Name: Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00
Duration: 2 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Cette recherche a été financée par des subventions des National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) et R01 EY006641, R01 EY017863 et R21 EY032597 (J.B.H.).

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol>
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I.R.S., M.G. et K.B. ont des liens financiers avec EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), le fabricant/distributeur du système de périfusion BaroFuse décrit dans cette étude. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

En raison de l’importance de la bioénergétique dans tous les aspects de la fonction cellulaire et du maintien de divers composants de l’œil, il existe un besoin critique de méthodes pour étudier sa régulation. En particulier, la rétine neurale et l’EPR dépendent du métabolisme à la fois pour la production d’énergie et pour la signalisation intra et intercellulaire14,15,16,17. En raison de leur capacité oxydative élevée, les tissus isolés de l’œil ne sont pas bien maintenus dans des conditions statiques18,19 et, par conséquent, l’étude des composants isolés de l’œil nécessite des systèmes d’écoulement capables à la fois de maintenir et d’évaluer les processus métaboliques. Le système fluidique a été développé pour générer des données OCR et LPR à partir d’un large éventail de types de tissus et, dans cet article, nous avons présenté des protocoles détaillés qui se sont avérés produire des résultats optimaux.
Le principal déterminant pour générer des données robustes à l’aide du système d’écoulement comprend le pré-équilibrage du milieu/tampon à base de CO2 à 39 °C (pour s’assurer que le périfusat n’est pas sursaturé de gaz dissous qui se dégazerait pendant l’expérience). En particulier, le milieu ou le tampon KRB stocké à 4 °C sera sursaturé par rapport à 37 °C et dégazera pendant l’expérience si les temps de pré-équilibrage sont insuffisants. De plus, les tissus chargés dans les chambres tissulaires ne doivent pas être traumatisés par une mauvaise isolation des tissus due à une déchirure ou à une séparation incomplète des tissus, ou par une exposition trop longue des tissus à l’air atmosphérique dans une faible quantité de tampon à base de bicarbonate. Le contrôle de la température, la stabilité de l’écoulement et la fiabilité de la détection del’O2 ont peu de variabilité et ces facteurs ne contribuent pas de manière significative au taux de défaillance.
L’instrument dispose de huit canaux d’écoulement/chambres tissulaires qui fonctionnent simultanément et qui sont alimentés en périfusat à partir de deux réservoirs, quatre chambres tissulaires pour chaque réservoir. Pour obtenir les trajectoires temporelles les plus précises de l’OCR, les courbes cinétiques sont corrigées par des chambres qui ne sont pas chargées de tissus. Ainsi, un protocole expérimental typique impliquerait deux groupes de trois chambres tissulaires. En général, les protocoles se répartissent en deux catégories : d’une part, les différents protocoles de composés d’essai de chaque côté (par exemple, drogue/véhicule d’un côté du MRM, et véhicule de l’autre) ; le second est le même protocole d’injection de composé d’essai des deux côtés de la MRM, mais un tissu ou un modèle de tissu différent de chaque côté de la MRM. Dans cet article, les effets de l’oligomycine et de la FCCP sur la rétine ont été comparés à l’OCR par des tissus qui n’ont été exposés à aucun composé test, et deux tissus ont été évalués de manière concomitante dans le même protocole et les mêmes conditions pour identifier le comportement spécifique des tissus. Ce dernier a été illustré dans cette étude en montrant une augmentation de la plage dynamique du taux métabolique par RPE-choroïde-sclérotique par rapport à la rétine en parallèle dans la même expérience. D’autres rapports ont décrit un plus large éventail de modèles d’étude, y compris la mesure des effets des différents niveaux d’O2 sur l’OCR et le LPR, et les dépendances à la concentration des carburants, des médicaments et des toxines20,21. De plus, bien que nous ayons limité l’analyse des fractions d’écoulement à la mesure du lactate et au calcul de la LPR, le contenu d’information d’une expérience augmente considérablement si plusieurs composés et classes de composés dans les fractions d’écoulement sont dosés, tels que les hormones, les neurotransmetteurs, les signaux cellulaires et les métabolites qui peuvent sortirdes cellules. Chapitre 23.
La mise en charge de la rétine isolée ou de l’EPR-choroïde-sclérotique est simple, et une fois isolés, ces tissus sont simplement placés dans le haut des chambres tissulaires avec des pinces et laissés s’enfoncer jusqu’à la fritte. Les cellules d’EPR cultivées sur des inserts filtrants développent une polarisation appropriée et des marqueurs de maturité de l’EPR après 4 à 8 semaines de culture. Il n’est pas possible de retirer l’EPR pour l’analyse des cellules vivantes une fois qu’il est attaché à la membrane du transwell, si l’on veut maintenir la maturité et la polarisation de l’EPR24. La chambre de périfusion peut accueillir des bandes de la membrane transwell qui sont coupées avec un scalpel alors qu’elles sont immergées dans le tampon et rapidement insérées dans les chambres tissulaires. Bien que les bandes filtrantes de coupe aient été placées dans un système statique24, aucune autre méthode fluidique n’est disponible pour évaluer ces types de cellules importantes. Les réponses des cellules RPE ont été rapides et plus dynamiques que celles de la rétine ou de la sclérotique choroïde, probablement en partie en raison de l’accès immédiat des faces apicale et basale des cellules RPE configurées en monocouche sur l’insert membranaire.
Un autre facteur permettant de s’assurer que les données ont le rapport signal/bruit le plus élevé est la sélection du rapport optimal de tissus chargés dans les chambres de périfusion par rapport au débit. Trop peu de tissu par rapport au débit entraîne une différence de concentration d’O2 dissous entre l’entrée et la sortie qui est très faible et difficile à mesurer de manière fiable. En revanche, si l’écoulement est trop lent, la concentration d’O2 devient si faible que le tissu est affecté par l’hypoxie. Néanmoins, le débit de liquide entraîné par la pression du gaz peut être maintenu à des débits allant jusqu’à 5 mL/min ne nécessitant que de petites quantités de tissu pour des mesures OCR et LPR précises. Dans les expériences présentées ici, environ 20 mL/min/canal ont été utilisés, ce qui convenait soit à une rétine, soit à deux sclérotiques choroïdiennes RPE, soit à 360 000 cellules RPE. Pour minimiser les effets du système qui retardent et dispersent l’exposition du tissu au composé d’essai injecté, plusieurs tailles de chambres tissulaires sont fournies, de sorte que la quantité de tissu (et le débit) soit adaptée à la taille appropriée de la chambre.
Les données issues des analyses présentées dans cet article ont été représentées de deux manières : en termes absolus de magnitude par rapport au taux ou en termes de variations fractionnaires par rapport à un état d’équilibre ou à une ligne de référence. L’accent a été mis sur l’illustration de la mesure des réponses aux composés d’essai. Cependant, le système fluidique est bien adapté pour évaluer et comparer les effets du traitement tissulaire avant l’analyse de périfusion, tels que les modifications génétiques. Il est plus difficile de vérifier si un traitement est différent du témoin si l’on analyse les effets du traitement sur les réponses normalisées des composés d’essai. Si l’analyse nécessite des magnitudes absolues, la puissance statistique des analyses d’échantillons prétraités est maximisée si leur évaluation et leurs contrôles sont effectués dans la même expérience de périfusion.
À l’exception de l’agitateur, toutes les pièces qui entrent en contact avec le liquide sont fournies par le fabricant en tant que consommables et ont été stérilisées. Ces pièces ne doivent pas être réutilisées, car les expériences seront parfois perdues en raison d’un nettoyage incomplet et de surfaces contaminées. Au début de l’installation, le système est stérile. Cependant, des milieux sont ajoutés à la MRM et les tissus sont chargés dans les chambres dans des conditions non stériles. Nous avons mesuré l’OCR dans le système qui est assemblé avec des pièces stériles, mais où l’expérience elle-même est réalisée dans des conditions non stériles. Il faut environ 14 h pour que les bactéries s’accumulent au point d’avoir un OCR mesurable (résultats non publiés). Si des protocoles de moins de 10 h environ sont utilisés, l’accumulation de bactéries et les effets qui en découlent seront négligeables.
De nombreux chercheurs utilisent des instruments conçus pour mesurer l’OCR sous incubation statique d’une monocouche de cellules avec un débit relativement élevé25,26. En revanche, l’instrument fluidique que nous avons testé et décrit dans cet article maintient les tissus en assurant une livraison adéquate d’O2, ce qui est essentiel pour les plus grandes distances de diffusion présentes dans les échantillons de tissus. De plus, il est capable de collecter des fractions permettant l’évaluation de plusieurs paramètres en parallèle de l’OCR, ce qui améliore considérablement la capacité d’étudier les relations entre eux. Enfin, les concentrations de gaz dissous (tels que l’O2 et le CO 2) peuvent être contrôlées, ce qui augmente la durée des expériences avec des milieux et des tampons à base de bicarbonate, ce qui permet à l’utilisateur d’étudier les effets de l’O 2. Il convient de souligner qu’une limite pour les deux méthodologies est l’impossibilité d’étudier le lavage des composés d’essai, une fonctionnalité que d’autres systèmes de périfusion ont 4,27,28. Un autre élément à prendre en compte lors de la détermination de la modalité d’analyse optimale est le fait que les systèmes fluidiques utilisent plus de milieux et de composés d’essai que les systèmes statiques. Les dépenses supplémentaires sont minimisées avec les systèmes fluidiques actuels en raison des faibles débits que le système peut être utilisé.
Dans l’ensemble, une description détaillée des protocoles permettant d’effectuer des expériences avec un nouvel instrument d’évaluation du débit est décrite. Les données générées avec la rétine et l’EPR-choroïde-sclérotique ont récapitulé les résultats antérieurs obtenus avec des systèmes beaucoup plus difficiles à utiliser (et difficilement disponibles). Il a également été démontré que le système peut maintenir et évaluer les cellules RPE attachées aux membranes transwell, un modèle cellulaire très important qui n’a pas été analysé auparavant avec des systèmes d’écoulement en raison de la fragilité des cellules. Les principales parties du protocole consistent en un temps de mise en place de 75 minutes, suivi d’une période d’équilibration de 90 minutes et du protocole expérimental le rendant adapté à une utilisation de routine par des laboratoires qui ne sont pas spécialisés dans l’exploitation de systèmes fluidiques. Bien que nous nous soyons concentrés sur la mesure de la réponse aiguë des tissus aux composés testés, le système est très approprié pour comparer des tissus provenant de diverses sources telles que des modèles animaux ou des modèles cellulaires qui ont été génétiquement modifiés ou qui ont subi des traitements/conditions d’essai. De plus, la portée des tests qui peuvent être effectués sur les fractions d’écoulement est large et comprend les métabolites, les molécules de signalisation cellulaire et les hormones/neurotransmetteurs sécrétés, ainsi que l’analyse multi-composants générée par spectrométrie de masse sur les fractions ainsi que sur les tissus.

Les systèmes de périfusion ont une longue histoire dans les sciences de la vie. En particulier, pour l’étude de la fonction sécrétoire des îlots, ils ont été utilisés pour caractériser la cinétique de la sécrétion d’insuline en réponse aux sécrétagogues1. En plus de collecter les fractions d’écoulement pour le dosage ultérieur des hormones et des métabolites, des capteurs en temps réel ont été incorporés, principalement pour la détection de la consommation d’oxygène 2,3,4. Les efforts généralisés visant à mieux comprendre les mécanismes de médiation des maladies de l’œil ont été limités par le manque de méthodes physiologiquement pertinentes pour évaluer la régulation métabolique et la dérégulation des divers composants isolés de l’œil, y compris la rétine, l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)-choroïde-sclérotique et les cellules RPE en culture. Les systèmes statiques conçus pour les cellules en culture ont été adaptés pour le tissu5, mais le tissu a besoin d’un flux pour une oxygénation adéquate. Les systèmes d’écoulement ont réussi à mesurer avec précision et reproductibilité les réponses en temps réel du taux de consommation d’oxygène (OCR) de la rétine et de l’EPR-choroïde-sclérotique, et les tissus restent métaboliquement stables pendant plus de 8 h, ce qui permet des protocoles très informatifs impliquant plusieurs composés d’essai 4,6,7,8,9 . Néanmoins, l’exploitation des systèmes fluidiques a toujours nécessité un appareil sur mesure et un personnel technique formé à des méthodologies non standardisées. De tels systèmes n’ont pas été adoptés comme méthodologie standard dans la plupart des laboratoires. Le BaroFuse est un système fluidique nouvellement développé qui ne repose pas sur des pompes, mais plutôt sur la pression du gaz pour conduire le débit à travers plusieurs canaux et chambres tissulaires (Figure 1). Chaque canal est surveillé en permanence pour l’OCR, et le flux sortant est collecté à l’aide d’un collecteur de fractions à plaque pour une analyse ultérieure du contenu. Il est important de noter que les chambres de périfusion tissulaire de l’instrument sont conçues pour accueillir des tissus de différentes géométries et tailles.
Le cœur de l’instrument est le système fluidique, où l’écoulement est conduit d’un réservoir scellé et pressurisé à travers un tube de petit diamètre intérieur (ID) (contribuant à la résistance à l’écoulement la plus importante dans le circuit de fluide) jusqu’aux chambres à tissu en verre qui abritent le tissu. La pression du module de réservoir de média (MRM) est fournie par des régulateurs basse pression et haute pression connectés à une bouteille de gaz contenant un mélange de gaz (généralement 21 % d’O 2, 5 % de CO 2, équilibre N2), et le réservoir est scellé par le haut par le module de chambre de périfusion (PCM) qui contient les assemblages de chambre tissulaire (TCA). Le débit est contrôlé par la longueur et le diamètre intérieur des tubes de résistance et le réglage de la pression d’un régulateur basse pression. Des tubes d’écoulement reliés à la partie supérieure des chambres tissulaires acheminent le fluide vers un récipient à déchets (qui est pesé en continu pour la détermination automatique du débit) ou dans des puits d’une plaque à 96 puits contrôlée par le collecteur de fractions. Le système de détection de l’O 2 mesure la durée de vie d’un colorant sensible à l’O2 peint à l’intérieur de chacune des chambres de tissu en verre en aval du tissu. Ces informations sont ensuite utilisées pour calculer l’OCR en continu. L’ensemble du système fluidique réside dans une enceinte à température contrôlée et le réservoir de gaz, le collecteur de fractions et l’ordinateur sont les principaux composants de l’instrument (Figure 2A). Enfin, le logiciel qui exécute l’instrument sert à contrôler son fonctionnement (y compris la préparation et la synchronisation des composés d’essai injectés, le système de mesure du débit et la synchronisation du collecteur de fractions), ainsi qu’à traiter et à représenter graphiquement les données OCR et d’autres mesures supplémentaires.
Dans cet article, nous décrivons les protocoles d’utilisation du système fluidique pour périfuser et évaluer l’OCR et le taux de production de lactate (LPR) pour divers composants isolés de l’œil. Le LPR est un paramètre reflétant le taux de glycolyse qui est très complémentaire à l’OCR, où la paire représente les deux principales branches de la production d’énergie à partir des glucides dans la cellule10. Comme la préparation du tissu et son chargement dans les chambres tissulaires sont mieux appris en regardant la procédure, la vidéo aidera à illustrer plusieurs des étapes critiques qui sont effectuées lors de la mise en place et de l’opération et qui ne sont pas facilement transmises par le texte seul.
La description du protocole est divisée en 8 sections qui correspondent aux différentes phases de l’expérience (Figure 2B) : 1. préparation pré-expérimentale ; 2. préparation/équilibration du périfusat ; 3. Configuration de l’instrument ; 4. l’équilibre des tissus ; 5. Protocole expérimental ; 6. Décomposition de l’instrument ; 7. Traitement des données ; et 8. Dosages des fractions d’écoulement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

De nombreux modèles in vitro utilisés pour étudier la fonction tissulaire et la biologie cellulaire nécessitent un flux de milieux pour fournir une oxygénation adéquate et des conditions cellulaires optimales nécessaires au maintien de la fonction et de la viabilité. À cette fin, nous avons développé un système de culture en flux multicanal pour maintenir les tissus et les cellules en culture et évaluer en permanence la fonction et la viabilité par des capteurs en ligne et/ou la collecte de fractions de sortie. Le système combine une détection optique continue à 8 canaux du taux de consommation d’oxygène avec un collecteur de fractions intégré pour mesurer simultanément les taux de production de métabolites et la sécrétion d’hormones. Bien qu’il soit capable de maintenir et d’évaluer un large éventail de modèles de tissus et de cellules, y compris les îlots, les muscles et l’hypothalamus, nous décrivons ici ses principes de fonctionnement et les préparations/protocoles expérimentaux que nous avons utilisés pour étudier la régulation bioénergétique de la rétine de souris isolée, de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris (EPR)-choroïde-sclérotique et des cellules RPE humaines en culture. Les innovations dans la conception du système, telles que l’écoulement des fluides sans pompe, ont considérablement simplifié le fonctionnement d’un système d’écoulement multicanal. Des vidéos et des images sont présentées qui illustrent comment assembler, préparer l’instrument pour une expérience et charger les différents modèles de tissus/cellules dans les chambres de périfusion. De plus, des lignes directrices pour la sélection des conditions pour les expériences spécifiques au protocole et aux tissus sont définies et discutées, y compris la définition du rapport débit/tissu correct pour obtenir des conditions de culture cohérentes et stables et des déterminations précises des taux de consommation et de production. La combinaison d’un entretien optimal des tissus et d’une évaluation en temps réel de multiples paramètres permet d’obtenir des ensembles de données très instructifs qui seront d’une grande utilité pour la recherche en physiologie de l’œil et la découverte de médicaments pour le traitement des troubles de la vision.

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

Pour illustrer la résolution des données générées à partir de composants isolés de l’œil, l’OCR et la LPR ont été mesurées avec trois types de tissus (rétine, RPE-choroïde-sclérotique et cellules RPE) selon un protocole couramment utilisé (le test d’effort mitochondrial10 ; Figure 10, Figure 11 et Figure 12). La quantité de tissu utilisée pour chaque tissu est indiquée dans le tableau 1. Les données ont été traitées et représentées graphiquement à l’aide du progiciel développé pour le système fluidique. La préparation de la rétine et de l’EPR-choroïde-sclérotique est relativement simple et prend moins de 20 minutes pour chaque type de tissu. L’OCR était constante pendant la période d’injection des composés d’essai, ce qui indique une santé et une fonction stables du tissu et soutient la validité de la méthode (figure 10). Une fois validé pour chaque type de tissu, nous n’avons pas jugé nécessaire d’effectuer des contrôles où aucun composé d’essai n’est injecté pour chaque expérience. Conformément aux données obtenues à l’aide de méthodes de périfusion plus conventionnelles 6,8,13, l’OCR diminue en réponse à l’oligomycine et augmente l’OCR en réponse à la FCCP. Les changements dans la LPR étaient dans la direction opposée à ceux observés pour l’OCR : l’oligomycine a augmenté la LPR, qui a ensuite diminué (mais seulement légèrement) en réponse à la FCCP (Figure 11). Pour comparer la signification statistique de l’effet de chaque composé d’essai séquentiel, des tests t ont été effectués (qui sont calculés automatiquement par le logiciel fourni avec l’instrument). Étant donné que l’objectif de l’article était de décrire comment effectuer la méthode, le nombre de répétitions transportées n’était pas toujours assez élevé pour produire une signification statistique. En général, cependant, lorsque le nombre de répétitions était de 3 ou plus, les effets de la FCCP et de l’oligomycine sur l’OCR et la LPR étaient significatifs.
Les cellules RPE n’ont pas été analysées auparavant avec des systèmes d’écoulement, mais ont réagi de la même manière à RPE-choroïde-sclère (ce qui est cohérent avec l’idée qu’une grande partie de l’OCR est due aux cellules RPE ; Graphique 11). Ces exemples illustratifs mettent en évidence la capacité du système à maintenir la viabilité des tissus, comme en témoignent la stabilité de l’OCR dans les canaux de contrôle et le rapport signal sur bruit élevé pour les changements de l’OCR de l’ampleur induite par l’oligomycine et le FCCP, qui était supérieur à 100 pour 1. De plus, les dosages des fractions d’écoulement peuvent être utilisés pour corréler le taux d’absorption ou de production d’un large éventail de composés échangeant avec le liquide extracellulaire sont complémentaires à l’OCR (dans ce cas, LPR). Ces caractéristiques de l’instrument ont permis de quantifier avec précision les différences caractéristiques dans les réponses tissulaires entre les types de tissus, réalisées en parallèle. L’OCR par l’EPR-choroïde-sclère et les cellules RPE sont systématiquement plus sensibles à l’oligomycine que la rétine (Figure 11 et Figure 12), bien que pour l’EPR-choroïde-sclère, la durée d’exposition à la FCCP n’ait pas été assez longue pour atteindre l’état d’équilibre. Un point à prendre en compte lors de l’utilisation du DMSO comme solvant. À des concentrations plus élevées, le DMSO (0,2 %) a eu un effet transitoire sur l’OCR par la rétine (reflétant probablement un effet d’un changement de pression osmotique provoqué par l’effet du DMSO sur la perméabilité membranaire).
Sur la base de l’hypothèse que le KCN inhibe complètement la respiration par son action directe sur la cytochrome c oxydase, l’OCR à la fin de l’exposition au KCN est fixé à 0 et toutes les valeurs OCR sont calculées en fonction de la variation par rapport à la valeur KCN. L’OCR peut se produire indépendamment de la chaîne respiratoire et de la cytochrome c oxydase. Cependant, l’ampleur de cette contribution à l’OCR global n’est généralement pas supérieure à quelques pour cent (données non présentées) et la durée prolongée pendant laquelle les tissus sont exposés au KCN garantit que les substrats d’oxydases qui ne font pas partie de la chaîne de transport d’électrons ont été épuisés.
Analyse statistique Des expériences uniques ont été montrées comme indiqué dans les figures, mais avec plusieurs canaux qui ont été moyennés. Les données ont ensuite été représentées graphiquement sous la forme de la moyenne ± l’erreur-type (ET ; calculée en écart-type/√n).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> Graphique 1. Schéma du système fluidique/d’évaluation. Les principaux composants comprennent l’enceinte, les éléments de contrôle de la température, les systèmes de chambre fluidique et tissulaire, la régulation de la pression du gaz dans l’espace de tête au-dessus du périfusat, le collecteur de fractions/surveillance du débit et les détecteurs d’O2 . Abréviations : MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> Graphique 2. (A) Image des principaux composants de l’instrument. Les principaux composants sont constitués d’un réservoir de gaz (régulateurs de pression), d’un boîtier, d’un collecteur de fractions et d’un ordinateur. (B) Organigramme expérimental montrant les principales catégories d’étapes et le temps nécessaire pour les réaliser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> Graphique 3. Vue du MRM. Le MRM est représenté avec un insert MRM (à gauche) et des barres d’agitation (à droite) placés dans le bas des inserts MRM (placés de chaque côté du diviseur MRM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> Graphique 4. Assemblage de tubes et ensemble de tubes de purge dans le MRM. (A) Ensemble de tube d’injection de composé d’essai et ensemble de tube de purge fixé aux orifices du MRM. (B-C) L’ensemble d’injection de pâte à tester et l’ensemble de tube de purge (B) sont placés dans la rainure à l’avant de l’enceinte (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> Graphique 5. Mise sous tension du régulateur de température MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> Graphique 6. Chambres à tissus et réservoir de gaz. Positionnement du détecteur O2 sur le support du détecteur (qui prend également en charge le MRM et le PCM) et placement de la bande autour des ailettes du PCM qui aident à fixer les chambres tissulaires en place. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> Figure 7. (A) Régulateurs haute et basse pression sur le réservoir d’essence. (B-C) Tube de purge. Le tube de purge permet à l’espace libre dans le MRM d’évacuer l’air et de se remplir de gaz du réservoir d’alimentation. Photos montrant le tube de purge ouvert (B) et le tube de purge fermé (C). L’ensemble d’injection de composé d’essai reste fermé tout au long du processus de purge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> Graphique 8. Chambre tissulaire et configuration de l’écoulement. (A) Dimensions de la membrane Transwell après qu’elle a été coupée en trois bandes de largeur égale. (B) Support multitube d’écoulement. (C) Support multitube d’écoulement positionné sur la lèvre de l’enceinte avec les adaptateurs de tubulure près des chambres à tissus. (D) Image des ensembles de tubes d’écoulement fixés aux chambres tissulaires. (E) Vue aérienne de l’enceinte sans le couvercle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> Graphique 9. Injection de composé dans le MRM. Injection d’un composé d’essai à travers l’orifice d’injection dans le MRM à l’aide d’une seringue de 5 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> Graphique 10. Courbes OCR et LPR en réponse aux composés d’essai. OCR et LPR par rétine isolée de souris (1 rétine/canal) en réponse à la présence ou à l’absence (contrôle) de composés d’essai comme indiqué. Chaque courbe est la moyenne de 6 répétitions d’une seule expérience (les barres d’erreur sont des ET ; les valeurs de p sont calculées en effectuant des tests t appariés comparant les valeurs d’état stationnaire de chaque agent de test avec celles de l’agent de test précédent). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> Graphique 11. Courbes OCR. OCR par RPE-choroïde-sclère et rétine isolées de souris (1 rétine ou 2 RPE-choroïde-sclérotique/canal) mesurées en parallèle en réponse aux composés d’essai comme indiqué. Les données sont la moyenne des répétitions d’une seule expérience (n = 2 et 4 pour l’EPR, la choroïde, la sclérotique et la rétine respectivement ; les valeurs de p sont calculées en effectuant des tests t appariés comparant les valeurs à l’état d’équilibre de chaque agent de test avec celles de l’agent de test précédent). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> Graphique 12. Courbes OCR et LPR à partir de cellules RPE. OCR et LPR à partir de cellules RPE attachées à des membranes transwell qui ont été coupées en bandes et chargées dans les chambres de périfusion. Les données sont la moyenne des répétitions d’une seule expérience (n = 3, avec 1,5 membrane/canal (360 000 cellules/canal) ; les valeurs p sont calculées en effectuant des tests t appariés comparant les valeurs à l’état d’équilibre de chaque agent d’essai avec celles de l’agent d’essai précédent). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>TISSUS/CELLULES</td>
			<td>Quantité/Canal</td>
			<td>DÉBIT : mL/min</td>
		</tr><tr><td>Rétine (souris)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-choroïde-sclère (souris)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>Cellules RPE sur membranes Transwell</td>
			<td>360 000 cellules (4 x 1/3 bandes filtrantes)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1. Spécifications de fonctionnement recommandées pour différents tissus.
Figure supplémentaire 1. Représentation graphique d’un plan d’expérience. Le moment et la composition de l’exposition aux composés d’essai, ainsi que le moment de la collecte des fractions. L’incrément de concentration (Conc Inc) est le changement de concentration à mettre en œuvre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2. Interface utilisateur au démarrage. Interface utilisateur de la fenêtre de démarrage du logiciel de détection de l’O 2 qui surveille l’O2 dans les chambres tissulaires insérées dans le PCM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3. Interface utilisateur pour les paramètres de l’expérience. Interface utilisateur pour la saisie des informations expérimentales (à gauche) et la sélection des heures de collecte des fractions d’écoulement (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 4. Interface utilisateur de la page d’injection. Page d’injection qui calcule les volumes d’injection en fonction des concentrations souhaitées de composé d’essai et du volume restant dans le MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Méthodes de préparation des échantillons de tissus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE

L’analyse en temps réel des tissus vivants fournit des données fonctionnelles et mécanistiques importantes. Cet article décrit les protocoles et les variables critiques permettant d’assurer une génération précise et reproductible de données par un nouveau système fluidique multicanal sans pompe qui maintient et évalue un large éventail de modèles de tissus et de cellules.

Maintien et évaluation de divers types de tissus et de cellules de l’œil à l’aide d’un nouveau système fluidique sans pompe

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

Les appareils les plus couramment utilisés pour mesurer la consommation d’oxygène ne prennent pas en charge la collecte simultanée des fractions de sortie. Il est essentiel de doser également l’écoulement pour corréler le métabolisme avec la fonction tissulaire. La mesure de la technologie permet de mieux évaluer les mécanismes cellulaires qui interviennent dans la fonction tissulaire et la maladie.Le principal défi de la mesure de la consommation d’oxygène et des tissus vivants est de fournir suffisamment d’oxygène pour maintenir la viabilité et la fonction des tissus. La meilleure façon d’y parvenir est d’utiliser des systèmes d’écoulement. L’utilisation de la pression du gaz au lieu des pompes péristaltiques standard simplifie considérablement la procédure et élimine également la formation de bulles.L’utilité d’une mesure métabolique dépend de sa capacité à quantifier et à reproduire les résultats. Notre protocole tire parti de la combinaison d’un débit contrôlé avec précision et d’une détection stable de l’oxygène dissous à l’entrée et à la sortie. Cette approche peut résoudre de manière reproductible des changements dans la consommation d’oxygène, même de quelques pour cent seulement.Les processus biochimiques médiateurs de la fonction rétinienne sont le résultat de l’interaction métabolique entre les différents tissus de l’œil. La capacité de notre système d’écoulement à évaluer plusieurs types de tissus avec des géométries diverses facilite l’étude des propriétés intrinsèques uniques de chaque type de cellule et de leurs fonctions coordonnées. De nombreuses maladies affectant l’œil sont causées par une altération des voies métaboliques et de la signalisation.Nous nous concentrons sur la mesure de la consommation d’oxygène et de la libération de sous-produits métaboliques par les tissus oculaires afin de caractériser, comprendre et traiter le développement des maladies et de la dégénérescence de la rétine.