Name: Unveiling the Potential of VSFG Microscopy in Studying Mesoscopically Heterogeneous Self-Assembled Structures (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-12-01T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Potential of VSFG Microscopy in Studying Mesoscopically Heterogeneous Self-Assembled Structures at JoVE.com

Lo sviluppo dello strumento è supportato dal Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW e WX sono supportati dal National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. BY è sostenuto dall'Associazione per la promozione dell'innovazione giovanile, Accademia cinese delle scienze (CAS, 2021183).

1. Microscopio VSFG a scansione lineare iperspettrale
<ol><li>Sistema laser<ol><li>Utilizzare un sistema laser pulsato (vedi Tabella dei materiali) centrato a 1025 nm ± 5 nm. Il laser è impostato a 40 W, 200 kHz (200 μJ/impulso) con un'ampiezza di impulso di ~290 fs. NOTA: L'esatta frequenza di ripetizione può variare e un laser ad alta frequenza di ripetizione generalmente funziona meglio per questo microscopio VSFG.</li>
		<li>Guidare l'uscita del laser a semina in un amplificatore parametrico...

Using a VSFG Microscope for Multimodal, Rapid, Hyperspectral Chemical Analysis

I passaggi più critici vanno da 1,42 a 1,44. È fondamentale allineare bene la lente dell'obiettivo per una risoluzione spaziale ottica. È anche importante raccogliere il segnale emesso, il relè e proiettare il raggio di scansione come una linea nelle fessure di ingresso. Allineamenti corretti garantirebbero la migliore risoluzione e il miglior rapporto segnale/rumore. Per un campione tipico, come i fogli SDS@2 β-CD da 100 μm per 100 μm, un'immagine a buona risoluzione (risoluzione ~1 μm) con un elevato rapporto s...

La generazione di somma-frequenza vibrazionale (VSFG), una tecnica ottica non lineare del secondo ordine 1,2, è stata ampiamente utilizzata come strumento di spettroscopia per profilare chimicamente campioni simmetriciconsentiti 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradizionalmente, il VSFG è stato applicato ai sistemi interfacciali 8,9,10,11 (cioè gas-liquido, liquido-liquido, gas-solido, solido-liquido), che mancano di simmetria di inversione - un requisito per l'attività VSFG. Questa applicazione di VSFG ha fornito una vasta gamma di dettagli molecolari delle interfacce sepolte 12,13, delle configurazioni delle molecole d'acqua alle interfacce 14,15,16,17,18 e delle specie chimiche alle interfacce 19,20,21,22.
Sebbene il VSFG sia stato potente nel determinare le specie molecolari e le configurazioni alle interfacce, il suo potenziale nella misurazione delle strutture molecolari di materiali privi di centri di inversione non è stato realizzato. Ciò è in parte dovuto al fatto che i materiali potrebbero essere eterogenei nel loro ambiente chimico, nelle composizioni e nella disposizione geometrica, e uno spettrometro VSFG tradizionale ha un'ampia area di illuminazione dell'ordine di 100 μm2. Pertanto, la spettroscopia VSFG tradizionale riporta informazioni mediate dall'ensemble del campione su una tipica area di illuminazione di 100 μm2. Questa media d'insieme può portare a cancellazioni di segnale tra domini ben ordinati con orientamenti opposti e a un'errata caratterizzazione delle eterogeneità locali 15,20,23,24.
Con i progressi negli obiettivi per microscopi ad alta apertura numerica (NA), basati su riflessione (geometrie di Schwarzschild e Cassegrain), che sono quasi privi di aberrazioni cromatiche, la dimensione del fuoco dei due fasci negli esperimenti VSFG può essere ridotta da 100 μm 2 a 1-2 μm2 e in alcuni casi submicron25. Compreso questo progresso tecnologico, il nostro gruppo e altri hanno sviluppato VSFG in una piattaforma di microscopia 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recentemente, abbiamo implementato un layout ottico invertito e uno schema di rilevamento a banda larga37, che consente una raccolta senza soluzione di continuità di immagini multimodali (VSFG, generazione di seconda armonica (SHG) e ottica in campo chiaro). L'imaging multimodale consente una rapida ispezione dei campioni utilizzando l'imaging ottico, correlando tra loro vari tipi di immagini e localizzando le posizioni del segnale sulle immagini del campione. Con l'ottica di illuminazione acromatica e la scelta della sorgente di illuminazione laser pulsata, questa piattaforma ottica consente in futuro l'integrazione senza soluzione di continuità di tecniche aggiuntive come la microscopia a fluorescenza38 e la microscopia Raman, tra le altre.
In questa nuova disposizione, sono stati studiati campioni come le organizzazioni gerarchiche e una classe di auto-assemblaggi molecolari (MSA). Questi materiali includono il collagene e la biomimetica, in cui sia la composizione chimica che l'organizzazione geometrica sono importanti per la funzione finale del materiale. Poiché VSFG è un segnale ottico non lineare del secondo ordine, è specificamente sensibile alle disposizioni intermolecolari39,40, come la distanza intermolecolare o gli angoli di torsione, il che lo rende uno strumento ideale per rivelare sia le composizioni chimiche che le disposizioni molecolari. Questo lavoro descrive le modalità VSFG, SHG e campo chiaro dello strumento principale costituito da un laser a stato solido a cavità drogato con itterbio che pompa un amplificatore parametrico ottico (OPA), un microscopio invertito multimodale costruito in casa e un analizzatore di frequenza monocromatore accoppiato a un rivelatore bidimensionale ad accoppiamento caricato (CCD)27. Vengono fornite procedure dettagliate di costruzione e allineamento e un elenco completo delle parti della configurazione. Un'analisi approfondita di un MSA, la cui subunità molecolare fondamentale è costituita da una molecola di sodio-dodecilsolfato (SDS), un tensioattivo comune, e due molecole di β-ciclodestrina (β-CD), nota come SDS@2 β-CD, viene fornita anche come esempio per mostrare come VSFG può rivelare dettagli geometrici specifici della molecola della materia organizzata. È stato inoltre dimostrato che i dettagli geometrici chimicamente specifici dell'MSA possono essere determinati con un approccio risolutore di funzioni di rete neurale.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Camera Por</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WFA4100</td>
			<td>connect a camera to a microscope or optical system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MRA25-M01</td>
			<td>reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8221; Universal Post Holder-5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>UPH3-P5</td>
			<td>hold and support posts of various sizes and configurations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP4S</td>
			<td>convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CEA1500</td>
			<td>provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Cage Mounted &#216;50.0 mm Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP50S</td>
			<td>control the amount of light passing through an optical system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Cage Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP01B</td>
			<td>mount and position a 60 mm cage system in optical setups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air spaced Etalon</td>
			<td>SLS Optics Ltd.</td>
			<td>Customized</td>
			<td>generate narrow-band 1030 nm light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Plate Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB2</td>
			<td>hold and adjust mirrors at a precise angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>Newton&#160;</td>
			<td>2D CCD for frequency and spatial resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collinear Optical Parametric Amplifier</td>
			<td>Light Conversion</td>
			<td>Orpheus-One-HP</td>
			<td>Tunable MID light generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Chloride</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>A16064.30</td>
			<td>Self-assembly component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized Dichroic Mirror</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Customized</td>
			<td>selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ext to M32 Int Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A34</td>
			<td>provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity Corrected Refractive Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420150-9900-000</td>
			<td>Refractive Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinity Corrected Schwarzschild Objective</td>
			<td>Pike Technologies Inc.</td>
			<td>891-0007</td>
			<td>Reflective objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Carbide, Light-Conversion</td>
			<td>C18212</td>
			<td>Laser source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M32x0.75 External to Internal RMS</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M32RMSS</td>
			<td>adapt or convert the threading size or type of microscope objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M32M27S</td>
			<td>adapt or convert the threading size or type of microscope objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Mid-Height Condenser Focus Module</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ZFM1030</td>
			<td>adjust the focus of an optical element</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>Shamrock 500i</td>
			<td>Provides frequency resolution for each line scan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized module with 1&#34; Travel for Edge-Mounted Arms</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ZFM2020</td>
			<td>control the vertical positon of the imaging objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopositioner</td>
			<td>Mad City Labs Inc.</td>
			<td>MMP3</td>
			<td>3D sample stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant Scanner</td>
			<td>EOPC</td>
			<td>SC-25</td>
			<td>325Hz resonant beam scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGB Color CCD Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCU224C</td>
			<td>Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGB tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ITL200</td>
			<td>white light collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Angle Kinematic Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>OPX2400</td>
			<td>incorporate a sliding mechanism with two fixed positions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB1</td>
			<td>hold and adjust mirrors at a precise angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB2</td>
			<td>hold and adjust mirrors at a precise angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CSA2100</td>
			<td>securely mount and position condensers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long,</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C60L24</td>
			<td>enclose and protect the components inside the cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>J63394.AK</td>
			<td>Self-assembly component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1&#34; Cerna Travel Stages</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MCM3001</td>
			<td>control ZFM2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1380-AB - N-BK7</td>
			<td>SFG signal collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visible LED Set</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WFA1010</td>
			<td>provide illumination in imaging setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitelight Source</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WFA1010</td>
			<td>Whitelight illumination source for brightfield imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPH05M-1030 - &#216;1/2&#34; Zero-Order Half-Wave Plate, &#216;1&#34; Mount, 1030 nm&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH05M-1030</td>
			<td>alter the polarization state of light passing through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPLQ05M-3500 - &#216;1/2&#34; Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 &#181;m&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPLQ05M-3500</td>
			<td>alter the polarization state of light passing through it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages</td>
			<td>Optosigma</td>
			<td>TSD-65122CUU</td>
			<td>positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XT95 4in Rail Carrier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XT95RC4</td>
			<td>mount and position optical components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XYR1</td>
			<td>precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY(1/2&#34;) Linear Translator with Central SM1 Thru Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XYT1</td>
			<td>provide precise movement and positioning in two dimensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yb doped Solid State Laser</td>
			<td>Light Conversion</td>
			<td>CB3-40W</td>
			<td>Seed laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Cyclodextrin</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>J63161.22</td>
			<td>Self-assembly component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal nonlinear hyperspectral chemical imaging using line-scanning vibrational sum-frequency generation microscopy

La generazione di somma-frequenza vibrazionale (VSFG), un segnale ottico non lineare del secondo ordine, è stata tradizionalmente utilizzata per studiare le molecole alle interfacce come tecnica di spettroscopia con una risoluzione spaziale di ~100 μm. Tuttavia, la spettroscopia non è sensibile all'eterogeneità di un campione. Per studiare campioni mesoscopicamente eterogenei, noi, insieme ad altri, abbiamo spinto il limite di risoluzione della spettroscopia VSFG fino al livello di ~1 μm e abbiamo costruito il microscopio VSFG. Questa tecnica di imaging non solo è in grado di risolvere le morfologie del campione attraverso l'imaging, ma anche di registrare uno spettro VSFG a banda larga in ogni pixel delle immagini. Essendo una tecnica ottica non lineare del secondo ordine, la sua regola di selezione consente la visualizzazione di strutture autoassemblate non centrosimmetriche o chirali che si trovano comunemente in biologia, scienza dei materiali e bioingegneria, tra gli altri. In questo articolo, il pubblico sarà guidato attraverso un design di trasmissione invertita che consente l'imaging di campioni non fissi. Questo lavoro mostra anche che la microscopia VSFG può risolvere informazioni geometriche specifiche per la chimica di singoli fogli autoassemblati combinandola con un risolutore di funzioni di rete neurale. Infine, le immagini ottenute in configurazioni in campo chiaro, SHG e VSFG di vari campioni discutono brevemente le informazioni uniche rivelate dall'imaging VSFG.

Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig05.jpg"> Figura 5: Struttura molecolare, morfologia e orientamento potenziale di SDS@β-CD. (A) Vista dall'alto e (B) vista laterale struttura chimica di SDS@β-CD. (C) Distribuzione rappresentativa del campione eterogeneo dei fogli a mesoscala sul piano del campione. La subunità molecolare potrebbe avere d...

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Unveiling the Potential of VSFG Microscopy in Studying Mesoscopically Heterogeneous Self-Assembled Structures (Video) | JoVE

È stato sviluppato un quadro di imaging iperspettrale rapido e multimodale per ottenere immagini di generazione di somma e frequenza vibrazionale a banda larga (VSFG), insieme a modalità di imaging in campo chiaro, generazione di seconda armonica (SHG). A causa della risonanza della frequenza infrarossa con le vibrazioni molecolari, viene rivelata la conoscenza della morfologia strutturale e mesoscopica microscopica dei campioni consentiti dalla simmetria.

Imaging chimico iperspettrale non lineare multimodale mediante microscopia a scansione lineare con generazione di somma-frequenza vibrazionale

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), a second-order nonlinear optical signal, has traditionally been used to study molecules at interfaces as a ...

Il nostro obiettivo è quello di studiare campioni autoassemblati mesoscopicamente eterogenei, come i tessuti biologici, per rivelarne la composizione chimica e le disposizioni molecolari. Stiamo esplorando come la disposizione microscopica e la morfologia mesoscopica di questi materiali self si relazionano con le loro proprietà microscopiche. Con i progressi nell'alta apertura numerica e negli obiettivi del microscopio riflettente, noi e altri abbiamo dimostrato un microscopio per la generazione di somma-frequenza vibrazionale con una risoluzione di un micron quadrato, in grado di registrare simultaneamente immagini di materiali morbidi e anche di risolvere spazialmente lo spettro, formando le cosiddette immagini iperspettrali.L'imaging iperspettrale registra i dati sperimentali in più dimensioni, due negli spazi, uno in frequenza e possibilmente uno nel tempo. Tuttavia, la raccolta, l'archiviazione e l'analisi rapide di tali big data per massimizzare le informazioni rimangono una sfida. Anche il campionamento dell'immagine solo per raccogliere dati utili è impegnativo.Sviluppando una tecnologia di scansione lineare più veloce, abbiamo potuto accelerare il tempo di acquisizione dei dati di 100 volte. Inoltre, il microscopio è compatibile con la generazione di frequenza sommaria o SFG, la generazione di seconda armonica o SHG, nonché l'imaging ad ampio campo. L'imaging multimodale consente una rapida ispezione dei campioni utilizzando l'imaging ottico e correlando varie modalità di immagine.L'imaging SHG assiste la tecnica ottica della nostra tecnica, ma senza il potere risolutivo spettrale, è ampiamente utilizzato in biofisica. Il nostro microscopio SFG sarà ora in grado di fornire potenti informazioni a livello molecolare che attualmente mancano negli studi biofisici dei tessuti molli.