Name: Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00
Duration: 2 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af tilskud fra National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) og R01 EY006641, R01 EY017863 og R21 EY032597 (JBH).

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol>
	<li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro:+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin.">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li><li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells.">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li><li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP/ADP+in+pancreatic+islets.">Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets.</a> Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).</li><li>Chertov, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+glucose+in+photoreceptor+survival.">Roles of glucose in photoreceptor survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+Can+Shuttle+Reducing+Power+from+the+Hypoxic+Retina+to+the+O2-Rich+Pigment+Epithelium.">Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium.</a> Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+pyruvate+transport+by+zaprinast+causes+massive+accumulation+of+aspartate+at+the+expense+of+glutamate+in+the+retina.">Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).</li><li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+metabolism+in+the+retinal+pigment+epithelium+uncouples+respiration+from+ATP+synthesis.">Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis.</a> Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism.">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, e66716 (2021).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (1995).</li><li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test.">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).</li><li>Engel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+dysfunction+in+Sorsby+patient-derived+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium.</a> Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mitochondrial+Respiration+Impairs+Nutrient+Consumption+and+Metabolite+Transport+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelium.">Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).</li><li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+Metabolism+and+Metabolism+in+the+Pigmented+Epithelium:+A+Busy+Intersection.">Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+activation+and+photoreceptor+survival+in+retinal+detachment.">Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).</li><li>Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+consumption+by+mammalian+rod+photoreceptors+in+darkness+and+in+light.">ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light.</a> Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+of+engineering+retinal+organoids+and+organoid-on-a-chip+in+modeling+intraocular+drug+delivery:+Current+progress+and+future+perspectives.">Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).</li><li>Arjamaa, O., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-dependent+diseases+in+the+retina:+role+of+hypoxia-inducible+factors.">Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors.</a> Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Multi-Channel+Fluidics+System+for+the+Maintenance+and+Real-Time+Metabolic+and+Functional+Assessment+of+Tissue+or+Cells.">A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells.</a> Cell Reports Methods. In Press. , (2023).</li><li>Neal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Low-Level+Drug+Effects+Using+Real-Time,+in+vitro+Measurement+of+Oxygen+Consumption+Rate.">Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate.</a> Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).</li><li>Jung, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cytochrome+C+is+an+essential+regulator+of+sustained+insulin+secretion+by+pancreatic+islets.">Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).</li><li>Rountree, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+insulin+secretion+by+cytochrome+C+and+calcium+signaling+in+islets+with+impaired+metabolism.">Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).</li><li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers.">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li><li>Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+damage+in+retinal+cells+and+tissues+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+mitochondrial+DNA+damage+and+extracellular+flux+assay+for+mitochondrial+respiration+activity.">Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).</li><li>Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+alterations+in+mitochondrial+reserve+capacity;+a+means+to+predict+subsequent+photoreceptor+cell+death.">Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function.">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).</li><li>Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+acid+acutely+inhibits+acetylcholine-+but+not+GLP-1-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+pancreatic+islets.">Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).</li></ol>

I.R.S., M.G. og K.B. har økonomiske bånd til EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), producenten/distributøren af BaroFuse perifusionssystemet beskrevet i denne undersøgelse. Alle de øvrige forfattere erklærer ingen interessekonflikter.

På grund af betydningen af bioenergetik i alle aspekter af cellefunktion og vedligeholdelse af forskellige komponenter i øjet er der et kritisk behov for metoder til at studere dets regulering. Især neurale nethinden og RPE afhænger af stofskiftet for både generering af energi samt intra- og intercellulær signalering14,15,16,17. På grund af deres høje oxidative kapacitet er isolerede væv i øjet ikke godt vedligeholdt under statiske forhold18,19, og derfor kræver undersøgelse af isolerede komponenter i øjet flowsystemer, der både kan opretholde og vurdere metaboliske processer. Fluidiksystemet blev udviklet til at generere OCR- og LPR-data fra en lang række vævstyper, og i dette papir præsenterede vi detaljerede protokoller, der viste sig at give optimale resultater.
Den vigtigste determinant for generering af robuste data ved hjælp af flowsystemet omfatter præ-ligevægt af CO2 -baserede medier/buffer ved 39 °C (for at sikre, at perifusat ikke overmættes med opløst gas, der ville afgasses under forsøget). Navnlig vil medier eller KRB-buffere, der opbevares ved 4 °C, være overmættede i forhold til 37 °C og vil afgasses under forsøget, hvis tiden før ligevægt er utilstrækkelig. Derudover må væv, der er indlæst i vævskamrene, ikke traumatiseres ved forkert isolering af væv på grund af rivning eller ufuldstændig adskillelse af væv eller ved at udsætte væv i lav mængde bicarbonatbaseret buffer for atmosfærisk luft for for længe. Temperaturreguleringen, flowstabiliteten og pålideligheden afO2-detektion har ringe variation, og disse faktorer bidrager ikke væsentligt til fejlfrekvensen.
Instrumentet har otte flowkanaler/vævskamre, der løber samtidigt, som forsynes med perifusat fra to reservoirer, fire vævskamre for hvert reservoir. For at få de mest nøjagtige tidsforløb af OCR korrigeres kinetiske kurver ved baseline af kamre, der ikke er fyldt med væv. Således ville en typisk eksperimentel protokol involvere to grupper af tre vævskamre. Protokoller falder generelt i to kategorier: den ene er de forskellige testblandingsprotokoller på hver side (f.eks. narkotika / køretøj på den ene side af MRM og kun køretøj på den anden); den anden er samme testforbindelsesinjektionsprotokol på begge sider af MRM, men forskellig vævs- eller vævsmodel på hver side af MRM. I dette papir blev virkningerne af oligomycin og FCCP på nethinden sammenlignet med OCR af væv, der ikke blev udsat for nogen testforbindelser, og to væv blev samtidig vurderet under samme protokol og betingelser for at identificere vævsspecifik adfærd. Sidstnævnte blev illustreret i denne undersøgelse ved at vise øget dynamisk område af metabolisk hastighed ved RPE-choroid-sclera i forhold til nethinden parallelt i samme eksperiment. Andre rapporter har beskrevet en bredere vifte af undersøgelsesdesign, herunder måling af virkningerne varierendeO2-niveauer på OCR og LPR og koncentrationsafhængigheder af brændstoffer, lægemidler og toksiner20,21. Derudover, selvom vi har begrænset analysen af udstrømningsfraktioner til måling af lactat og beregning af LPR, øges informationsindholdet i et eksperiment kraftigt, hvis flere forbindelser og klasser af forbindelser i udstrømningsfraktionerne analyseres, såsom hormoner, neurotransmittere, cellesignaler og metabolitter, der kan forlade cellerne20,22, 23.
Indlæsningen af isoleret nethinden eller RPE-choroid-sclera er ligetil, og når de er isoleret, placeres disse væv simpelthen i toppen af vævskamrene med tang og får lov til at synke ned til fritten. RPE-celler dyrket på filterindsatser udvikler passende polarisering og markører for RPE-modenhed efter 4-8 uger i kultur. Det er ikke muligt at fjerne RPE til levende celleanalyse, når den først er fastgjort til transwellmembranen, hvis RPE-modenhed og polarisering skal opretholdes24. Perifusionskammeret kan rumme strimler af transwellmembranen, der skæres med en skalpel, mens den er nedsænket i buffer og hurtigt indsættes i vævskamrene. Selv om skæring af filterstrimler er blevet anbragt i et statisk system24, findes der ingen anden fluidikmetode til vurdering af disse vigtige celletyper. Reaktionerne fra RPE-celler var hurtige og mere dynamiske end enten nethinden eller RPE-choroid-sclera, sandsynligvis delvis på grund af øjeblikkelig adgang til både de apikale og basale aspekter af RPE-cellerne konfigureret som et monolag på membranindsatsen.
En anden faktor til sikring af, at data har det højeste signal til støj, er at vælge det optimale forhold mellem væv, der er indlæst i perifusionskamrene i forhold til strømningshastigheden. For lidt væv i forhold til strømningshastigheden resulterer i en forskel i opløstO2-koncentration mellem tilstrømning og udstrømning, der er meget lille og vanskelig at måle pålideligt. I modsætning hertil, hvis strømmen er for langsom, bliver koncentrationen afO2 så lav, at vævet påvirkes af hypoxi. Ikke desto mindre kan den gastrykdrevne væskestrøm opretholdes ved strømningshastigheder ned til 5 ml / min, hvilket kun kræver små mængder væv til nøjagtige OCR- og LPR-målinger. I de her viste eksperimenter blev der brugt ca. 20 ml / min / kanal, som var egnet til enten en nethinde, to RPE-choroid-scleras eller 360.000 RPE-celler. For at minimere systemeffekterne, der forsinker og spreder vævets eksponering for den injicerede testforbindelse, leveres flere størrelser af vævskamrene, således at mængden af væv (og strømningshastighed) matches med kammerets passende størrelse.
Data fra analyserne vist i denne artikel var repræsenteret på to måder: absolut størrelsesorden med hensyn til hastighed eller fraktionelle ændringer i forhold til en steady-state eller baseline. Fokus var på illustration af måling af respons på teststoffer. Imidlertid er fluidiksystemet velegnet til at vurdere og sammenligne effekter af vævsbehandling forud for perifusionsanalysen, såsom genetiske modifikationer. Testning af, om en behandling er forskellig fra kontrol, er mest robust, hvis virkningerne af behandlingen på normaliserede responser af testforbindelser analyseres. Hvis analysen kræver absolutte størrelser, maksimeres den statistiske styrke af analyserne af prøver, der forbehandles, hvis deres vurdering og kontrol udføres i samme perifusionseksperiment.
Bortset fra omrøreren leveres alle dele, der kommer i kontakt med væske, af producenten som forbrugsstoffer og er blevet steriliseret. Disse dele bør ikke genbruges, da eksperimenter lejlighedsvis vil gå tabt på grund af ufuldstændig rengøring og forurenede overflader. Systemet i starten af opsætningen er sterilt. Imidlertid tilsættes medier til MRM, og væv lægges i kamrene under ikke-sterile forhold. Vi har målt OCR i systemet, der er samlet med dele, der er sterile, men hvor selve forsøget udføres under ikke-sterile forhold. Det tager cirka 14 timer for bakterier at akkumulere til det punkt, at de har målbar OCR (upublicerede resultater). Hvis der anvendes protokoller, der er mindre end 10 timer eller deromkring, vil akkumulering af bakterier og eventuelle virkninger på grund af disse være ubetydelige.
Mange forskere bruger instrumenter, der er designet til at måle OCR under statisk inkubation af et monolag af celler med en relativt høj gennemstrømning25,26. I modsætning hertil opretholder det fluidikinstrument, vi har testet og beskrevet i dette papir, væv ved at sikre tilstrækkeligO2-levering, hvilket er kritisk for de større diffusionsafstande, der er til stede i vævsprøver. Derudover er det i stand til at indsamle fraktioner, der muliggør vurdering af flere parametre parallelt med OCR, hvilket i høj grad forbedrer evnen til at studere forholdet mellem dem. Endelig kan koncentrationerne af opløst gas (såsomO2 og CO 2) kontrolleres, hvilket øger varigheden af eksperimenter med bicarbonatbaserede medier og buffer, hvilket gør det muligt for brugeren at studere virkningerne af O2. Det skal påpeges, at en begrænsning for begge metoder er manglende evne til at studere udvaskningen af testforbindelser, en funktionalitet, som andre perifusionssystemer har 4,27,28. En anden overvejelse ved bestemmelse af den optimale analysemodalitet er, at fluidiksystemer bruger flere medier og testforbindelser end statiske systemer. Den ekstra udgift minimeres dog med de nuværende fluidiksystemer på grund af de lave strømningshastigheder, som systemet kan bruges.
Overordnet beskrives en detaljeret beskrivelse af protokollerne til udførelse af forsøg med et nyt flow/vurderingsinstrument. Data genereret med nethinden og RPE-choroid-sclera rekapitulerede tidligere resultater opnået med systemer, der er meget vanskeligere at bruge (og ikke let tilgængelige). Det blev også demonstreret, at systemet kan opretholde og vurdere RPE-celler bundet til transwellmembraner, en meget vigtig cellulær model, der ikke tidligere er blevet analyseret med flowsystemer på grund af cellernes skrøbelighed. Hoveddelene af protokollen består af en 75 minutters opsætningstid efterfulgt af en 90 minutters ligevægtsperiode og den eksperimentelle protokol, der gør den velegnet til rutinemæssig brug af laboratorier, der ikke specialiserer sig i drift af fluidiksystemer. Selvom vi fokuserede på at måle vævets akutte respons på teststoffer, er systemet meget velegnet til at sammenligne væv fra forskellige kilder såsom dyremodeller eller cellemodeller, der er blevet genetisk ændret eller gennemgået testbehandlinger / tilstande. Derudover er omfanget af assays, der kan udføres på udstrømningsfraktionerne, vidtrækkende og omfatter metabolitter, cellesignalmolekyler og udskillede hormoner / neurotransmittere samt multikomponentanalyse genereret af massespektrometri på fraktionerne såvel som vævet.

Perifusionssystemer har en lang historie inden for biovidenskab. Især til undersøgelse af sekretorisk funktion af øer er de blevet brugt til at karakterisere kinetikken af insulinsekretion som reaktion på sekretagoger1. Ud over at indsamle udstrømningsfraktioner til efterfølgende analyse af hormoner og metabolitter er der indbygget realtidssensorer, overvejende til påvisning af iltforbrug 2,3,4. Udbredte bestræbelser på bedre at forstå mekanismer, der medierer sygdomme i øjet, har været begrænset af mangel på fysiologisk relevante metoder til vurdering af metabolisk regulering og dysregulering af de forskellige isolerede komponenter i øjet, herunder nethinden, retinal pigmentepitel (RPE)-choroid-sclera og dyrkede RPE-celler. Statiske systemer designet til dyrkede celler er blevet tilpasset væv5, men væv kræver flow for tilstrækkelig iltning. Flowsystemer har haft succes med nøjagtigt og reproducerbart at måle realtidsresponser i iltforbrugshastighed (OCR) ved nethinden og RPE-choroid-sclera, og vævene forbliver metabolisk stabile i mere end 8 timer, hvilket muliggør meget informative protokoller, der involverer flere testforbindelser 4,6,7,8,9 . Ikke desto mindre har driften af fluidiksystemer historisk krævet et specialfremstillet apparat og uddannet teknisk personale i ikke-standardiserede metoder. Sådanne systemer er ikke blevet vedtaget som standardmetode i de fleste laboratorier. BaroFuse er et nyudviklet fluidiksystem, der ikke er afhængig af pumper, men snarere af gastryk for at drive flow gennem flere kanaler og vævskamre (figur 1). Hver kanal overvåges kontinuerligt for OCR, og udstrømningen opsamles med en pladebaseret fraktionssamler til efterfølgende analyse af indholdet. Det er vigtigt, at vævsperifusionskamrene til instrumentet er designet til at rumme væv af forskellige geometrier og størrelser.
Hjertet i instrumentet er fluidiksystemet, hvor strømmen drives fra et forseglet, trykreservoir gennem små slanger med indre diameter (ID) (der bidrager med den mest betydningsfulde strømningsmodstand i væskekredsløbet) op i glasvævskamrene, der huser vævet. Trykket til mediebeholdermodulet (MRM) leveres af lavtryks- og højtryksregulatorer, der er forbundet til en gasflaske, der indeholder en blanding af gasser (typisk 21%O2, 5% CO 2, balance N2), og reservoiret forsegles ovenfra af perifusionskammermodulet (PCM), der holder vævskammersamlingerne (TCA'er). Strømningshastigheden styres af modstandsrørenes længde og ID og trykindstillingen for en lavtryksregulator. Udstrømningsrør, der er forbundet til toppen af vævskamre, leverer væske til enten en affaldsbeholder (der kontinuerligt vejes til automatisk bestemmelse af strømningshastighed) eller i brønde på en 96-brøndplade, der styres af fraktionsopsamleren. O2-detekteringssystemet måler levetiden for etO2-følsomt farvestof, der er malet på indersiden af hvert af glasvævskamrene nedstrøms for vævet. Disse oplysninger bruges derefter til løbende at beregne OCR. Hele fluidiksystemet befinder sig i et temperaturstyret kabinet, og gastanken, fraktionsopsamleren og computeren er instrumentets hovedkomponenter (figur 2A). Endelig tjener software, der kører instrumentet, til at kontrollere dets funktion (herunder forberedelse og timing af injicerede testforbindelser, flowmålingssystem og brøkkollektortiming) samt behandling og graftegning af OCR-data og andre supplerende målinger.
I dette papir beskriver vi protokollerne for brug af fluidiksystemet til perifuse og vurdere OCR og laktatproduktionshastighed (LPR) for forskellige isolerede komponenter i øjet. LPR er en parameter, der afspejler glykolytisk hastighed, der er meget komplementær til OCR, hvor parret tegner sig for de to hovedgrene af energigenerering fra kulhydrater i cellen10. Da forberedelse af vævet og indlæsning af det i vævskamrene bedst læres ved at se proceduren, hjælper videoen med at illustrere flere af de kritiske trin, der udføres under opsætning og drift, som ikke let formidles med tekst alene.
Beskrivelsen af protokollen er opdelt i 8 sektioner, der svarer til forskellige faser af eksperimentet (figur 2B): 1. præeksperimentel forberedelse; 2. forberedelse/ligevægt af perifusattet 3. oprettelse af et instrument 4. vævsligevægt 5. forsøgsprotokol 6. instrumentets nedbrydning 7. databehandling; og 8. analyser af udstrømningsfraktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

Mange in vitro-modeller , der anvendes til at undersøge vævsfunktion og cellebiologi, kræver en strøm af medier for at give tilstrækkelig iltning og optimale cellebetingelser, der kræves for at opretholde funktion og levedygtighed. Til dette formål har vi udviklet et multikanals flowkultursystem til at opretholde væv og celler i kultur og løbende vurdere funktion og levedygtighed ved hjælp af enten in-line sensorer og/eller opsamling af udstrømningsfraktioner. Systemet kombinerer 8-kanals, kontinuerlig optisk sensing af iltforbrugshastigheden med en indbygget fraktionssamler for samtidig at måle produktionshastigheder af metabolitter og hormonsekretion. Selvom det er i stand til at opretholde og vurdere en bred vifte af vævs- og cellemodeller, herunder øer, muskler og hypothalamus, beskriver vi her dets driftsprincipper og de eksperimentelle præparater / protokoller, som vi har brugt til at undersøge bioenergetisk regulering af isoleret musenethinden, musens retinale pigmentepitel (RPE) -choroid-sclera og dyrkede humane RPE-celler. Innovationer i designet af systemet, såsom pumpeløs væskestrøm, har produceret en stærkt forenklet drift af et flerkanals flowsystem. Der vises videoer og billeder, der illustrerer, hvordan man samler, forbereder instrumentet til et eksperiment og indlæser de forskellige væv/cellemodeller i perifusionskamrene. Derudover afgrænses og diskuteres retningslinjer for udvælgelse af betingelser for protokol- og vævsspecifikke eksperimenter, herunder fastsættelse af det korrekte flowforhold mellem hastighed og væv for at opnå konsistente og stabile dyrkningsbetingelser og nøjagtige bestemmelser af forbrug og produktionshastigheder. Kombinationen af optimal vævsvedligeholdelse og realtidsvurdering af flere parametre giver meget informative datasæt, der vil have stor nytte til forskning i øjets fysiologi og lægemiddelopdagelse til behandling af nedsat syn.

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

For at illustrere opløsningen af de data, der blev genereret fra isolerede komponenter i øjet, blev OCR og LPR målt med tre typer væv (nethinden, RPE-choroid-sclera og RPE-celler) efter en almindeligt anvendt protokol (mitokondriestresstest10; Figur 10, figur 11 og figur 12). Mængden af væv, der anvendes til hvert væv, er vist i tabel 1. Data blev behandlet og graferet ved hjælp af softwarepakken, der blev udviklet til fluidiksystemet. Forberedelsen af nethinden og RPE-choroid-sclera er relativt ligetil og tager mindre end 20 minutter for hver vævstype. OCR var konstant i den tid, hvor testpræparaterne blev injiceret, hvilket indikerer vævets stabile sundhed og funktion og understøtter metodens validitet (figur 10). Når vi først er valideret for hver vævstype, har vi ikke fundet det nødvendigt at køre kontroller, hvor der ikke injiceres teststoffer til hvert forsøg. I overensstemmelse med data opnået ved hjælp af mere konventionelle perifusionsmetoder 6,8,13, faldt OCR som respons på oligomycin og øget OCR som reaktion på FCCP. Ændringer i LPR var i modsat retning af dem, der blev observeret for OCR: oligomycin øgede LPR, som derefter faldt (men kun lidt) som reaktion på FCCP (figur 11). For at sammenligne den statistiske signifikans af effekten af hver sekventiel testforbindelse blev t-tests udført (som beregnes automatisk af den software, der følger med instrumentet). Da målet med papiret var at beskrive, hvordan man udfører metoden, var antallet af transporterede replikater ikke altid højt nok til at producere statistisk signifikans. Generelt, når antallet af replikater var 3 eller mere, var virkningerne af FCCP og oligomycin på både OCR og LPR signifikante.
RPE-celler er ikke tidligere blevet analyseret med flowsystemer, men reagerede på samme måde som RPE-choroid-sclera (i overensstemmelse med det synspunkt, at en stor del af OCR skyldes RPE-celler; Figur 11). Disse illustrative eksempler fremhæver systemets evne til at opretholde vævets levedygtighed som afspejlet af stabiliteten af OCR i kontrolkanalerne og det høje signal / støjforhold for ændringer i OCR af den størrelsesorden induceret af oligomycin og FCCP, som var mere end 100 til 1. Derudover kan analyser af udstrømningsfraktioner anvendes til at korrelere optagelseshastigheden eller produktionen af en lang række forbindelser, der udveksles med den ekstracellulære væske, er komplementære til OCR (i dette tilfælde LPR). Disse egenskaber ved instrumentet tillod nøjagtig kvantificering af karakteristiske forskelle i vævsresponser mellem vævstyper udført parallelt. OCR ved RPE-choroid-sclera og RPE-celler er konsekvent mere følsomme over for oligomycin end nethinden (figur 11 og figur 12), selvom varigheden af eksponeringen for FCCP for RPE-choroid-sclera ikke var lang nok til at nå steady state. Et punkt at overveje opstod, når man bruger DMSO som opløsningsmiddel. Ved højere koncentrationer (0,2%) havde DMSO en forbigående effekt på OCR via nethinden (formodentlig reflekterende en effekt af en ændring i osmotisk tryk forårsaget af DMSO's virkning på membranpermeabilitet).
Baseret på antagelsen om, at KCN fuldstændigt hæmmer respiration ved sin direkte virkning på cytokrom c oxidase, er OCR ved afslutningen af KCN-eksponeringen sat til 0, og alle OCR-værdier beregnes ud fra ændringen i forhold til KCN-værdien. OCR kan forekomme uafhængigt af respirationskæden og cytokrom c oxidase. Imidlertid er størrelsen af dette bidrag til den samlede OCR generelt ikke mere end et par procent (data ikke vist), og den forlængede tid, som væv udsættes for KCN, sikrer, at substrater af oxidaser, der ikke er en del af elektrontransportkæden, er blevet udtømt.
Statistisk analyse Enkelte eksperimenter blev vist som angivet i figurerne, men med flere kanaler, der blev gennemsnitlige. Data blev derefter graferet som gennemsnittet ± standardfejlen (SE; beregnet som SD/√n).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> Figur 1. Skematisk oversigt over fluidik/vurderingssystem. Hovedkomponenter omfatter kabinettet, temperaturkontrolelementer, fluidik og vævskammersystemer, regulering af gastryk i hovedrummet over perifusat, fraktionsopsamler / strømningshastighedsovervågning ogO2-detektorer . Forkortelser: MRM = mediereservoirmodul, PCM = perifusionskammermodul, TCA = vævskammersamlinger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> Figur 2. (A) Billede af instrumentets vigtigste komponenter. Hovedkomponenterne består af gastank (trykregulatorer), kabinet, fraktionsopsamler og computer. (B) Eksperimentelt rutediagram, der viser de vigtigste kategorier af trin og den tid, det tager at fuldføre dem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> Figur 3. Udsigt over MRM. MRM vises med en MRM-indsats (venstre) og omrøringsstænger (højre) placeret i bunden af MRM-indsatserne (placeret i hver side af MRM-skillelinjen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> Figur 4. Slangesamling og renseslangesamling i MRM. A) Enhed til testblanding, injektionsrør og renserør, der er fastgjort til porte på MRM'en. (B-C) Injektionsenheden med testblandingen og renseslangen (B) anbringes i rillen foran på prøvelokalet (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> Figur 5. Tænd for MRM-temperaturregulatoren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> Figur 6. Vævskamre og gastank. Placering afO2-detektoren på detektorstativet (som også understøtter MRM og PCM) og placering af båndet omkring PCM's finner, der hjælper med at sikre vævskamrene på plads. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> Figur 7. (A) Høj- og lavtryksregulatorer på gastanken. (B-C) Rens rør. Rens rør gør det muligt for frihøjden i MRM at rense luft og fylde med gas fra forsyningstanken. Billeder, der viser åbent renserør (B) og tæt renserør (C). Testblandingens injektionsenhed forbliver lukket gennem rensningsprocessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> Figur 8. Vævskammer og udstrømningsopsætning. (A) Transwell-membranens dimensioner, efter at den er skåret i tre strimler af samme bredde. (B) Udstrømning af flerrørsstøtte. C) Udstrømning af flerrørsstøtte placeret på prøvelokalets kant med slangeadapterne nær vævskamrene. D) Billede af udstrømningsrør, der er fastgjort til vævskamrene. (E) Luftfoto af kabinettet uden låg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> Figur 9. Injektion af forbindelse i MRM. Injektion af et teststof gennem injektionsporten i MRM ved hjælp af en 5 ml sprøjte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> Figur 10. OCR- og LPR-kurver som reaktion på testforbindelser. OCR og LPR med nethinden isoleret fra mus (1 nethinde/kanal) som reaktion på tilstedeværelse eller fravær (kontrol) af teststoffer som indikeret. Hver kurve er gennemsnittet af 6 replikater fra et enkelt eksperiment (fejlbjælker er SE; p-værdier beregnes ved at udføre parrede t-tests, der sammenligner steady state-værdier for hvert testmiddel med værdierne for det foregående testmiddel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> Figur 11. OCR-kurver. OCR ved RPE-choroid-sclera og retina isoleret fra mus (1 nethinden eller 2 RPE-choroid-sclera/kanal) målt parallelt som reaktion på teststoffer som angivet. Data er gennemsnittet af replikater fra et enkelt eksperiment (n = 2 og 4 for henholdsvis RPE-choroid-sclera og nethinden; p-værdier beregnes ved at udføre parrede t-test, der sammenligner steady state-værdier for hvert testmiddel med værdierne for det foregående testmiddel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> Figur 12. OCR- og LPR-kurver fra RPE-celler. OCR og LPR fra RPE-celler fastgjort til transwellmembraner, der blev skåret i strimler og indlæst i perifusionskamrene. Data er gennemsnittet af replikater fra et enkelt eksperiment (n = 3 med 1,5 membraner/kanal (360.000 celler/kanal); p-værdier beregnes ved at udføre parrede t-test, der sammenligner steady state-værdier for hvert testmiddel med værdierne for det foregående testmiddel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>VÆV/CELLE</td>
			<td>Beløb/kanal</td>
			<td>FLOWHASTIGHED: ml / min</td>
		</tr><tr><td>Nethinden (mus)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-choroid-sclera (mus)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>RPE-celler på Transwell-membraner</td>
			<td>360.000 celler (4 x 1/3 filterstrimler)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1. Anbefalede driftsspecifikationer for forskellige væv.
Supplerende figur 1. Grafisk repræsentation af eksperimentelt design. Tidspunkt for og sammensætning af eksponering for teststoffer og tidspunkt for fraktionsindsamling. Koncentrationsforøgelse (Conc Inc) er den ændring i koncentrationen, der skal implementeres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2. Brugergrænseflade ved opstart. Brugergrænsefladen i opstartsvinduet for O2-detektionssoftwaren, der overvågerO2 i vævskamrene, der er indsat i PCM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 3. Brugergrænseflade til eksperimentindstillinger. Brugergrænseflade til indtastning af eksperimentelle oplysninger (venstre) og valg af tidspunkter for indsamling af udstrømningsfraktioner (højre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 4. Brugergrænseflade på injektionssiden. Injektionsside, der beregner injektionsvolumen baseret på ønskede koncentrationer af teststof og volumen tilbage i MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 1: Metoder til fremstilling af vævsprøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE

Realtidsanalyse af levende væv giver vigtige funktionelle og mekanistiske data. Dette papir beskriver protokoller og kritiske variabler for at sikre nøjagtig og reproducerbar generering af data ved hjælp af et nyt og pumpefrit flerkanals fluidiksystem, der vedligeholder og vurderer en bred vifte af vævs- og cellemodeller.

Vedligeholdelse og vurdering af forskellige vævs- og celletyper i øjet ved hjælp af et nyt pumpeløst fluidiksystem

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

De mest almindelige enheder, der bruges til måling af iltforbrug, understøtter ikke samtidig indsamling af udstrømningsfraktioner. Det er vigtigt også at analysere udstrømning for at korrelere metabolisme med vævsfunktion. Teknologiens måling kan begge bedre vurdere cellulære mekanismer, der medierer vævsfunktion og sygdom.Den største udfordring ved måling af iltforbrug og levende væv er at levere tilstrækkelig ilt til at opretholde vævets levedygtighed og funktion. Dette opnås bedst med flowsystemer. Brug af gastryk i stedet for standard peristaltiske pumper forenkler proceduren meget og eliminerer også bobledannelse.Nytten af en metabolisk måling er kun så god som dens evne til at kvantificere og reproducere resultaterne. Vores protokol udnytter kombinationen af præcist kontrolleret flowhastighed med stabil levetidsdetektering af opløst ilt i både ind- og udstrømning. Denne tilgang kan reproducerbart løse ændringer i iltforbruget på selv nogle få procent.De biokemiske processer, der medierer retinal funktion, er resultatet af det metaboliske samspil mellem forskellige væv i øjet. Vores flowsystems evne til at vurdere flere vævstyper med forskellige geometrier letter undersøgelsen af de unikke iboende egenskaber ved hver celletype og deres koordinerede funktioner. Mange sygdomme, der rammer øjet, skyldes forringede metaboliske veje og signalering.Vi fokuserer på at måle iltforbruget og frigivelsen af metaboliske biprodukter fra øjenvæv for at karakterisere, forstå og behandle udviklingen af nethindesygdomme og degeneration.