Name: normothermic ex vivo liver machine perfusion in mouse
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00
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この論文の執筆を通して、私は多くの支援と支援を受けました。特に、チームメイトのXinPei Chenの素晴らしい協力と私の手術中の忍耐強いサポートに感謝したいと思います。

動物実験は、動物福祉に関する現在のドイツの規制とガイドライン、および動物研究の報告に関するARRIVEガイドラインに従って実施されました。動物実験プロトコルは、ドイツ、テューリンゲン州のテューリンガー州議会によって承認されました(承認番号:UKJ - 17 - 106)。
注:体重34 ± 4 g(平均[SEM]の平均±標準誤差)の雄C57BL / 6Jマウスを肝臓ドナーとして使用しました。それ?...

プロトコルの重要なステップ 肝移植における2つの重要なステップは、門脈のカニューレ挿入(PV)とそれに続く胆管のカニューレ挿入(BD)です。これらのステップは、臓器摘出とその後の灌流または移植手順を成功させる上で最も重要です。
課題と解決策 PVカニュレーションには、血管壁の損傷、カテーテルの変位、挿入プロセスの実用性の3?...

肝移植は、末期肝疾患のある個人のゴールドスタンダード治療です。残念ながら、ドナー臓器の需要は利用可能な供給を上回り、大幅な不足につながっています。2021年には、約24,936人の患者が肝移植の順番待ちリストに載っていましたが、成功した移植は9,234件だけでした1。肝移植片の需要と供給の著しい格差は、ドナープールを拡大し、肝移植片のアクセシビリティを高めるための代替戦略を調査する差し迫った必要性を浮き彫りにしています。ドナープールを拡大する1つの方法は、限界ドナー2を使用することです。限界ドナーには、高齢、中等度または重度の脂肪症のドナーが含まれます。辺縁臓器の移植は好ましい結果をもたらすかもしれませんが、全体的な結果は最適ではないままです。その結果、限界ドナーの機能を高めることを目的とした治療戦略の開発が現在進行中です3,4。
戦略の1つは、機械灌流、特に正常体温酸素化機械灌流を使用して、これらの辺縁器官の機能を改善することです5。しかし、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)の有益な効果の根底にある分子メカニズムについての理解はまだ限られています。マウスは、遺伝子組み換え株が豊富に利用できるため、分子経路を調べるための貴重なモデルとして機能します。例えば、肝虚血再灌流障害の緩和におけるオートファジー経路の重要性は、ますます認識されています6,7。肝虚血再灌流障害における重要な分子経路の1つは、miR-20b-5p/ATG7経路8です。現在、ATGノックアウトおよび条件付きノックアウトマウス系統が多数入手可能であるが、対応するラット系統は存在しない9。
このような背景から、マウス肝移植片用の小型NEVLPプラットフォームを作製することを目的としていました。このプラットフォームは、ドナーの肝臓の機能を改善することを目的とした潜在的な遺伝子組み換え戦略の調査と評価を容易にします。さらに、システムが長期灌流に適していることが不可欠であり、一般に「臓器修復」と呼ばれる肝臓の 生体外 治療を可能にしました。
マウス肝灌流に関する関連する in vitro データの入手可能性が限られていることを考慮して、文献レビューはラットで実施された研究に焦点を当てた。2010年から2022年までの文献を「正常熱肝灌流」「ex vivo または in vitro」「ラット」などのキーワードを用いて系統的検索を行った。この検索は、げっ歯類の最適条件を特定することを目的としており、最も適切なアプローチを決定することができました。
灌流システムは、密閉されたウォータージャケット付きガラスバッファーリザーバー、ペリスタルティックローラーポンプ、酸素発生器、バブルトラップ、熱交換器、臓器室、およびクローズドサイクリングチューブシステムで構成されています(図1)。このシステムは、専用のサーモスタットマシンを使用して、37°Cの一定の灌流温度を正確に維持します。蠕動ローラーポンプは、回路全体の灌流液の流れを駆動します。灌流回路は、絶縁されたウォータージャケットリザーバーで開始されます。続いて、灌流液は酸素発生器を通って導かれ、酸素発生器は専用のガスボトルから95%の酸素と5%の二酸化炭素のガス混合物を受け取る。酸素化に続いて、灌流液はバブルトラップを通過し、そこで閉じ込められた気泡は蠕動ポンプによってリザーバーにリダイレクトされます。残りの灌流液は熱交換器を通って流れ、臓器室に入り、そこからリザーバーに戻ります。
本稿では、マウス肝臓のNEVLPを確立した経験を報告し、酸素キャリアを含まない酸素化培地を用いて行ったパイロット実験の有望な結果を共有します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 ml Micro Tube PP</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 Fr Rubber Cannula</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>Sample Cannula</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Micro Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Fr Rubber Cannula</td>
			<td>Vygon</td>
			<td>Sample Cannula</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 G Butterfly Cannula</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR+OF2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G Butterfly Cannula</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR+DU2619WX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Hypodermic Needle</td>
			<td>Sterican</td>
			<td>100246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Syringe Pump</td>
			<td>Braun</td>
			<td>110356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Perma-Hand Seide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>639H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arterial Clip</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BH014R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable Moist Chamber</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big Cotton Applicator&#160;</td>
			<td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td>
			<td>974018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td>Hugo-Sachs-Elektronik</td>
			<td>V83163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenovet (0.3 mg / ml)</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIDEX OPA solution (2 L)</td>
			<td>Cilag GmbH</td>
			<td>20391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO&#174; 50 C</td>
			<td>ERBE</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(500 ml)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Mixture (95 % oxygen &#38; 5 % carbon dioxide)</td>
			<td>House Supply</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Circulating Baths</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>75-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin 5000 (I.E. /5 ml)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>1708.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>15427276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin(100 IE / ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran (250 ml)</td>
			<td>Cp-Pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Oxygenator</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>T18728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Retractor Set&#160;</td>
			<td>Carfil Quality</td>
			<td>180000056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges&#160;</td>
			<td>Kompressen</td>
			<td>866110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)&#160;</td>
			<td>C.C.Pro</td>
			<td>Z-13-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Extension Tube (30 cm)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4256000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>P-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishc 100x15 mm</td>
			<td>VWR&#174;</td>
			<td>391-0578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td>
			<td>Livisto</td>
			<td>799-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducer Simulator</td>
			<td>UTAH Medical Products</td>
			<td>650-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Blood Pressure Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT-0380/D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S &#38; T Vessel Cannulation Forceps</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>00608-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Cotton Applicator</td>
			<td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td>
			<td>974116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps 10 cm&#160;</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>00632-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Tying Forceps</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>11063-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50ml Original Perfusor</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728810F-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UT - 03 Cannula</td>
			<td>Unique Medical, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Instruments</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary Saline (500 ml)</td>
			<td>WDT</td>
			<td>18X1807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed Reservoir&#160; 2 L</td>
			<td>Harvard-Apparatus</td>
			<td>73-3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Medium (500 ML)</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>A1217601</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

normothermic ex vivo liver machine perfusion in mouse

このプロトコルは、マウス肝臓を用いた最適化された赤血球フリーNEVLPシステムを提示します。マウス肝臓の 生体外 保存は、改変カニューレおよび従来の市販 のex vivo 灌流装置から適応された技術を採用することによって達成された。このシステムは、12時間の灌流後の保存結果を評価するために利用されました。C57BL/6Jマウスを肝ドナーとし、門脈(PV)と胆管(BD)をカニューレ挿入し、その後、温かい(37°C)ヘパリン化生理食塩水で臓器を洗い流すことによって肝臓を移植しました。次いで、移植した肝臓を灌流チャンバーに移し、正常体温酸素化機械灌流(NEVLP)に供した。流入口および出口灌流液サンプルを、灌流液分析のために3時間間隔で収集した。灌流が完了すると、組織学的分析のために肝臓サンプルが取得され、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色による修正スズキスコアを使用して形態学的完全性が評価されました。最適化実験の結果、(1)体重が30gを超えるマウスは、胆管(BD)のサイズが大きいため、実験に適していると見なされました。(2) 2 Fr(外径=0.66 mm)ポリウレタンカニューレは, ポリプロピレンカニューレと比較して門脈カニューレ挿入(PV)に適していた.これは、ポリウレタン素材のグリップ力が向上し、体から臓器室への移動中のカテーテルの滑りが減少したことに起因していました。(3)胆管カニューレ挿入術(BD)では,ポリプロピレンUT-03(外径=0.30mm)カニューレに比べて1Fr(外径=0.33mm)ポリウレタンカニューレの方が有効であることがわかった。この最適化されたプロトコルにより、マウスの肝臓は、組織学的構造に大きな影響を与えることなく、12時間の間首尾よく保存されました。ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色により、肝臓のよく保存された形態学的構造が明らかになり、核がはっきりと見える主に生存肝細胞と肝類洞の軽度の拡張が特徴でした。

手術手技の確立 合計17匹の動物がこの実験に利用されました:門脈(PV)と胆管(BD)のカニューレ挿入を含む臓器調達プロセスを最適化するために14匹のマウスが使用され、3匹のマウスが手順を検証するために使用されました(表1)。組織学的結果(図3)を、最適な灌流条件の同定を容易にするために比較した。
灌流液の選?...

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Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

マウス肝臓用に正常体温 外生体外 肝灌流(NEVLP)システムが作成されました。このシステムはマイクロサージャリーの経験が必要ですが、再現性のある灌流結果を可能にします。マウスの肝臓を利用することで、分子経路の探索が容易になり、新規灌流液添加物が同定され、臓器修復に重点を置いた実験が可能になります。

マウスにおけるノルマザーミック Ex vivo 肝臓機械灌流

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

マウスにおけるノルマザーミックなex vivo肝機械灌流。ノルマザーの酸素化肝灌流は、辺縁臓器を救済するための有望な戦略であり、最近臨床診療で導入されています。しかし、その根底にある分子メカニズムはよくわかっていません。トランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物を利用して、分子経路をさらに研究するにはマウスモデルが必要であり、マウス肝臓の正常体温酸素化機械灌流システムの確立が待たれています。これが私たちのシステム全体のスキームです。まず、システム全体は、水循環によるサーモスタットコントローラーによって摂氏37度に制御されます。灌流液は、蠕動ポンプによってリザーバーから酸素発生器にポンプで送られます。酸素発生器には、95%の酸素と5%の二酸化炭素の途切れることのないガスの流れがあります。その後、灌流液はバブルトラップを通過します。気泡を含む灌流液は、加圧下でリザーバーにポンプで戻されます。残りの灌流液は臓器室に流れ、そこでチューブは門脈に接続されます。灌流液は肝臓から肝上カバを通って臓器腔に排出されます。臓器室からの灌流液の流出は、蠕動ポンプによってリザーバーに戻されます。胆汁を集めるために胆汁排液チューブが臓器室に接続されています。これが私たちの手術台です。すべての手術は顕微鏡下で行われます。私たちは、外科的処置を通して半滅菌操作条件を維持します。フレンチチューブカニューレを鉗子で持ちます。カニューレの端から1センチメートルの距離で30Gの針でカニューレ壁を貫通します。針の先端が見えるようになるまで、針をカニューレに通します。これは26Gカテーテルと自作カニューレの比較写真です。どちらもマウスポータルカニュレーションに適しています。1ミリリットルあたり2, 500国際単位の最終濃度で25ミリリットルのヘパリン化生理食塩水を調製し、摂氏40度に設定したインキュベーターにシリンジを置く。これがex-vivo標準体温機械灌流システムの主なコンポーネントです。コンポーネントには、主に臓器室、サーモスタットマシン、ローラーポンプ、酸素発生器、およびリザーバーが含まれます。ここでは、私たちの臓器室の詳細なセットアップを見ることができます。基本的には、臓器室本体、圧力センサー、熱交換器、バブルトラップで構成されています。灌流入口、灌流出口、胆汁排出口を設置しました。これは、門脈圧のモニタリングに使用するアナログ・デバイセズのモニタリング・システムです。アナログ・デバイセズのシステムは、圧力センサー、中央コントローラ、ディスプレイで構成されています。圧力監視のためにLabChartプログラムをオンにします。圧力センサーを使用する前に、校正とゼロ調整が必要です。ゼロミリメートル水銀と20ミリメートル水銀をマークとして使用して、2段階校正用の圧力センサーを校正します。門脈圧の常時監視に基づいて、圧力変化に応じて門脈フルランを調整することができます。システムをプライミングするためにリザーバーと臓器室に同量の灌流液を供給する場合、充填プロセス中に無菌性を維持するために特別な注意を払う必要があります。誘導室を壁のコンセントに接続します。酸素を毎分0.5リットルにします。イソフルランを3%に回します深い麻酔に達するまで動物をチャンバーに入れます。マイクロシリンジを使用して、体重に適合した用量の鎮痛剤を適用します。ここでは、7マイクロリットルのブプレノルフィン。さあ、手術を始めます。マウスの腹部を横切開します。皮膚切開は両側の両側肉腋窩線まで伸びています。慎重にラインアルバに沿って縦方向の切開を行います。電気凝固とはさみで腹筋層を切ります。肝臓を電気凝固から保護するために、湿ったガーゼを慎重に置きます。マウスの腹腔を完全に露出させる。湿った綿棒で小腸を腹腔から慎重に移動させ、丘を完全に露出させます。ここに示すのは、門脈カニュレーションと胆管カニュレーションの模式図です。基本的にはマウスの大きさに合わせて適切なカニューレを選び、カニューレの固定には6-0のシルク縫合糸を使用します。歯のない細かい湾曲した鉗子を使用して、総胆管を慎重に解放します。総胆管は非常に簡単に損傷して壊れます。一度壊れると、カニューレ挿入することはできません。解剖学的位置の方向により、湾曲した鉗子は操作が簡単です。次のステップに備えて、2つの6-0シルク縫合ループを総胆管の上に置きます。30Gの針で胆管を慎重に穿刺します。先のとがった湾曲した鉗子を使用して小さな穴を拡大し、胆管カニュレーションを供給できるようにします。胆管カニューレを横切って血管カニューレ鉗子を使用し、胆管に押し込みます。手記。カニュレーションの瞬間に、あなたは胆汁によってもたらされる抵抗を感じるでしょう。力が十分に制御されていない場合、カニューレは胆汁流出の圧力によって胆道から押し出されます。カニューレの深さを慎重に調整します。深すぎると胆管を傷つけたり、深すぎると抜け落ちたりすることがあります。カニューレ挿入が成功した後、カニューレに胆汁の流れが観察されます。平らな鉗子で門脈を固定し、湾曲した鉗子で結合組織を慎重に解放します。門脈の裂け目を引き起こさないように、ここで強く引っ張らないでください。門脈が損傷すると、門脈をカニューレ挿入することは困難です。2つの6-0シルク縫合糸ループを無料の門脈の上に置きます。動脈クリップを使用して遠位門脈を閉じます。上記の門脈カニューレのいずれかで門脈を非常に慎重に穿刺します。穿刺が成功した後、カニューレ内の血流がはっきりと観察できます。インキュベーターから予熱したヘパリン生理食塩水を取ります。気泡をすべて取り除きます。予熱したヘパリン化生理食塩水でシリンジをシリンジポンプに固定します。シリンジポンプの延長チューブを門脈のカニューレに接続します。速度を毎分2ミリリットルに調整し、肝臓の紅潮を開始します。イソフルランを5%に増やし、過剰摂取のイソフルラン吸入でマウスを安楽死させる。紅潮手順の最後に肝臓の色を観察します。色が均一な黄色に変わったら肝臓を切除します。ペトリ皿を使用して肝臓を臓器室に慎重に移します。肝臓がつぶれるのを防ぐために、ペトリ皿に少量の生理食塩水を保管してください。手記。門脈と胆管はこの手順中に簡単にねじれる可能性があり、肝灌流と胆汁収集に影響を与える可能性があります。通常の生理食塩水を注射器で門脈カニューレにゆっくりと注入し、カニューレ内の気泡を排出します。門脈カニューレを臓器室の灌流液流出チューブに接続します。マウス胆管カニューレは、ゴム製のキャップで閉じられている臓器室の弁を通して導かれる。次に、胆汁チューブを、リードに小さな穴を開けた事前に準備された0.5ミリリットルのマイクロチューブに挿入します。すべてが接続されたら、蠕動ポンプをオンにします。門脈圧の読み取り値をチェックして、流量を調整します。流量を調整して、門脈圧を7〜10ミリメートル水銀柱に維持します。手記。公称流量は、チューブの年齢や位置によってわずかに異なる場合があります。これは、正常体温酸素化ラット肝機械灌流研究の文献精密検査に基づく灌流液媒体、灌流液量、および灌流圧力の選択です。これは、マウス灌流モデルを確立するための段階的な試行です。最適なカテーテルを選択するのに約14回の実験が必要でした。私たちの手では、門脈に2つのフランスのゴム製カテーテルを使用し、胆管に1つのフランスのゴム製カテーテルを使用することは、すべてのカテーテルを所定の位置に置いた状態で均一な灌流を達成するための最良の組み合わせです。pHレベルおよびカリウムレベルは、12時間の灌流を通して安定していた。pHレベルは7.26〜7.71の範囲であり、カリウムレベルは1リットルあたり5.9〜6.8ミリモルの範囲でした。HE染色は、12時間の灌流後、マウス肝臓の組織学的完全性が比較的良好に保存されたことを示している。まとめると、マウス肝臓用の恒温酸素化機械灌流システムの確立に成功しました。マウス肝臓を12時間灌流すると、肝臓の形態が良好に保存されましたが、臓器全体ではありませんでした。より長い期間にわたって完全な均質灌流を達成するには、さらなる努力が必要である。これが達成されると、炎症の役割を調べるためにIL-2-ノックアウトマウスを使用するなど、遺伝子組み換え動物の使用を検討することができます。

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