Name: Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00
Duration: 2 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर01 GM148741 आई.आर.एस.), यू01 EY034591, आर01 EY034364, ब्राइटफोकस फाउंडेशन, रिसर्च टू प्रिवेंशन ब्लाइंडनेस (जे.आर.सी.) और आर01 EY006641, आर01 EY017863 और आर21 EY032597 (जे.बी.एच.) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol>
	<li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro:+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin.">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li><li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells.">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li><li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP/ADP+in+pancreatic+islets.">Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets.</a> Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).</li><li>Chertov, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+glucose+in+photoreceptor+survival.">Roles of glucose in photoreceptor survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+Can+Shuttle+Reducing+Power+from+the+Hypoxic+Retina+to+the+O2-Rich+Pigment+Epithelium.">Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium.</a> Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+pyruvate+transport+by+zaprinast+causes+massive+accumulation+of+aspartate+at+the+expense+of+glutamate+in+the+retina.">Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).</li><li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+metabolism+in+the+retinal+pigment+epithelium+uncouples+respiration+from+ATP+synthesis.">Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis.</a> Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism.">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, e66716 (2021).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (1995).</li><li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test.">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).</li><li>Engel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+dysfunction+in+Sorsby+patient-derived+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium.</a> Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mitochondrial+Respiration+Impairs+Nutrient+Consumption+and+Metabolite+Transport+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelium.">Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).</li><li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+Metabolism+and+Metabolism+in+the+Pigmented+Epithelium:+A+Busy+Intersection.">Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+activation+and+photoreceptor+survival+in+retinal+detachment.">Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).</li><li>Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+consumption+by+mammalian+rod+photoreceptors+in+darkness+and+in+light.">ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light.</a> Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+of+engineering+retinal+organoids+and+organoid-on-a-chip+in+modeling+intraocular+drug+delivery:+Current+progress+and+future+perspectives.">Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).</li><li>Arjamaa, O., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-dependent+diseases+in+the+retina:+role+of+hypoxia-inducible+factors.">Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors.</a> Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Multi-Channel+Fluidics+System+for+the+Maintenance+and+Real-Time+Metabolic+and+Functional+Assessment+of+Tissue+or+Cells.">A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells.</a> Cell Reports Methods. In Press. , (2023).</li><li>Neal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Low-Level+Drug+Effects+Using+Real-Time,+in+vitro+Measurement+of+Oxygen+Consumption+Rate.">Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate.</a> Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).</li><li>Jung, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cytochrome+C+is+an+essential+regulator+of+sustained+insulin+secretion+by+pancreatic+islets.">Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).</li><li>Rountree, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+insulin+secretion+by+cytochrome+C+and+calcium+signaling+in+islets+with+impaired+metabolism.">Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).</li><li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers.">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li><li>Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+damage+in+retinal+cells+and+tissues+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+mitochondrial+DNA+damage+and+extracellular+flux+assay+for+mitochondrial+respiration+activity.">Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).</li><li>Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+alterations+in+mitochondrial+reserve+capacity;+a+means+to+predict+subsequent+photoreceptor+cell+death.">Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function.">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).</li><li>Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+acid+acutely+inhibits+acetylcholine-+but+not+GLP-1-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+pancreatic+islets.">Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).</li></ol>

आई.आर.एस., एम.जी., और के.बी. के पास एनटॉक्स साइंसेज, इंक (मर्सर द्वीप, डब्ल्यूए) के साथ वित्तीय संबंध हैं, जो इस अध्ययन में वर्णित बैरोफ्यूज पेरिफ्यूजन सिस्टम के निर्माता / वितरक हैं। अन्य सभी लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

पेरिफ्यूजन सिस्टम का जीवन विज्ञान में एक लंबा इतिहास है। विशेष रूप से, आइलेट्स द्वारा स्रावी कार्य के अध्ययन के लिए, उनका उपयोग स्रावित 1 के जवाब में इंसुलिन स्रावके कैनेटीक्स को चिह्नित करने के लिए किया गया है। हार्मोन और मेटाबोलाइट्स के बाद के परख के लिए बहिर्वाह अंशों को इकट्ठा करने के अलावा, वास्तविक समय सेंसर को शामिल किया गया है, मुख्य रूप से ऑक्सीजन की खपतका पता लगाने के लिए 2,3,4। आंखों के रोगों की मध्यस्थता करने वाले तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए व्यापक प्रयास रेटिना, रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) -कोरॉयड-श्वेतपटल और सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं सहित आंख के विभिन्न पृथक घटकों के चयापचय विनियमन और विकृति का आकलन करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक तरीकों की कमी से सीमित हैं। सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किए गए स्थैतिक प्रणालियों को ऊतक5 के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन ऊतक को पर्याप्त ऑक्सीजन के लिए प्रवाह की आवश्यकता होती है। फ्लो सिस्टम रेटिना और आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा द्वारा ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) में वास्तविक समय की प्रतिक्रियाओं को सटीक और पुन: मापने में सफल रहे हैं, और ऊतक 8 घंटे से अधिक समय तक चयापचय रूप से स्थिर रहते हैं, जिससे कई परीक्षण यौगिकों 4,6,7,8,9 से जुड़े अत्यधिक सूचनात्मक प्रोटोकॉल की अनुमति मिलती है।. बहरहाल, फ्लुइडिक्स सिस्टम के संचालन के लिए ऐतिहासिक रूप से एक कस्टम-निर्मित उपकरण और गैर-मानकीकृत पद्धतियों में प्रशिक्षित तकनीकी कर्मचारियों की आवश्यकता होती है। ऐसी प्रणालियों को अधिकांश प्रयोगशालाओं में मानक पद्धति के रूप में नहीं अपनाया गया है। बैरोफ्यूज एक नव विकसित तरल पदार्थ प्रणाली है जो पंपों पर निर्भर नहीं करती है, बल्कि कई चैनलों और ऊतक कक्षों के माध्यम से प्रवाह को चलाने के लिए गैस के दबाव पर निर्भर करती है (चित्रा 1)। प्रत्येक चैनल को ओसीआर के लिए लगातार निगरानी की जाती है, और सामग्री के बाद के परख के लिए प्लेट-आधारित अंश कलेक्टर के साथ बहिर्वाह एकत्र किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, उपकरण के लिए ऊतक पेरिफ्यूजन कक्ष ों को विभिन्न ज्यामिति और आकार के ऊतकों को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
उपकरण का दिल फ्लुइडिक्स सिस्टम है, जहां प्रवाह को छोटे आंतरिक व्यास (आईडी) ट्यूबिंग (द्रव सर्किट में सबसे महत्वपूर्ण प्रवाह प्रतिरोध का योगदान) के माध्यम से एक सीलबंद, दबाव वाले जलाशय से ऊतक को रखने वाले कांच के ऊतक कक्षों में संचालित किया जाता है। मीडिया जलाशय मॉड्यूल (एमआरएम) को दबाव की आपूर्ति गैसों के मिश्रण (आमतौर पर 21% ओ 2, 5% सीओ 2, बैलेंस एन 2) वाले गैस सिलेंडर से जुड़े कम दबाव और उच्च दबाव नियामकों द्वारा की जाती है, और जलाशय को पेरिफ्यूजन चैंबर मॉड्यूल (पीसीएम) द्वारा शीर्ष से सील किया जाता है जो ऊतक कक्ष असेंबली (टीसीए) रखता है। प्रवाह दर प्रतिरोध ट्यूबों की लंबाई और आईडी और कम दबाव नियामक की दबाव सेटिंग द्वारा नियंत्रित की जाती है। ऊतक कक्षों के शीर्ष से जुड़े बहिर्वाह ट्यूब तरल पदार्थ को या तो अपशिष्ट रिसेप्टेक (जिसे प्रवाह दर के स्वचालित निर्धारण के लिए लगातार तौला जाता है) या अंश कलेक्टर द्वारा नियंत्रित 96-वेल प्लेट के कुओं में पहुंचाता है। ओ 2 डिटेक्शन सिस्टम ऊतक के डाउनस्ट्रीम ग्लास ऊतक कक्षों में से प्रत्येक के अंदर चित्रित ओ2-संवेदनशील डाई के जीवनकाल को मापता है। इस जानकारी का उपयोग लगातार ओसीआर की गणना करने के लिए किया जाता है। संपूर्ण तरल पदार्थ प्रणाली एक तापमान-नियंत्रित बाड़े में रहती है और गैस टैंक, अंश कलेक्टर और कंप्यूटर उपकरण के प्रमुख घटक हैं (चित्रा 2 ए)। अंत में, उपकरण चलाने वाला सॉफ्टवेयर इसके संचालन को नियंत्रित करने के लिए कार्य करता है (इंजेक्शन परीक्षण यौगिकों की तैयारी और समय, प्रवाह माप प्रणाली, और अंश कलेक्टर समय सहित), साथ ही ओसीआर डेटा और अन्य पूरक मापों को संसाधित और ग्राफ़ करना।
इस पेपर में हम आंख के विभिन्न पृथक घटकों के लिए ओसीआर और लैक्टेट उत्पादन दर (एलपीआर) का आकलन करने के लिए फ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एलपीआर ग्लाइकोलाइटिक दर को दर्शाने वाला एक पैरामीटर है जो ओसीआर के लिए अत्यधिक पूरक है, जहां जोड़ी सेल10 में कार्बोहाइड्रेट से ऊर्जा उत्पादन की दो प्रमुख शाखाओं के लिए जिम्मेदार है। चूंकि ऊतक की तैयारी और इसे ऊतक कक्षों में लोड करना प्रक्रिया को देखकर सबसे अच्छा सीखा जाता है, वीडियो सेट अप और ऑपरेशन के दौरान किए जाने वाले कई महत्वपूर्ण चरणों को चित्रित करने में मदद करेगा जो अकेले पाठ द्वारा आसानी से व्यक्त नहीं किए जाते हैं।
प्रोटोकॉल का विवरण 8 वर्गों में विभाजित है जो प्रयोग के विभिन्न चरणों के अनुरूप हैं (चित्रा 2 बी): 1. पूर्व-प्रयोगात्मक तैयारी; 2. पेरिफ्यूसेट की तैयारी / 3. उपकरण स्थापित; 4. ऊतक संतुलन; 5. प्रायोगिक प्रोटोकॉल; 6. उपकरण टूटना; 7. डेटा प्रोसेसिंग; और 8. बहिर्वाह अंशों का आकलन।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

ऊतक समारोह और कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले कई इन विट्रो मॉडल को फ़ंक्शन और व्यवहार्यता के रखरखाव के लिए आवश्यक पर्याप्त ऑक्सीजन और इष्टतम सेल स्थितियों को प्रदान करने के लिए मीडिया के प्रवाह की आवश्यकता होती है। इस अंत में, हमने संस्कृति में ऊतक और कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक बहु-चैनल प्रवाह संस्कृति प्रणाली विकसित की है और इन-लाइन सेंसर और / या बहिर्वाह अंशों के संग्रह द्वारा कार्य और व्यवहार्यता का लगातार आकलन किया है। यह प्रणाली मेटाबोलाइट्स और हार्मोन स्राव की उत्पादन दर को एक साथ मापने के लिए एक अंतर्निहित अंश कलेक्टर के साथ ऑक्सीजन खपत दर के 8-चैनल, निरंतर ऑप्टिकल सेंसिंग को जोड़ती है। यद्यपि यह आइलेट्स, मांसपेशियों और हाइपोथैलेमस सहित ऊतक और सेल मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला को बनाए रखने और आकलन करने में सक्षम है, यहां हम इसके ऑपरेटिंग सिद्धांतों और प्रयोगात्मक तैयारी / प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग हमने पृथक माउस रेटिना, माउस रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) -कोरॉयड-स्क्लेरा और सुसंस्कृत मानव आरपीई कोशिकाओं के बायोएनर्जेटिक विनियमन की जांच करने के लिए किया है। सिस्टम के डिजाइन में नवाचार, जैसे कि पंपलेस द्रव प्रवाह, ने एक बहु-चैनल प्रवाह प्रणाली के बहुत सरल संचालन का उत्पादन किया है। वीडियो और चित्र दिखाए जाते हैं जो बताते हैं कि कैसे इकट्ठा किया जाए, एक प्रयोग के लिए उपकरण तैयार किया जाए, और विभिन्न ऊतक / सेल मॉडल को पेरिफ्यूजन कक्षों में लोड किया जाए। इसके अलावा, प्रोटोकॉल- और ऊतक-विशिष्ट प्रयोगों के लिए शर्तों का चयन करने के लिए दिशानिर्देश चित्रित और चर्चा किए जाते हैं, जिसमें सुसंगत और स्थिर संस्कृति स्थितियों और खपत और उत्पादन दरों के सटीक निर्धारण प्राप्त करने के लिए ऊतक अनुपात में सही प्रवाह दर निर्धारित करना शामिल है। इष्टतम ऊतक रखरखाव और कई मापदंडों के वास्तविक समय के मूल्यांकन का संयोजन अत्यधिक सूचनात्मक डेटा सेट उत्पन्न करता है जो आंख के शरीर विज्ञान में अनुसंधान और बिगड़ा हुआ दृष्टि के उपचार के लिए दवा की खोज के लिए बहुत उपयोगिता होगी।

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

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Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE

जीवित ऊतक का वास्तविक समय विश्लेषण महत्वपूर्ण कार्यात्मक और यंत्रवत डेटा उत्पन्न करता है। यह पेपर एक नए और पंप-मुक्त मल्टी-चैनल फ्लुइडिक्स सिस्टम द्वारा डेटा की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल और महत्वपूर्ण चर का वर्णन करता है जो ऊतक और सेल मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला को बनाए रखता है और मूल्यांकन करता है।

एक नवीन पंपलेस फ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करके आंख के विभिन्न ऊतक और सेल प्रकारों को बनाए रखना और उनका आकलन करना

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम उपकरण बहिर्वाह अंशों के एक साथ संग्रह का समर्थन नहीं करते हैं। ऊतक समारोह के साथ चयापचय को सहसंबंधित करने के लिए परख बहिर्वाह भी महत्वपूर्ण है। प्रौद्योगिकी के माप दोनों ऊतक समारोह और बीमारी की मध्यस्थता करने वाले सेलुलर तंत्र का बेहतर आकलन कर सकते हैं।ऑक्सीजन की खपत और जीवित ऊतक को मापने में महत्वपूर्ण चुनौती ऊतक व्यवहार्यता और कार्य को बनाए रखने के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन प्रदान कर रही है। यह प्रवाह प्रणालियों के साथ सबसे अच्छा पूरा किया जाता है। मानक पेरिस्टालिक पंप के बजाय गैस के दबाव का उपयोग करना प्रक्रिया को बहुत सरल बनाता है और बुलबुला गठन को भी समाप्त करता है।एक चयापचय माप की उपयोगिता केवल उतनी ही अच्छी है जितनी कि परिणामों को निर्धारित करने और पुन: पेश करने की क्षमता। हमारा प्रोटोकॉल प्रवाह और बहिर्वाह दोनों में घुलित ऑक्सीजन के स्थिर जीवनकाल का पता लगाने के साथ सटीक नियंत्रित प्रवाह दर के संयोजन का लाभ उठाता है। यह दृष्टिकोण केवल कुछ प्रतिशत की ऑक्सीजन खपत में परिवर्तन को हल कर सकता है।रेटिना फ़ंक्शन की मध्यस्थता करने वाली जैव रासायनिक प्रक्रियाएं आंख के विभिन्न ऊतकों के बीच चयापचय परस्पर क्रिया का परिणाम हैं। विविध ज्यामिति के साथ कई ऊतक प्रकारों का आकलन करने के लिए हमारी प्रवाह प्रणाली की क्षमता प्रत्येक सेल प्रकार के अद्वितीय आंतरिक गुणों और उनके समन्वित कार्यों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है। आंखों को प्रभावित करने वाली कई बीमारियां बिगड़ा हुआ चयापचय मार्ग और सिग्नलिंग के कारण होती हैं।हम रेटिना रोगों और अध: पतन के विकास को चिह्नित करने, समझने और इलाज करने के लिए आंखों के ऊतकों द्वारा ऑक्सीजन की खपत और चयापचय उपोत्पादों की रिहाई को मापने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।