Name: Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00
Duration: 2 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) e R01 EY006641, R01 EY017863 e R21 EY032597 (J.B.H.).

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol>
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I.R.S., M.G. e K.B. hanno legami finanziari con EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), il produttore/distributore del sistema di perifusione BaroFuse descritto in questo studio. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

A causa dell'importanza della bioenergetica in tutti gli aspetti della funzione cellulare e del mantenimento di vari componenti dell'occhio, c'è un bisogno critico di metodi per studiarne la regolazione. In particolare, la retina neurale e l'RPE dipendono dal metabolismo sia per la generazione di energia che per la segnalazione intra e intercellulare14,15,16,17. A causa della loro elevata capacità ossidativa, i tessuti isolati dell'occhio non sono ben mantenuti in condizioni statiche18,19 e quindi lo studio di componenti isolati dell'occhio richiede sistemi di flusso in grado di mantenere e valutare i processi metabolici. Il sistema fluidico è stato sviluppato per generare dati OCR e LPR da un'ampia gamma di tipi di tessuto e in questo documento abbiamo presentato protocolli dettagliati che si sono rivelati in grado di produrre risultati ottimali.
Il principale fattore determinante per la generazione di dati robusti utilizzando il sistema di flusso include il pre-equilibrio del fluido/tampone a base di CO2 a 39 °C (per garantire che il perifusato non sia sovrasaturo di gas disciolto che degasserebbe durante l'esperimento). In particolare, il terreno o il tampone KRB conservato a 4 °C sarà sovrasaturo rispetto a 37 °C e degasserà durante l'esperimento se i tempi di pre-equilibrazione sono insufficienti. Inoltre, il tessuto caricato nelle camere tissutali non deve essere traumatizzato da un isolamento improprio del tessuto a causa di lacerazione o separazione incompleta del tessuto, o dall'esposizione del tessuto in una bassa quantità di tampone a base di bicarbonato all'aria atmosferica per troppo tempo. Il controllo della temperatura, la stabilità del flusso e l'affidabilità del rilevamento di O2 hanno poca variabilità e questi fattori non contribuiscono in modo significativo al tasso di guasto.
Lo strumento è dotato di otto canali di flusso/camere tissutali che funzionano simultaneamente e che sono alimentati con perifusato da due serbatoi, quattro camere tissutali per ogni serbatoio. Per ottenere l'andamento temporale più accurato dell'OCR, le curve cinetiche vengono corrette in base da camere che non sono caricate con tessuto. Pertanto, un tipico protocollo sperimentale coinvolgerebbe due gruppi di tre camere tissutali. I protocolli in generale si dividono in due categorie: uno è costituito dai diversi protocolli dei composti in esame su ciascun lato (ad esempio farmaco/veicolo su un lato dell'MRM e solo veicolo sull'altro); il secondo è lo stesso protocollo di iniezione del composto di prova su entrambi i lati dell'MRM, ma tessuto diverso o modello di tessuto su ciascun lato dell'MRM. In questo documento, gli effetti dell'oligomicina e della FCCP sulla retina sono stati confrontati con l'OCR da parte di tessuti che non sono stati esposti ad alcun composto di prova e due tessuti sono stati valutati contemporaneamente con lo stesso protocollo e le stesse condizioni per identificare il comportamento tessuto-specifico. Quest'ultimo è stato illustrato in questo studio mostrando un aumento della gamma dinamica del tasso metabolico da parte di RPE-coroide-sclera rispetto alla retina in parallelo nello stesso esperimento. Altri rapporti hanno descritto una gamma più ampia di disegni di studio, tra cui la misurazione degli effetti che variano i livelli di O2 su OCR e LPR e le dipendenze dalla concentrazione di combustibili, farmaci e tossine20,21. Inoltre, sebbene abbiamo limitato l'analisi delle frazioni di deflusso alla misurazione del lattato e al calcolo dell'LPR, il contenuto informativo di un esperimento aumenta notevolmente se vengono analizzati più composti e classi di composti nelle frazioni di deflusso come ormoni, neurotrasmettitori, segnali cellulari e metaboliti che possono uscire dalle cellule20,22, 23.
Il caricamento della retina isolata o dell'RPE-coroide-sclera è semplice e, una volta isolati, questi tessuti vengono semplicemente posizionati nella parte superiore delle camere tissutali con una pinza e lasciati affondare fino alla fritta. Le cellule RPE coltivate su inserti filtranti sviluppano una polarizzazione appropriata e marcatori di maturità RPE dopo 4-8 settimane di coltura. Non è possibile rimuovere l'RPE per l'analisi su cellule vive una volta attaccato alla membrana del transwell, se si vuole mantenere la maturità e la polarizzazione dell'RPE24. La camera di perifusione può ospitare strisce della membrana del transwell che vengono tagliate con un bisturi mentre sono immerse nel tampone e inserite rapidamente nelle camere tissutali. Sebbene il taglio delle strisce filtranti sia stato inserito in un sistema statico24, non sono disponibili altri metodi fluidici per valutare questi importanti tipi di cellule. Le risposte delle cellule RPE sono state rapide e più dinamiche rispetto alla retina o alla RPE-coroide-sclera, probabilmente in parte a causa dell'accesso immediato sia all'aspetto apicale che a quello basale delle cellule RPE configurate come un monostrato sull'inserto di membrana.
Un altro fattore per garantire che i dati abbiano il rapporto segnale/rumore più elevato è la selezione del rapporto ottimale di tessuto caricato nelle camere di perifusione rispetto alla portata. Una quantità insufficiente di tessuto rispetto alla portata si traduce in una differenza di concentrazione di O2 disciolto tra afflusso e deflusso, molto piccola e difficile da misurare in modo affidabile. Al contrario, se il flusso è troppo lento, la concentrazione di O2 diventa così bassa che il tessuto è colpito dall'ipossia. Ciononostante, il flusso di liquido guidato dalla pressione del gas può essere mantenuto a velocità di flusso fino a 5 mL/min, richiedendo solo piccole quantità di tessuto per misurazioni OCR e LPR accurate. Negli esperimenti qui mostrati, sono stati utilizzati circa 20 ml/min/canale, adatti per una retina, due scleras coroidi RPE o 360.000 cellule RPE. Per ridurre al minimo gli effetti del sistema che ritardano e disperdono l'esposizione del tessuto al composto di prova iniettato, vengono fornite più dimensioni delle camere tissutali, in modo che la quantità di tessuto (e la portata) corrisponda alla dimensione appropriata della camera.
I dati delle analisi mostrate in questo articolo sono stati rappresentati in due modi: magnitudine assoluta rispetto al tasso, o variazioni frazionarie rispetto a uno stato stazionario o di base. L'attenzione si è concentrata sull'illustrazione della misurazione delle risposte ai composti in esame. Tuttavia, il sistema fluidico è adatto per valutare e confrontare gli effetti del trattamento tissutale prima dell'analisi della perifusione, come le modificazioni genetiche. Testare se un trattamento è diverso dal controllo è più efficace se vengono analizzati gli effetti del trattamento sulle risposte normalizzate dei composti in esame. Se l'analisi richiede magnitudini assolute, la potenza statistica delle analisi dei campioni pretrattati è massimizzata se la loro valutazione e i controlli vengono effettuati nello stesso esperimento di perifusione.
Ad eccezione dell'agitatore, tutte le parti che vengono a contatto con il liquido sono fornite dal produttore come materiali di consumo e sono state sterilizzate. Queste parti non devono essere riutilizzate, poiché gli esperimenti andranno occasionalmente persi a causa di una pulizia incompleta e di superfici contaminate. Il sistema all'inizio dell'installazione è sterile. Tuttavia, i terreni vengono aggiunti all'MRM e il tessuto viene caricato nelle camere in condizioni non sterili. Abbiamo misurato l'OCR nel sistema assemblato con parti sterili, ma in cui l'esperimento stesso viene eseguito in condizioni non sterili. Ci vogliono circa 14 ore perché i batteri si accumulino al punto da avere OCR misurabili (risultati non pubblicati). Se vengono utilizzati protocolli che durano meno di 10 ore o giù di lì, l'accumulo di batteri e gli eventuali effetti dovuti a questi saranno trascurabili.
Molti ricercatori utilizzano strumenti progettati per misurare l'OCR in incubazione statica di un monostrato di cellule con una produttività relativamente elevata25,26. Al contrario, lo strumento di fluidica che abbiamo testato e descritto in questo articolo mantiene il tessuto garantendo un'adeguata erogazione di O2 che è fondamentale per le maggiori distanze di diffusione presenti nei campioni di tessuto. Inoltre, è in grado di raccogliere frazioni che consentono la valutazione di più parametri in parallelo con l'OCR, il che migliora notevolmente la capacità di studiare le relazioni tra di loro. Infine, le concentrazioni di gas disciolti (come O 2 e CO 2 ) possono essere controllate, aumentando la durata degli esperimenti con mezzi e tamponi a base di bicarbonato, consentendo all'utente di studiare gli effetti dell'O2 . Va sottolineato che un limite per entrambe le metodologie è l'incapacità di studiare il washout dei composti in esame, una funzionalità che altri sistemi di perifusione hanno 4,27,28. Un'altra considerazione da fare quando si determina la modalità di analisi ottimale è il fatto che i sistemi fluidici utilizzano più mezzi e composti di prova rispetto ai sistemi statici. La spesa extra è ridotta al minimo con gli attuali sistemi fluidici grazie alle basse portate che il sistema può essere utilizzato.
Nel complesso, viene descritta una descrizione dettagliata dei protocolli per eseguire esperimenti con un nuovo strumento di flusso/valutazione. I dati generati con retina e RPE-coroide-sclera hanno ricapitolato i risultati ottenuti in precedenza con sistemi molto più difficili da usare (e non prontamente disponibili). È stato inoltre dimostrato che il sistema è in grado di mantenere e valutare le cellule RPE attaccate alle membrane transwell, un modello cellulare molto importante che non è stato precedentemente analizzato con i sistemi di flusso a causa della fragilità delle cellule. Le parti principali del protocollo consistono in un tempo di configurazione di 75 minuti, seguito da un periodo di equilibratura di 90 minuti e dal protocollo sperimentale che lo rende adatto all'uso di routine da parte di laboratori non specializzati nel funzionamento di sistemi fluidici. Sebbene ci siamo concentrati sulla misurazione della risposta acuta del tessuto ai composti testati, il sistema è molto adatto per confrontare tessuti provenienti da varie fonti, come modelli animali o modelli cellulari che sono stati geneticamente modificati o sottoposti a trattamenti/condizioni di prova. Inoltre, la portata dei saggi che possono essere condotti sulle frazioni in uscita è ampia e comprende metaboliti, molecole di segnalazione cellulare e ormoni/neurotrasmettitori secreti, nonché analisi multicomponente generate dalla spettrometria di massa sulle frazioni e sul tessuto.

I sistemi di perifusione hanno una lunga storia nelle scienze della vita. In particolare, per lo studio della funzione secretoria da parte delle isole, sono stati utilizzati per caratterizzare la cinetica della secrezione di insulina in risposta ai secretagoghi1. Oltre a raccogliere le frazioni di deflusso per il successivo dosaggio di ormoni e metaboliti, sono stati incorporati sensori in tempo reale, principalmente per la rilevazione del consumo di ossigeno 2,3,4. Gli sforzi diffusi per comprendere meglio i meccanismi che mediano le malattie dell'occhio sono stati limitati dalla mancanza di metodi fisiologicamente rilevanti per valutare la regolazione metabolica e la disregolazione dei vari componenti isolati dell'occhio, tra cui la retina, l'epiteliale pigmentato retinico (RPE)-coroide-sclera e le cellule RPE in coltura. I sistemi statici progettati per le cellule in coltura sono stati adattati per il tessuto5, ma il tessuto richiede un flusso per un'adeguata ossigenazione. I sistemi di flusso sono riusciti a misurare in modo accurato e riproducibile le risposte in tempo reale del tasso di consumo di ossigeno (OCR) da parte della retina e dell'RPE-coroide-sclera, e i tessuti rimangono metabolicamente stabili per più di 8 ore, consentendo protocolli altamente informativi che coinvolgono più composti di prova 4,6,7,8,9 . Ciononostante, il funzionamento dei sistemi fluidici ha storicamente richiesto un apparato su misura e personale tecnico formato in metodologie non standardizzate. Tali sistemi non sono stati adottati come metodologia standard nella maggior parte dei laboratori. Il BaroFuse è un sistema fluidico di nuova concezione che non si basa su pompe, ma piuttosto sulla pressione del gas per guidare il flusso attraverso più canali e camere tissutali (Figura 1). Ogni canale viene continuamente monitorato per l'OCR e il deflusso viene raccolto con un raccoglitore di frazioni a piastre per la successiva analisi del contenuto. È importante sottolineare che le camere di perifusione tissutale per lo strumento sono progettate per ospitare tessuti di varie geometrie e dimensioni.
Il cuore dello strumento è il sistema fluidico, in cui il flusso viene guidato da un serbatoio sigillato e pressurizzato attraverso un tubo di piccolo diametro interno (ID) (che contribuisce alla resistenza al flusso più significativa nel circuito del fluido) fino alle camere di vetro che ospitano il tessuto. La pressione al modulo serbatoio del fluido (MRM) è fornita da regolatori di bassa e alta pressione collegati a una bombola di gas contenente una miscela di gas (tipicamente 21% O 2, 5% CO 2, bilanciamento N2 ) e il serbatoio è sigillato dall'alto dal modulo camera di perifusione (PCM) che contiene i gruppi camera tissutale (TCA). La portata è controllata dalla lunghezza e dall'ID dei tubi di resistenza e dall'impostazione della pressione di un regolatore di bassa pressione. I tubi di deflusso collegati alla parte superiore delle camere tissutali trasportano il fluido in un recipiente di scarto (che viene continuamente pesato per la determinazione automatica della portata) o nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti controllata dal raccoglitore di frazioni. Il sistema di rilevamento dell'O 2 misura la durata di un colorante sensibile all'O2 dipinto all'interno di ciascuna delle camere tissutali in vetro a valle del tessuto. Queste informazioni vengono quindi utilizzate per calcolare continuamente l'OCR. L'intero sistema fluidico risiede in un involucro a temperatura controllata e il serbatoio del gas, il collettore di frazioni e il computer sono i componenti principali dello strumento (Figura 2A). Infine, il software che esegue lo strumento serve a controllarne il funzionamento (compresa la preparazione e la temporizzazione dei composti di prova iniettati, il sistema di misurazione del flusso e la temporizzazione del collettore di frazioni), nonché l'elaborazione e la rappresentazione grafica dei dati OCR e di altre misurazioni supplementari.
In questo articolo descriviamo i protocolli per l'utilizzo del sistema fluidico per perifondere e valutare l'OCR e il tasso di produzione di lattato (LPR) per vari componenti isolati dell'occhio. L'LPR è un parametro che riflette il tasso glicolitico che è altamente complementare all'OCR, dove la coppia rappresenta i due rami principali della generazione di energia dai carboidrati nella cellula10. Poiché la preparazione del tessuto e il suo caricamento nelle camere tissutali si apprendono meglio guardando la procedura, il video aiuterà a illustrare molti dei passaggi critici che vengono eseguiti durante l'impostazione e il funzionamento che non sono facilmente trasparenti dal solo testo.
La descrizione del protocollo è suddivisa in 8 sezioni che corrispondono a diverse fasi dell'esperimento (Figura 2B): 1. preparazione pre-sperimentale; 2. preparazione/equilibratura del perifusato; 3. messa a punto dello strumento; 4. equilibrio tissutale; 5. protocollo sperimentale; 6. rottura dello strumento; 7. trattamento dei dati; e 8. saggi delle frazioni di deflusso.

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		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

Molti modelli in vitro utilizzati per studiare la funzione tissutale e la biologia cellulare richiedono un flusso di terreni per fornire un'adeguata ossigenazione e condizioni cellulari ottimali necessarie per il mantenimento della funzione e della vitalità. A tal fine, abbiamo sviluppato un sistema di coltura a flusso multicanale per mantenere i tessuti e le cellule in coltura e valutare continuamente la funzione e la vitalità mediante sensori in linea e/o raccolta di frazioni di deflusso. Il sistema combina il rilevamento ottico continuo a 8 canali del tasso di consumo di ossigeno con un collettore di frazioni incorporato per misurare simultaneamente i tassi di produzione di metaboliti e secrezione ormonale. Sebbene sia in grado di mantenere e valutare un'ampia gamma di modelli di tessuti e cellule, tra cui isole, muscoli e ipotalamo, qui descriviamo i suoi principi di funzionamento e i preparati/protocolli sperimentali che abbiamo utilizzato per studiare la regolazione bioenergetica della retina isolata del topo, dell'epitelio pigmentato retinico del topo (RPE)-coroide-sclera e delle cellule RPE umane in coltura. Le innovazioni nella progettazione del sistema, come il flusso del fluido senza pompa, hanno prodotto un funzionamento notevolmente semplificato di un sistema di flusso multicanale. Vengono mostrati video e immagini che illustrano come assemblare, preparare lo strumento per un esperimento e caricare i diversi modelli di tessuto/cellula nelle camere di perifusione. Inoltre, vengono delineate e discusse le linee guida per la selezione delle condizioni per gli esperimenti specifici del protocollo e del tessuto, compresa l'impostazione del corretto rapporto portata/tessuto per ottenere condizioni di coltura coerenti e stabili e determinazioni accurate dei tassi di consumo e produzione. La combinazione di mantenimento ottimale dei tessuti e valutazione in tempo reale di più parametri produce set di dati altamente informativi che avranno una grande utilità per la ricerca nella fisiologia dell'occhio e la scoperta di farmaci per il trattamento della vista compromessa.

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

Per illustrare la risoluzione dei dati generati da componenti isolati dell'occhio, OCR e LPR sono stati misurati con tre tipi di tessuto (retina, cellule RPE-coroide-sclera e cellule RPE) seguendo un protocollo comunemente usato (il test da sforzo mitocondriale10; Figura 10, Figura 11 e Figura 12). La quantità di tessuto utilizzata per ciascun tessuto è indicata nella Tabella 1. I dati sono stati elaborati e rappresentati graficamente utilizzando il pacchetto software sviluppato per il sistema fluidico. La preparazione della retina e dell'RPE-coroide-sclera è relativamente semplice e richiede meno di 20 minuti per ogni tipo di tessuto. L'OCR è rimasto costante durante il periodo in cui sono stati iniettati i composti in esame, indicando la salute e la funzione stabili del tessuto e supportando la validità del metodo (Figura 10). Una volta convalidato per ogni tipo di tessuto, non è stato necessario eseguire controlli in cui non vengono iniettati composti di prova per ogni esperimento. Coerentemente con i dati ottenuti utilizzando i metodi di perifusione più convenzionali 6,8,13, l'OCR diminuisce in risposta all'oligomicina e aumenta l'OCR in risposta alla FCCP. I cambiamenti nell'LPR erano nella direzione opposta a quelli osservati per l'OCR: l'oligomicina aumentava l'LPR, che poi diminuiva (ma solo leggermente) in risposta all'FCCP (Figura 11). Per confrontare la significatività statistica dell'effetto di ciascun composto sequenziale, sono stati eseguiti test t (che vengono calcolati automaticamente dal software fornito con lo strumento). Poiché l'obiettivo dell'articolo era quello di descrivere come eseguire il metodo, il numero di repliche trasportate non era sempre abbastanza alto da produrre significatività statistica. In generale, tuttavia, quando il numero di repliche era 3 o più, gli effetti di FCCP e oligomicina sia sull'OCR che sull'LPR erano significativi.
Le cellule RPE non sono state precedentemente analizzate con sistemi di flusso, ma hanno risposto in modo simile a RPE-coroide-sclera (coerentemente con l'idea che una grande frazione di OCR sia dovuta alle cellule RPE; Figura 11). Questi esempi illustrativi evidenziano la capacità del sistema di mantenere la vitalità tissutale, come si evince dalla stabilità dell'OCR nei canali di controllo e dall'elevato rapporto segnale/rumore per le variazioni dell'OCR dell'entità indotta dall'oligomicina e dalla FCCP, che era superiore a 100 a 1. Inoltre, i saggi delle frazioni di deflusso possono essere utilizzati per correlare il tasso di assorbimento o produzione di un'ampia gamma di composti scambiati con il fluido extracellulare sono complementari all'OCR (in questo caso, LPR). Queste caratteristiche dello strumento hanno permesso una quantificazione accurata delle differenze caratteristiche nelle risposte tissutali tra i tipi di tessuto eseguite in parallelo. L'OCR da parte di RPE-coroide-sclera e le cellule RPE sono costantemente più sensibili all'oligomicina rispetto alla retina (Figura 11 e Figura 12), sebbene per RPE-coroide-sclera la durata dell'esposizione a FCCP non sia stata sufficiente per raggiungere lo stato stazionario. Un punto da considerare è sorto quando si utilizza il DMSO come solvente. A concentrazioni più elevate, (0,2%) il DMSO ha avuto un effetto transitorio sull'OCR da parte della retina (presumibilmente riflettendo un effetto di un cambiamento nella pressione osmotica determinato dall'effetto del DMSO sulla permeabilità della membrana).
Sulla base dell'ipotesi che la KCN inibisca completamente la respirazione per la sua azione diretta sulla citocromo c ossidasi, l'OCR al termine dell'esposizione alla KCN è impostato a 0 e tutti i valori dell'OCR sono calcolati in base alla variazione relativa al valore della KCN. L'OCR può verificarsi indipendentemente dalla catena respiratoria e dalla citocromo c ossidasi. Tuttavia, l'entità di questo contributo all'OCR complessivo non è generalmente superiore a pochi punti percentuali (dati non mostrati) e il lungo periodo di tempo in cui il tessuto è esposto a KCN assicura che i substrati di ossidasi che non fanno parte della catena di trasporto degli elettroni siano stati esauriti.
Analisi statistica I singoli esperimenti sono stati mostrati come indicato nelle figure, ma con più canali di cui è stata calcolata la media. I dati sono stati quindi rappresentati graficamente come media ± l'errore standard (SE; calcolato come SD/√n).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> Figura 1. Schema del sistema fluidico/di valutazione. I componenti principali includono l'involucro, gli elementi di controllo della temperatura, i sistemi fluidici e di camera tissutale, la regolazione della pressione del gas nello spazio di testa sopra il perifusato, il monitoraggio del collettore di frazioni/portata e i rilevatori di O2 . Abbreviazioni: MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA= Tissue Chamber Assemblies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> Figura 2. (A) Immagine dei principali componenti dello strumento. I componenti principali sono costituiti da serbatoio del gas (regolatori di pressione), involucro, collettore di frazioni e computer. (B) Diagramma di flusso sperimentale che mostra le principali categorie di passaggi e il tempo necessario per completarli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> Figura 3. Vista della Gestione record di messaggistica. La gestione record di messaggistica viene visualizzata con un inserto di gestione record di messaggistica (a sinistra) e barre di agitazione (a destra) posizionate nella parte inferiore degli inserti di gestione record di messaggistica (posizionate su ciascun lato del divisore di gestione record di messaggistica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> Figura 4. Assemblaggio dei tubi e assemblaggio dei tubi di spurgo nella gestione record di messaggistica. (A) Testare il gruppo del tubo di iniezione del composto e il gruppo del tubo di spurgo collegato alle porte dell'MRM. (B-C) Il gruppo di iniezione del composto di prova e il gruppo del tubo di spurgo (B) sono posizionati nella scanalatura nella parte anteriore dell'involucro (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> Figura 5. Accensione del regolatore di temperatura MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> Figura 6. Camere tissutali e serbatoio del gas. Posizionamento del rivelatore di O2 sul supporto del rivelatore (che supporta anche MRM e PCM) e posizionamento della fascia attorno alle alette del PCM che aiutano a fissare le camere tissutali in posizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> Figura 7. (A) Regolatori di alta e bassa pressione sul serbatoio del gas. (B-C) Tubo di spurgo. Il tubo di spurgo consente allo spazio di testa nell'MRM di liberarsi dall'aria e riempirsi di gas dal serbatoio di alimentazione. Immagini che mostrano il tubo di spurgo aperto (B) e il tubo di spurgo chiuso (C). Il gruppo di iniezione del composto di prova rimane chiuso durante il processo di spurgo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> Figura 8. Camera tissutale e configurazione del deflusso. (A) Dimensioni della membrana Transwell dopo che è stata tagliata in tre strisce di uguale larghezza. (B) Supporto multitubo di deflusso. (C) Supporto multitubo di deflusso posizionato sul labbro dell'involucro con gli adattatori per tubi vicino alle camere tissutali. (D) Immagine dei gruppi di tubi di deflusso attaccati alle camere dei tessuti. (E) Vista aerea dell'involucro senza coperchio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> Figura 9. Iniezione di composto in MRM. Iniezione di un composto di prova attraverso la porta di iniezione nell'MRM utilizzando una siringa da 5 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> Figura 10. Curve OCR e LPR in risposta ai composti di prova. OCR e LPR mediante retina isolata da topi (1 retina/canale) in risposta alla presenza o assenza (controllo) di composti in esame come indicato. Ogni curva è la media di 6 repliche di un singolo esperimento (le barre di errore sono SE; i valori p sono calcolati eseguendo test t accoppiati confrontando i valori di stato stazionario di ciascun agente di test con quelli dell'agente di test precedente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> Figura 11. Curve OCR. OCR mediante RPE-coroide-sclera e retina isolati da topi (1 retina o 2 RPE-coroide-sclera/canale) misurati in parallelo in risposta ai composti in esame come indicato. I dati sono la media delle repliche di un singolo esperimento (n = 2 e 4 rispettivamente per RPE-coroide-sclera e retina; i valori p sono calcolati eseguendo test t accoppiati confrontando i valori di stato stazionario per ciascun agente di test con quelli dell'agente di test precedente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> Figura 12. Curve OCR e LPR da celle RPE. OCR e LPR da cellule RPE attaccate a membrane transwell che sono state tagliate in strisce e caricate nelle camere di perifusione. I dati sono la media delle repliche di un singolo esperimento (n = 3, con 1,5 membrane/canale (360.000 cellule/canale); i valori p sono calcolati eseguendo test t accoppiati confrontando i valori allo stato stazionario di ciascun agente di test con quelli dell'agente di test precedente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>TESSUTO/CELLULA</td>
			<td>Importo/Canale</td>
			<td>PORTATA: mL/min</td>
		</tr><tr><td>Retina (topo)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-coroide-sclera (topo)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>Cellule RPE su membrane Transwell</td>
			<td>360.000 celle (4 strisce filtranti da 1/3)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1. Specifiche operative consigliate per i diversi tessuti.
Figura supplementare 1. Rappresentazione grafica del disegno sperimentale. Tempi e composizione dell'esposizione ai composti in esame e tempi di raccolta delle frazioni. L'incremento di concentrazione (Conc Inc) è la variazione di concentrazione da implementare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Figura 2 supplementare. Interfaccia utente all'avvio. Interfaccia utente della finestra di avvio del software di rilevamento dell'O 2 che monitora l'O2 nelle camere tissutali inserite nel PCM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Figura supplementare 3. Interfaccia utente per le impostazioni dell'esperimento. Interfaccia utente per l'immissione di informazioni sperimentali (a sinistra) e la selezione dei tempi per la raccolta delle frazioni in uscita (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Figura supplementare 4. Interfaccia utente della pagina di iniezione. Pagina di iniezione che calcola i volumi di iniezione in base alle concentrazioni desiderate del composto in esame e al volume rimasto nell'MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Fascicolo supplementare 1: Metodi per la preparazione dei campioni di tessuto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE

L'analisi in tempo reale dei tessuti vivi fornisce importanti dati funzionali e meccanicistici. Questo documento descrive i protocolli e le variabili critiche per garantire una generazione accurata e riproducibile di dati da parte di un nuovo sistema fluidico multicanale senza pompe che mantiene e valuta un'ampia gamma di modelli di tessuti e cellule.

Mantenimento e valutazione di vari tipi di tessuti e cellule dell'occhio utilizzando un nuovo sistema di fluidica senza pompa

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

I dispositivi più comuni utilizzati per misurare il consumo di ossigeno non supportano la raccolta simultanea delle frazioni in uscita. È fondamentale analizzare anche il deflusso del test per correlare il metabolismo con la funzione tissutale. La tecnologia di misurazione di entrambi può valutare meglio i meccanismi cellulari che mediano la funzione tissutale e la malattia.La sfida principale nella misurazione del consumo di ossigeno e dei tessuti vivi è fornire ossigeno adeguato per mantenere la vitalità e la funzione dei tessuti. Il modo migliore per farlo è con i sistemi di flusso. L'utilizzo della pressione del gas al posto delle pompe peristaltiche standard semplifica notevolmente la procedura ed elimina anche la formazione di bolle.L'utilità di una misurazione metabolica è pari alla sua capacità di quantificare e riprodurre i risultati. Il nostro protocollo sfrutta la combinazione di una portata controllata con precisione con un rilevamento stabile dell'ossigeno disciolto sia in entrata che in uscita. Questo approccio è in grado di risolvere in modo riproducibile le variazioni nel consumo di ossigeno anche solo di pochi punti percentuali.I processi biochimici che mediano la funzione retinica sono il risultato dell'interazione metabolica tra i vari tessuti dell'occhio. La capacità del nostro sistema di flusso di valutare più tipi di tessuto con geometrie diverse facilita lo studio delle proprietà intrinseche uniche di ciascun tipo di cellula e delle loro funzioni coordinate. Molte malattie che affliggono l'occhio sono causate da vie metaboliche e segnali alterati.Ci stiamo concentrando sulla misurazione del consumo di ossigeno e del rilascio di sottoprodotti metabolici da parte dei tessuti oculari al fine di caratterizzare, comprendere e trattare lo sviluppo di malattie e degenerazioni retiniche.