Name: В центре внимания автора: Совершенствование стимуляции спинного мозга - изучение клеточных реакций моторных нейронов с помощью электрофизиологии патч-хомута
Uploaded: 2023-09-08T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the Cellular Responses of Motor Neurons Through Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая для молодых ученых (52207254 и 82301657) и Китайским фондом постдокторантуры (2022M711833).

Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил все эксперименты на животных, и исследования были проведены в соответствии с соответствующими правилами защиты животных.
1. Подготовка животных
<ol><li>Животные<ol><li>Информация о содержан?...

Понимание реакции двигательных нейронов на стимуляцию спинного мозга

<ol>
	<li>Rowald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+spinal+cord+neuromodulation+rapidly+restores+trunk+and+leg+motor+functions+after+complete+paralysis.">Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis.</a> Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).</li><li>Kathe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurons+that+restore+walking+after+paralysis.">The neurons that restore walking after paralysis.</a> Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).</li><li>Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatial+distribution+of+calcium+signals+in+squid+presynaptic+terminals.">The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals.</a> The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).</li><li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse+by+presynaptic+delayed+rectifier+potassium+current.">Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current.</a> The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).</li><li>Llin&#225;s, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraterminal+injection+of+synapsin+I+or+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+alters+neurotransmitter+release+at+the+squid+giant+synapse.">Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).</li><li>Formento, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+spinal+cord+stimulation+must+preserve+proprioception+to+enable+locomotion+in+humans+with+spinal+cord+injury.">Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).</li><li>Hari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+facilitates+spike+propagation+through+branch+points+of+sensory+axons+in+the+spinal+cord.">GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+oblique+spinal+cord+slices+for+ventral+root+stimulation.">The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).</li><li>Sharples, S. A., Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+persistent+and+hyperpolarization-activated+inward+currents+shapes+the+differential+activation+of+motoneuron+subtypes+during+postnatal+development.">Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development.</a> Elife. 10, e71385 (2021).</li><li>Bhumbra, G. S., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+between+motoneurones+propagates+across+segments+and+is+purely+glutamatergic.">Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic.</a> PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, 04046 (2014).</li><li>Tahir, R. A., Pabaney, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+hypothermia+and+ischemic+stroke:+A+literature+review.">Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review.</a> Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+intractable+pain+in+patients+with+implanted+spinal+cord+stimulation+devices+during+the+COVID-19+pandemic+using+a+remote+and+wireless+programming+system.">Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).</li><li>Yao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+epidural+electrical+stimulation+in+combination+with+serotonin+agonists+improves+intraspinal+metabolism+in+spinal+cord+injury+rats.">Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats.</a> Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).</li><li>Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+terminal+polarization+induced+by+weak+uniform+dc+electric+fields:+a+modeling+study.">Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study.</a> 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).</li><li>Espino, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(V)1.1+is+essential+for+proprioceptive+signaling+and+motor+behaviors.">Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors.</a> Elife. 11, e79917 (2022).</li><li>Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+rheostat:+Kv2.1+currents+maintain+or+suppress+repetitive+firing+in+motoneurons.">A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons.</a> The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+R-type+human+Ca(v)2.3+channel+reveal+conformational+crosstalk+of+the+intracellular+segments.">Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments.</a> Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).</li><li>Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+multimodal+neural+transmission+suggests+that+adult+spinal+networks+maintain+an+intrinsic+state+of+readiness+to+execute+sensorimotor+behaviors.">Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors.</a> Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).</li><li>Manuel, M., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intracellular+recording+of+a+lumbar+motoneuron+and+the+force+produced+by+its+motor+unit+in+the+adult+mouse+in+vivo.">Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).</li><li>Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonhomogeneous+volume+conduction+effects+affecting+needle+electromyography:+an+analytical+and+simulation+study.">Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study.</a> Physiological Measurement. 42 (11), (2021).</li><li>Barra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidural+electrical+stimulation+of+the+cervical+dorsal+roots+restores+voluntary+upper+limb+control+in+paralyzed+monkeys.">Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys.</a> Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).</li><li>Powell, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidural+stimulation+of+the+cervical+spinal+cord+for+post-stroke+upper-limb+paresis.">Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis.</a> Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).</li><li>Wenger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+neuromodulation+therapies+engaging+muscle+synergies+improve+motor+control+after+spinal+cord+injury.">Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).</li><li>&#214;zyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+longitudinal+lumbar+spinal+cord+preparations+to+study+sensory+and+recurrent+motor+microcircuits+of+juvenile+mice.">In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice.</a> Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).</li><li>Moraud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+the+neuromodulation+of+spinal+circuits+for+correcting+gait+and+balance+deficits+after+spinal+cord+injury.">Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury.</a> Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).</li><li>Capogrosso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+model+for+epidural+electrical+stimulation+of+spinal+sensorimotor+circuits.">A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits.</a> Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).</li></ol>

Информация о движении, модулированная СКС, наконец, конвергентна к двигательным нейронам. Таким образом, использование двигательных нейронов в качестве объекта исследования может упростить дизайн исследования и более непосредственно раскрыть механизм нейромодуляции СКС. Для одновр?...

Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Andreas Rowald et al. сообщили, что SCS обеспечивает функцию опорно-двигательного аппарата и туловища нижних конечностей в течение одного дня1. Изучение биологического механизма СКС для восстановления опорно-двигательного аппарата является важной и актуальной областью исследований для разработки более точной стратегии СКС. Например, команда Грегуара Куртина продемонстрировала, что возбуждающий интернейрон Vsx2 и нейроны Hoxa10 в спинном мозге являются ключевыми нейронами для ответа на SCS, а клеточно-специфическая нейромодуляция возможна для восстановления способности крыс ходить после ТСМ2. Тем не менее, лишь немногие исследования сосредоточены на электрическом механизме СКС в масштабе одной клетки. Хотя хорошо известно, что надпороговый стимул постоянным током может вызывать потенциалы действия (ОП) в классическом эксперименте с кальмарами 3,4,5, до сих пор неясно, как импульсная переменная электрическая стимуляция, такая как СКС, влияет на генерацию двигательного сигнала.
Учитывая сложность интраспинальных нейронных цепей, для исследования электрического механизма СКС важен соответствующий отбор клеточной популяции. Несмотря на то, что СКС восстанавливает двигательную функцию, активируя проприоцептивный путь6, двигательные нейроны являются последней единицей для выполнения двигательной команды, полученной путем интеграции афферентного входа7 проприоцептивной информации. Таким образом, непосредственное изучение электрических характеристик двигательных нейронов с помощью СКС может помочь нам понять логику, лежащую в основе спинальной моторной модуляции.
Как известно, патч-клам является золотым стандартом клеточной электрофизиологической регистрации с чрезвычайно высоким пространственно-временным разрешением8. Поэтому в данной работе описан метод с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на СКС. По сравнению с головным мозгом, патч-зажим9 является более сложным по следующим причинам: (1) Спинной мозг защищен позвоночным каналом с крошечным объемом, который требует очень тонких микроманипуляций и строгого ледяного поддержания для достижения лучшей жизнеспособности клеток. (2) Поскольку спинной мозг слишком тонкий, чтобы его можно было закрепить на лотке для резки, его следует погрузить в агарозу с низкой температурой плавления и обрезать после затвердевания.
Таким образом, этот метод дает технические возможности в рассечении спинного мозга и одновременном поддержании жизнеспособности клеток, чтобы плавно изучить электрический механизм СКС на двигательных нейронах и избежать ненужных проб и ошибок.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide tweezers</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>36A-SA</td>
			<td>Clip a slice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12006-10</td>
			<td>Cut the diaphragm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Light Source</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Label the motor neuron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MTI</td>
			<td>IR-1000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument&#160;</td>
			<td>MP-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors&#160;</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>wa1020</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for anatomy</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope for ecletrophysiology</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-toothed tweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11008-09</td>
			<td>Lift the cut vertebral body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens for ecletrophysiology</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>LUMPLFLN60XW</td>
			<td>working distance 2 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer&#160;</td>
			<td>Advanced&#160;</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier&#160;</td>
			<td>Axon&#160;</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp digitizer</td>
			<td>Axon&#160;</td>
			<td>Digidata 1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo&#160;</td>
			<td>FE28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Anchor</td>
			<td>Multichannel system</td>
			<td>SHD-27H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinal cord stimulatior</td>
			<td>PINS</td>
			<td>T901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed tweezer</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F13030-10</td>
			<td>Lift the xiphoid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide band ultraviolet excitation filter</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>U-MF2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo preparation of spinal cord slice for the whole-cell patch-clamp recording in motor neurons during spinal cord stimulation

Стимуляция спинного мозга (СКС) может эффективно восстановить локомоторную функцию после травмы спинного мозга (ТСМ). Поскольку двигательные нейроны являются конечной единицей для выполнения сенсомоторного поведения, непосредственное изучение электрических реакций двигательных нейронов с помощью SCS может помочь нам понять логику, лежащую в основе спинномозговой моторной модуляции. Для одновременной регистрации различных характеристик стимулов и клеточных реакций патч-зажим является хорошим методом изучения электрофизиологических характеристик в масштабе одной клетки. Тем не менее, все еще существуют некоторые сложные трудности в достижении этой цели, включая поддержание жизнеспособности клеток, быстрое отделение спинного мозга от костной структуры и использование SCS для успешного индуцирования потенциалов действия. В данной работе мы представляем подробный протокол с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на СКС с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователю улучшить свои навыки по разделению спинного мозга и поддержанию жизнеспособности клеток, чтобы беспрепятственно изучить электрический механизм СКС на двигательном нейроне и избежать ненужных проб и ошибок.

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Andreas Rowald et al. reported that SCS enables lower limb locomotor and trunk function within a single day1. Exploring the biological mechanism of SCS for locomotor recovery is a critical and trending research field for developing a more precise SCS strategy. For example, Gr&#233;goire Courtine&#39;s team demonstrated that excitatory Vsx2 interneuron and Hoxa10 neurons in the spinal cord are the key neurons to response to SCS, and cell-specific neuromodulation is feasible to restore the rat walking ability after SCI2. However, few studies focus on the electrical mechanism of SCS at a single-cell scale. Although it is well-known that the suprathreshold direct current stimulus can elicit the action potentials (APs) in the classic squid experiment3,4,5, how the pulsed alternating electrical stimulation, such as SCS, affects the motor signal generation is still unclear.
Given the complexity of intraspinal neural circuits, appropriate selection for cell population is important for investigating the electrical mechanism of SCS. Although SCS restores motor function by activating the proprioceptive pathway6, the motor neurons are the final unit to execute the motor command, derived from integrating proprioception information afferent input7. Therefore, directly studying the electrical characteristics of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation.
As we know, patch-clamp is the golden-standard method for cellularly electrophysiological recording with extremely high spatiotemporal resolution8. Therefore, this study describes a method using a patch clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS. Compared with the brain patch-clamp9, the spinal cord patch-clamp is more difficult due to the following reasons: (1) The spinal cord is protected by the vertebral canal with tiny volume, which requires very fine micromanipulation and rigorous ice-cold maintenance to obtain better cell viability. (2) Because the spinal cord is too slender to be secured on the cutting tray, it should be immersed in low-melting point agarose and trimmed after solidification.
Hence, this method provides technical details in dissecting the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time so as to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neurons and avoid unnecessary trials and mistakes.

В центре внимания автора: Совершенствование стимуляции спинного мозга - изучение клеточных реакций моторных нейронов с помощью электрофизиологии патч-хомута 

Подготовка ex vivo среза спинного мозга для регистрации цельноклеточного патча-зажима в двигательных нейронах при стимуляции спинного мозга

Spinal cord stimulation can help patients resolve most motion functions after injury. Most neurons are to execute sensory mode behaviors. Studying the electric response of most neurons can aid in understanding the underlying logic of spinal load neuromodulation.A patch clamp is the golden standard method for cellular electrophysiological recordings with the extremely high spatial temporal resolution. Therefore, this study describes a method using a patch clamp to simultaneously record the aortas stimulus characteristics and cellular responses of motor neurons at a single-cell scale. Compared with the brain patch clamp, the spinal cord patch clamp is more difficult, because the spinal cord is well protected by the vertebral canal with tiny volume.Therefore, this protocol provides technical details in quickly micro dissecting the spinal cord and reverse maintenance to obtain better cell viability. Patch clamp allows a unique understanding of the synaptic transmissions and the understanding of action potentials, coding pattern activities by the spinal cord stimulation.

Благодаря строгому низкотемпературному поддержанию во время тонкой работы (дополнительный рисунок 1, дополнительный рисунок 2 и рисунок 1) жизнеспособность ячейки была достаточно хорошей, чтобы выполнять последующие электрофизиологические записи. Чтобы макс?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the Cellular Responses of Motor Neurons Through Patch-Clamp Electrophysiology at JoVE.com

Этот протокол описывает метод с использованием патч-зажима для изучения электрических реакций двигательных нейронов на стимуляцию спинного мозга (SCS) с высоким пространственно-временным разрешением, который может помочь исследователям улучшить свои навыки в разделении спинного мозга и поддержании жизнеспособности клеток одновременно.

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

Стимуляция спинного мозга может помочь пациентам решить большинство двигательных функций после травмы. Большинство нейронов отвечают за сенсорное поведение. Изучение электрической реакции большинства нейронов может помочь понять логику, лежащую в основе нейромодуляции спинальной нагрузки.Патч-зажим является золотым стандартом клеточных электрофизиологических записей с чрезвычайно высоким пространственным временным разрешением. Таким образом, в данном исследовании описывается метод с использованием патч-зажима для одновременной регистрации характеристик стимула аорты и клеточных ответов двигательных нейронов в масштабе одной клетки. По сравнению с зажимом для головного мозга, зажим для спинного мозга сложнее, потому что спинной мозг хорошо защищен позвоночным каналом с крошечным объемом.Таким образом, этот протокол предоставляет технические детали для быстрого микропрепарирования спинного мозга и обратного обслуживания для получения лучшей жизнеспособности клеток. Патч-зажим позволяет уникально понимать синаптические передачи и понимать потенциалы действия, кодирующие паттерны активности при стимуляции спинного мозга.

the-ex-vivo-preparation-spinal-cord-slice-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

Spinal Cord Dissection for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons

After exposing the heart of an anesthetized rat, cut the right atrium using fine scissors and inject 100 milliliters of chilled perfusing fluid at approximately two milliliters per second within one minute. Position the rat in the prone position. Cut the spine at the anterior superior iliac spine and the curvature shifting point of the thoracic column.Immediately place the isolated spine into the oxygenated ice cold perfusing solution to wash off residual blood and fat tissue. Then transfer the isolated spine to the anatomical tray with its dorsal side up and the rostral end near the operator. Fill the tray with 50 milliliters of continuously oxygenated ice cold cutting solution.Under a dissection microscope, cut the vertebral pedicles on both sides from the rostral end using micro scissors. Next, delicately sever the dura mater along its dorsal midline with micro scissors. Lift the rostral part of the spinal cord carefully and cut the nerve root, leaving about one millimeter reserved.After the spinal cord has been separated from the vertebral canal, secure it with the ventral side facing up using two insect pins. Trim any excessive nerve roots, leaving about one millimeter intact. Then separate the lumbar enlargement to a length of six to seven millimeters using a micro scissor.

Диссекция спинного мозга для записи целоклеточного пластыря в двигательных нейронах

Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons

Подготовка среза спинного мозга для записи целоклеточного пластыря в двигательных нейронах  

After dissecting the spinal cord and separating the lumbar enlargement, place the lumbar enlargement on a 35 degree slope with the dorsal side up and the caudal side down. Absorb any excess water on the tissue surface using an absorbent filter paper. Carefully pour the molten agarose gel into the Petri dish containing the lumbar enlargement.Position the Petri dish in the ice water mixture to ensure rapid gel cooling. Shape the gel into a cube of 15 by 10 by 10 millimeters, and mount it onto the specimen disc using super glue. Adjust the vibratome settings to a thickness of 350 micrometers, a speed of 0.14 to 0.16 millimeters per second, an amplitude of one millimeter, and a vibration frequency of 85 hertz.Now, use the cover slide tweezers to clip a slice and place it into the incubation chamber, filled with continuously oxygenated artificial cerebrospinal fluid.

Подготовка среза спинного мозга для записи целоклеточного пластыря в двигательных нейронах

Patch-Clamp Recording to Study the Electrical Responses of Motor Neurons to Spinal Cord Stimulation

Патч-Clamp Recording для изучения электрических реакций моторных нейронов на стимуляцию спинного мозга  

To begin, place the prepared spinal cord slice in the recording chamber. Then place the anode of the micro-manipulation system near the dorsal midline in the cathode close to the dorsal root entry zone for proper spinal cord stimulator positioning. Now switch to a 60X objective lens to identify a healthy neuron having a smooth and bright surface without visible nuclei.Slightly decrease the infrared intensity, turn on the fluorescent light source, and adjust the light filter to the wideband ultraviolet excitation option. Now, select an appropriate Fluoro-Gold-positive motor neuron and gradually lower the electrode until it is near the neuron. As the pipette contacts its surface, look for a small membrane indentation at the tip level and release the previously-applied positive pressure.Then apply negative pressure to the pipette using a syringe and wait until the resistance value rises to gigaohms on the software interface. Clamp the membrane potential at minus 70 millivolts. Press the fast capacitance compensation button on the amplifier's software interface, then apply a brief negative pressure to rupture the cell membrane and press the slow capacitance compensation button on the amplifier's software interface.Apply the spinal cord stimulation for one to two seconds keeping the amplitude between one and 10 milliamperes. Determine the motor threshold by gradually increasing the stimulation amplitude until the first action potential is observed. Distinguish delayed and immediate firing motor neurons using a five-second depolarizing current injection around rheobase in the current clamp mode.After turning off the spinal cord stimulation, continue recording the membrane potentials to capture the spontaneous action potentials firing. When the amplitude of spinal cord stimulation was raised, the membrane potential was increased, and the action potentials were triggered every 10 to 20 pulses. After the spinal cord stimulation was turned off, the neuron fired a series of spontaneous action potentials for a short period of time.Then, the resting membrane potential returned to minus 65 millivolts.