeführt. Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Deutschland genehmigt (Zulassungsnummer: UKJ - 17 - 106).
HINWEIS: Als Leberspender wurden männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 34 ± 4 g (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts [REM]) verwendet. S...

Kritische Schritte im Protokoll Die beiden entscheidenden Schritte bei der Leberexplantation sind die Kanülierung der Pfortader (PV) und die anschließende Kanülierung des Gallengangs (BD). Diese Schritte sind von größter Bedeutung, um eine erfolgreiche Organentnahme und anschließende Perfusions- oder Transplantationsverfahren zu gewährleisten.
Herausforderungen und Lösungen Die PV-Kanülierung stellt drei Herausforderungen dar: Verletzung der Gef...

Die Lebertransplantation stellt den Goldstandard für die Behandlung von Personen mit Lebererkrankungen im Endstadium dar. Bedauerlicherweise übersteigt die Nachfrage nach Spenderorganen das verfügbare Angebot, was zu einer erheblichen Verknappung führt. Im Jahr 2021 standen etwa 24.936 Patienten auf der Warteliste für ein Lebertransplantat, während nur 9.234 Transplantationen erfolgreich durchgeführt wurden1. Die erhebliche Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage nach Lebertransplantaten unterstreicht die dringende Notwendigkeit, alternative Strategien zur Erweiterung des Spenderpools und zur Verbesserung der Zugänglichkeit von Lebertransplantaten zu untersuchen. Eine Möglichkeit, den Spenderpool zu erweitern, ist der Einsatz von marginalen Spendern2. Zu den marginalen Spendern gehören Personen mit fortgeschrittenem, mittelschwerer oder schwerer Steatose. Obwohl die Transplantation von marginalen Organen zu günstigen Ergebnissen führen kann, bleiben die Gesamtergebnisse suboptimal. Daher ist derzeit die Entwicklung therapeutischer Strategien im Gange, die darauf abzielen, die Funktion marginaler Spender zu verbessern 3,4.
Eine der Strategien besteht darin, die maschinelle Perfusion, insbesondere die normotherme sauerstoffhaltige maschinelle Perfusion, zu nutzen, um die Funktion dieser marginalen Organe zu verbessern5. Es gibt jedoch noch ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die den positiven Effekten der normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) zugrunde liegen. Mäuse mit ihrer reichlichen Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen dienen als wertvolle Modelle für die Untersuchung molekularer Signalwege. So wurde beispielsweise die Bedeutung von Autophagie-Signalwegen bei der Linderung von Leberischämie-Reperfusionsschäden zunehmend anerkannt 6,7. Ein wichtiger molekularer Signalweg bei der hepatischen Ischämie-Reperfusions-Schädigung ist der miR-20b-5p/ATG7-Signalweg8. Derzeit gibt es eine Reihe von ATG-Knockout- und bedingten Knockout-Mausstämmen, aber keine entsprechenden Rattenstämme9.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel, eine miniaturisierte NEVLP-Plattform für Lebertransplantate von Mäusen zu generieren. Diese Plattform würde die Erforschung und Bewertung potenzieller genetisch veränderter Strategien zur Verbesserung der Funktionalität der Leber des Spenders erleichtern. Darüber hinaus war es wichtig, dass das System für eine langfristige Perfusion geeignet ist, um die Ex-vivo-Behandlung der Leber zu ermöglichen, die gemeinhin als "Organreparatur" bezeichnet wird.
In Anbetracht der begrenzten Verfügbarkeit relevanter In-vitro-Daten zur Leberperfusion von Mäusen konzentrierte sich die Literaturrecherche auf Studien, die an Ratten durchgeführt wurden. Eine systematische Literaturrecherche aus den Jahren 2010 bis 2022 wurde anhand von Schlagworten wie "normotherme Leberperfusion", "ex vivo oder in vitro" und "Ratten" durchgeführt. Diese Suche zielte darauf ab, optimale Bedingungen für Nagetiere zu identifizieren, so dass wir den am besten geeigneten Ansatz bestimmen konnten.
Das Perfusionssystem besteht aus einem abgedichteten, wasserummantelten Glaspufferreservoir, einer peristaltischen Rollenpumpe, einem Oxygenator, einer Blasenfalle, einem Wärmetauscher, einer Orgelkammer und einem geschlossenen Schlauchsystem (Abbildung 1). Das System gewährleistet die präzise Aufrechterhaltung einer konstanten Perfusionstemperatur von 37 °C mit einer speziellen thermostatischen Maschine. Die peristaltische Rollenpumpe treibt den Durchfluss des Perfusats durch den gesamten Kreislauf. Der Perfusionskreislauf beginnt am isolierten, wasserummantelten Reservoir. Anschließend wird das Perfusat durch den Oxygenator geleitet, der aus einer speziellen Gasflasche ein Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid erhält. Nach der Sauerstoffanreicherung durchläuft das Perfusat die Blasenfalle, in der alle eingeschlossenen Blasen von der Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet werden. Das verbleibende Perfusat fließt durch den Wärmetauscher und gelangt in den Orgelraum, von wo aus es in den Vorratsbehälter zurückkehrt.
Hier berichten wir über unsere Erfahrungen bei der Etablierung eines NEVLP für Mauslebern und teilen die vielversprechenden Ergebnisse eines Pilotversuchs, das mit dem sauerstoffhaltigen Medium ohne Sauerstoffträger durchgeführt wurde.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 ml Micro Tube PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Fr Rubber Cannula</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>Sample Cannula</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Micro Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Fr Rubber Cannula</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>Sample Cannula</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G Butterfly Cannula</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR+OF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G Butterfly Cannula</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR+DU2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needle</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>100246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Syringe Pump</td>
			<td>Braun</td>
			<td>110356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Perma-Hand Seide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>639H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arterial Clip</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BH014R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Moist Chamber</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big Cotton Applicator&#160;</td>
			<td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td>
			<td>974018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Hugo-Sachs-Elektronik</td>
			<td>V83163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenovet (0.3 mg / ml)</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIDEX OPA solution (2 L)</td>
			<td>Cilag GmbH</td>
			<td>20391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO&#174; 50 C</td>
			<td>ERBE</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(500 ml)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Mixture (95 % oxygen &#38; 5 % carbon dioxide)</td>
			<td>House Supply</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Circulating Baths</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>75-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000 (I.E. /5 ml)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1708.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>15427276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin(100 IE / ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran (250 ml)</td>
			<td>Cp-Pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Oxygenator</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>T18728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Retractor Set&#160;</td>
			<td>Carfil Quality</td>
			<td>180000056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges&#160;</td>
			<td>Kompressen</td>
			<td>866110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)&#160;</td>
			<td>C.C.Pro</td>
			<td>Z-13-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Extension Tube (30 cm)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4256000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>P-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishc 100x15 mm</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>391-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td>
			<td>Livisto</td>
			<td>799-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducer Simulator</td>
			<td>UTAH Medical Products</td>
			<td>650-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Blood Pressure Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT-0380/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S &#38; T Vessel Cannulation Forceps</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>00608-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Cotton Applicator</td>
			<td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td>
			<td>974116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps 10 cm&#160;</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>00632-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Tying Forceps</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50ml Original Perfusor</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728810F-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UT - 03 Cannula</td>
			<td>Unique Medical, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary Saline (500 ml)</td>
			<td>WDT</td>
			<td>18X1807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed Reservoir&#160; 2 L</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>73-3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Medium (500 ML)</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>A1217601</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

normothermic ex vivo liver machine perfusion in mouse

Dieses Protokoll stellt ein optimiertes erythrozytenfreies NEVLP-System unter Verwendung von Mauslebern dar. Die Ex-vivo-Konservierung von Mäuselebern wurde durch den Einsatz modifizierter Kanülen und Techniken erreicht, die von konventionellen kommerziellen Ex-vivo-Perfusionsgeräten übernommen wurden. Das System wurde verwendet, um die Konservierungsergebnisse nach 12 h Perfusion zu bewerten. C57BL/6J-Mäuse dienten als Leberspender, und die Lebern wurden explantiert, indem die Pfortader (PV) und der Gallengang (BD) kanüliert und das Organ anschließend mit warmer (37 °C) heparinisierter Kochsalzlösung gespült wurde. Anschließend wurden die explantierten Lebern in die Perfusionskammer überführt und einer normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) unterzogen. Die Einlass- und Auslassproben des Perfusats wurden in Abständen von 3 Stunden zur Perfusatanalyse entnommen. Nach Abschluss der Perfusion wurden Leberproben zur histologischen Analyse entnommen, wobei die morphologische Integrität mittels modifiziertem Suzuki-Score durch Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung beurteilt wurde. Die Optimierungsexperimente ergaben folgende Ergebnisse: (1) Mäuse mit einem Gewicht von über 30 g wurden aufgrund der größeren Größe ihres Gallengangs (BD) als besser geeignet für das Experiment erachtet. (2) Eine 2 Fr (Außendurchmesser = 0,66 mm) Polyurethankanüle war im Vergleich zu einer Polypropylenkanüle besser für die Kanülierung der Pfortader (PV) geeignet. Dies wurde auf die verbesserte Griffigkeit des Polyurethanmaterials zurückgeführt, die zu einem geringeren Katheterschlupf während des Transfers vom Körper in die Organkammer führte. (3) Für die Kanülierung des Gallengangs (BD) erwies sich eine 1 Fr (Außendurchmesser = 0,33 mm) Polyurethankanüle als wirksamer als die Polypropylenkanüle UT - 03 (Außendurchmesser = 0,30 mm). Mit diesem optimierten Protokoll konnten Mauslebern erfolgreich für eine Dauer von 12 Stunden konserviert werden, ohne dass die histologische Struktur signifikant beeinflusst wurde. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ergab eine gut erhaltene morphologische Architektur der Leber, die durch überwiegend lebensfähige Hepatozyten mit deutlich sichtbaren Zellkernen und eine leichte Dilatation der hepatischen Sinusoide gekennzeichnet ist.

Etablierung des chirurgischen Verfahrens Insgesamt wurden 17 Tiere für dieses Experiment verwendet: 14 Mäuse wurden zur Optimierung des Organbeschaffungsprozesses einschließlich der Kanülierung der Pfortader (PV) und des Gallengangs (BD) eingesetzt, während 3 Mäuse zur Validierung des Verfahrens verwendet wurden (Tabelle 1). Die histologischen Ergebnisse (Abbildung 3) wurden verglichen, um die Identifizierung der optimalen Perfusionsbedingungen zu e...

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Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

Für die Leber von Mäusen wurde ein normothermisches ex vivo Leberperfusionssystem (NEVLP) entwickelt. Dieses System erfordert Erfahrung in der Mikrochirurgie, ermöglicht aber reproduzierbare Perfusionsergebnisse. Die Möglichkeit, Mäuselebern zu verwenden, erleichtert die Untersuchung molekularer Signalwege zur Identifizierung neuartiger Perfusat-Additive und ermöglicht die Durchführung von Experimenten, die sich auf die Reparatur von Organen konzentrieren.

Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Normotherme Ex-vivo-Lebermaschinenperfusion bei Mäusen. Die normotherme oxygenierte Leberperfusion ist eine vielversprechende Strategie zur Rettung marginaler Organe und wurde kürzlich in die klinische Praxis eingeführt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch nicht gut verstanden.Ein Mausmodell wird benötigt, um die molekularen Signalwege weiter zu untersuchen, wobei genetisch veränderte Tiere, wie z.B. transgene Mäuse, genutzt werden, um auf die Etablierung eines normothermen sauerstoffhaltigen maschinellen Perfusionssystems für Mäuseleber zu warten. Hier ist ein Schema unseres gesamten Systems. Zunächst wird das gesamte System bei 37 Grad Celsius von einem thermostatischen Regler durch Wasserzirkulation gesteuert.Das Perfusat wird aus dem Reservoir durch eine Peristaltikpumpe in einen Oxygenator gepumpt. Im Oxygenator befindet sich ein ununterbrochener Gasfluss von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Das Perfusat durchläuft dann eine Blasenfalle.Das Perfusat mit Luftblasen wird unter Druck zurück in den Vorratsbehälter gepumpt. Das verbleibende Perfusat fließt in die Orgelkammer, wo der Schlauch mit der Pfortader verbunden ist. Das Perfusat wird aus der Leber durch den suprahepatischen Cava in die Organkammer abgeleitet.Der Perfusatabfluss aus dem Orgelraum wird durch die Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet. Ein Gallendrainageschlauch ist mit der Orgelkammer verbunden, um die Galle aufzufangen. Das ist unser OP-Tisch.Alle Operationen werden unter dem Mikroskop durchgeführt. Wir sorgen für halbsterile Betriebsbedingungen während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Halten Sie die französische Schlauchkanüle mit einer Pinzette fest.Durchdringen Sie die Kanülenwand mit einer 30G-Nadel in einem Abstand von einem Zentimeter vom Ende der Kanüle. Schieben Sie die Nadel durch die Kanüle, bis die Nadelspitze sichtbar wird. Hier ist ein Vergleichsbild von 26G-Katheter und selbstgebauter Kanüle; Beide sind für die Mausportalkanülierung geeignet.Bereiten Sie 25 Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung mit einer Endkonzentration von 2.500 internationalen Einheiten pro Milliliter vor und legen Sie die Spritze in einen Inkubator, der auf 40 Grad Celsius eingestellt ist. Hier sind die Hauptkomponenten des normothermen maschinellen Perfusionssystems ex vivo. Zu den Komponenten gehören hauptsächlich der Orgelraum, die Thermostatmaschine, die Rollenpumpe, der Oxygenator und das Reservoir.Hier sehen Sie einen detaillierten Aufbau unseres Orgelraums. Grundsätzlich besteht es aus einem Orgelkammerkörper, einem Drucksensor, einem Wärmetauscher und einer Blasenfalle. Wir richten einen Perfusat-Einlass, einen Perfusat-Auslass und eine Gallenabflussöffnung ein.Dies ist das ADI-Überwachungssystem, das wir zur Überwachung des Pfortaderdrucks verwenden. Das ADI-System besteht aus einem Drucksensor, einer zentralen Steuerung und Displays. Schalten Sie das LabChart-Programm für die Drucküberwachung ein.Kalibrierung und Nullstellung sind vor jeder Verwendung des Drucksensors erforderlich. Verwenden Sie Null-Millimeter-Quecksilber und 20-Millimeter-Quecksilber als Markierungen, um den Drucksensor für die zweistufige Kalibrierung zu kalibrieren. Aufgrund der ständigen Überwachung des Portaldrucks können wir das Portal fluran entsprechend den Druckänderungen anpassen.Bei gleichen Mengen an Perfusat für das Reservoir und die Orgelkammer zur Vorbereitung des Systems muss besonderes Augenmerk auf die Aufrechterhaltung der Sterilität während des Füllprozesses gelegt werden. Verbinden Sie die Induktionskammer mit einer Steckdose. Drehen Sie den Sauerstoff auf 0,5 Liter pro Minute.Verwandeln Sie Isofluran auf 3%Legen Sie das Tier in die Kammer, bis eine tiefe Betäubung erreicht ist. Verwenden Sie eine Mikrospritze, um eine an das Körpergewicht angepasste Dosis der Analgesie aufzutragen. Hier sieben Mikroliter Buprenorphin.Jetzt beginnen wir mit der Operation. Machen Sie einen Querschnitt im Bauchbereich der Maus. Der Hautschnitt erstreckt sich beidseitig bis zur beidseitigen Fleischachsellinie.Machen Sie vorsichtig einen Längsschnitt entlang der Linea alba. Durchtrennen Sie die Bauchmuskelschicht mit Elektrokoagulation und Schere. Legen Sie vorsichtig ein Stück nasse Gaze auf, um die Leber vor Elektrokoagulation zu schützen.Legen Sie die Bauchhöhle der Maus vollständig frei. Bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig mit einem feuchten Wattestäbchen aus der Bauchhöhle, um den Hilus vollständig freizulegen. Hier ist ein schematisches Diagramm der Pfortaderkanülierung und Gallengangskanülierung dargestellt.Grundsätzlich wählen wir die passende Kanüle entsprechend der Größe der Maus aus und verwenden für die Fixierung der Kanüle 6-0 Seidennaht. Befreien Sie den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette ohne Zähne. Der gemeinsame Gallengang wird sehr leicht beschädigt und bricht.Sobald es bricht, kann es nicht mehr kanüliert werden. Durch die Richtung der anatomischen Position sind gebogene Pinzetten leichter zu bedienen. Legen Sie zwei 6-0 Seidenfadenschlaufe über den gemeinsamen Gallengang, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten.Durchstechen Sie den Gallengang vorsichtig mit einer 30G-Nadel. Verwenden Sie eine spitze, gebogene Pinzette, um die kleinen Löcher zu vergrößern, damit die Gallengangskanülierung gespeist werden kann. Verwenden Sie eine Gefäßkanülenzange über die Gallengangskanüle und schieben Sie sie in den Gallengang. Anmerkung.Im Moment der Kanülierung werden Sie den Widerstand spüren, den die Galle mit sich bringt. Wenn die Kraft nicht gut kontrolliert wird, wird die Kanüle durch den Druck des Gallenabflusses aus den Gallenwegen gedrückt. Stellen Sie die Tiefe der Kanüle vorsichtig ein.Wenn es zu tief ist, kann es den Gallengang beschädigen, und wenn es nicht tief genug ist, kann es herausrutschen. Der Gallenfluss in der Kanüle kann nach erfolgreicher Kanülierung beobachtet werden. Klemmen Sie die Pfortader mit einer flachen Pinzette ab und befreien Sie vorsichtig das Bindegewebe mit einer gebogenen Pinzette.Ziehen Sie hier nicht zu stark, um ein Reißen der Pfortader zu vermeiden. Sobald die Pfortader beschädigt ist, ist es schwierig, die Pfortader zu kanulieren. Legen Sie zwei 6-0 Seidennahtschlaufe über die freie Pfortader.Verwenden Sie eine arterielle Klammer, um die distale Pfortader zu verschließen. Punktieren Sie die Pfortader sehr vorsichtig mit einer der oben genannten Pfortaderkanülen. Der Blutfluss innerhalb der Kanüle ist nach einer erfolgreichen Punktion deutlich zu beobachten.Nehmen Sie vorgewärmte Heparin-Kochsalzlösung aus dem Inkubator. Entfernen Sie alle Luftblasen. Befestigen Sie die Spritze mit der vorgewärmten heparinisierten Kochsalzlösung in der Spritzenpumpe.Verbinden Sie den Verlängerungsschlauch der Spritzenpumpe mit der Kanüle der Pfortader. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf zwei Milliliter pro Minute ein und starten Sie die Leberspülung. Erhöhen Sie den Isoflurangehalt auf 5 % und euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran-Inhalation.Beobachten Sie die Farbe der Leber am Ende des Spülvorgangs. Schneiden Sie die Leber heraus, sobald die Farbe ein homogenes Gelb angenommen hat. Übertragen Sie die Leber vorsichtig mit einer Petrischale in die Organkammer.Bewahren Sie eine kleine Menge Kochsalzlösung in der Petrischale auf, um zu verhindern, dass eine Leber zerdrückt wird. Anmerkung. Pfortader und Gallengang können bei diesem Eingriff leicht verdreht werden, was die Leberdurchblutung und die Gallensammlung beeinträchtigen kann. Infundieren Sie mit einer Spritze langsam normale Kochsalzlösung in die Pfortaderkanüle, um die Luftblasen in der Kanüle zu entfernen.Verbinden Sie die Pfortaderkanüle mit dem Perfusat-Abflussschlauch in der Orgelkammer. Die Gallengangskanüle der Maus wird durch ein Ventil der Organkammer geführt, das mit einer Gummikappe verschlossen wird. Dann wird der Gallenschlauch in ein vorbereitetes 0,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit einem kleinen Loch in der Elektrode eingeführt.Nachdem alles angeschlossen ist, schalten Sie die Peristaltikpumpe ein. Überprüfen Sie den Pfortaderdruck, um die Durchflussrate anzupassen. Halten Sie den Pfortaderdruck zwischen sieben und 10 Millimeter Quecksilbersäule, indem Sie die Durchflussrate anpassen. Anmerkung.Der Nenndurchfluss kann je nach Alter und Positionierung der Rohre leicht variieren. Dies ist die Auswahl des Perfusatmediums, des Perfusatvolumens und des Perfusionsdrucks auf der Grundlage einer Literaturaufarbeitung von normothermen sauerstoffhaltigen Rattenlebermaschinen-Perfusionsstudien. Dies ist ein Schritt-für-Schritt-Versuch zur Etablierung des Maus-Perfusionsmodells.Es waren etwa 14 Experimente erforderlich, um die am besten geeigneten Katheter auszuwählen. In unseren Händen ist die Verwendung von zwei französischen Gummikathetern für die Pfortader zusammen mit einem französischen Gummikatheter für den Gallengang die beste Kombination, um eine homogene Perfusion mit allen Kathetern zu erreichen. pH-Wert und Kaliumspiegel waren während der 12-stündigen Perfusion stabil.Der pH-Wert lag zwischen 7,26 und 7,71 und der Kaliumgehalt zwischen 5,9 und 6,8 Millimol pro Liter. Die HE-Färbung zeigt, dass nach 12 Stunden Perfusion die histologische Integrität der Mausleber relativ gut erhalten war. Zusammenfassend konnten wir hier die erfolgreiche Etablierung eines normothermen oxygenierten maschinellen Perfusionssystems für die Mausleber demonstrieren.Die Perfusion einer Mausleber über 12 Stunden führte zu einer guten Erhaltung der Lebermorphologie, wenn auch nicht im gesamten Organ. Weitere Anstrengungen sind erforderlich, um eine vollständig homogene Perfusion über einen längeren Zeitraum zu erreichen. Sobald dies erreicht ist, kann der Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren in Betracht gezogen werden, wie z. B. der Einsatz von IL-2-Knockout-Mäusen, um die Rolle der Entzündung zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Engineering

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

High-Auflösung, High-Speed-, Three-dimensional Imaging mit Digital-Video-Streifenprojektionstechnik

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Forschung

Ingenieurwesen

The Preparation of Electrohydrodynamic Bridges from Polar Dielectric Liquids

Die Herstellung elektro Bridges von Polar Schlags Flüssigkeiten

Horizontal and vertical liquid bridges are simple and powerful tools for exploring the interaction of high intensity electric fields (8-20 kV/cm) and ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Fabrication of Ultra-thin Color Films with Highly Absorbing Media Using Oblique Angle Deposition

Herstellung von ultra-dünnen Farbfilm mit stark absorbierenden Medien mit schrägen Winkel Deposition

Ultra-thin film structures have been studied extensively for use as optical coatings, but performance and fabrication challenges remain.&#160; We present ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

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Methoden der Ex-Situ und In Situ Untersuchungen zu strukturellen Veränderungen: der Fall der Kristallisation von metallischen Gläsern

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

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In terms of accurate and precise mechanical testing, machines run the continuum. Whereas commercial platforms offer excellent accuracy, they can be ...

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