Name: Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00
Duration: 2 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) e R01 EY006641, R01 EY017863 e R21 EY032597 (J.B.H.).

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol>
	<li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro:+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin.">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li><li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells.">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li><li>Sweet, I. 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I.R.S., M.G. e K.B. têm laços financeiros com a EnTox Sciences, Inc. Todos os outros autores declaram não haver conflitos de interesse.

Devido à importância da bioenergética em todos os aspectos da função celular e manutenção de vários componentes do olho, há uma necessidade crítica de métodos para estudar sua regulação. Em particular, a retina neural e o EPR dependem do metabolismo tanto para a geração de energia quanto para a sinalização intra e intercelular14,15,16,17. Devido à sua alta capacidade oxidativa, os tecidos isolados do olho não são bem mantidos em condições estáticas18,19 e, portanto, o estudo de componentes isolados do olho requer sistemas de fluxo que possam manter e avaliar processos metabólicos. O sistema fluídico foi desenvolvido para gerar dados de OCR e LPR de uma ampla gama de tipos de tecidos e neste trabalho apresentamos protocolos detalhados que produziram ótimos resultados.
O principal determinante para a geração de dados robustos usando o sistema de fluxo inclui o pré-equilíbrio do meio/tampão à base de CO2 a 39 °C (para garantir que o perifusato não seja supersaturado com gás dissolvido que desgaseificado durante o experimento). Em particular, o meio ou tampão KRB armazenado a 4 °C será supersaturado em relação a 37 °C e desgaseificado durante o experimento se os tempos de pré-equilíbrio forem insuficientes. Além disso, o tecido carregado nas câmaras teciduais não deve ser traumatizado pelo isolamento inadequado do tecido devido ao rasgo ou separação incompleta do tecido, ou pela exposição do tecido em baixa quantidade de tampão à base de bicarbonato ao ar atmosférico por muito tempo. O controle de temperatura, a estabilidade do fluxo e a confiabilidade da detecção de O2 têm pouca variabilidade e esses fatores não contribuem significativamente para a taxa de falha.
O instrumento possui oito canais de fluxo/câmaras teciduais que funcionam simultaneamente e que são abastecidos com perifusato de dois reservatórios, quatro câmaras de tecido para cada reservatório. Para obter os cursos de tempo mais precisos do OCR, as curvas cinéticas são corrigidas na linha de base por câmaras que não são carregadas com tecido. Assim, um protocolo experimental típico envolveria dois grupos de três câmaras teciduais. Os protocolos em geral se enquadram em duas categorias: uma são os diferentes protocolos de compostos de teste de cada lado (por exemplo, droga/veículo de um lado do MRM e apenas veículo do outro); o segundo é o mesmo protocolo de injeção de composto de teste em ambos os lados da MRM, mas diferentes modelos de tecido ou tecido em cada lado da MRM. Neste trabalho, os efeitos da oligomicina e do FCCP na retina foram comparados com OCR por tecidos que não foram expostos a nenhum composto teste, e dois tecidos foram avaliados concomitantemente sob o mesmo protocolo e condições para identificar o comportamento tecido-específico. Este último foi ilustrado neste estudo mostrando aumento da faixa dinâmica da taxa metabólica por PSE-coróide-esclera em relação à retina em paralelo no mesmo experimento. Outros relatos descreveram uma gama mais ampla de desenhos de estudo, incluindo a medição dos efeitos variando os níveis de O2 sobre OCR e LPR, e dependências de concentração de combustíveis, drogas e toxinas20,21. Além disso, embora tenhamos limitado a análise das frações de escoamento à medida do lactato e ao cálculo do RLF, o conteúdo de informação de um experimento aumenta muito se forem ensaiados múltiplos compostos e classes de compostos nas frações de escoamento, como hormônios, neurotransmissores, sinais celulares e metabólitos que podem sair das células20,22, 23º.
O carregamento de retina isolada ou EPR-coróide-esclera é simples e, uma vez isolados, esses tecidos são simplesmente colocados no topo das câmaras de tecido com pinça e deixados afundar até a frita. Células de EPR cultivadas em pastilhas de filtro desenvolvem polarização apropriada e marcadores de maturidade de EPR após 4-8 semanas em cultura. Não é viável remover o EPR para análise de células vivas uma vez aderido à membrana de transwell, se quisermos manter a maturidade e a polarização do EPR24. A câmara de perifusão pode acomodar tiras da membrana transwell que são cortadas com bisturi enquanto submersas em tampão e rapidamente inseridas nas câmaras de tecido. Embora as tiras filtrantes de corte tenham sido colocadas em um sistema estático24, nenhum outro método fluídico para avaliar esses importantes tipos celulares está disponível. As respostas das células do EPR foram rápidas e mais dinâmicas do que a retina ou a EPR-coróide-esclera, provavelmente devido em parte ao acesso imediato dos aspectos apicais e basais das células do EPR configurados como uma monocamada na inserção da membrana.
Outro fator para garantir que os dados tenham o maior sinal para ruído é selecionar a proporção ideal de tecido carregado nas câmaras de perifusão em relação à taxa de fluxo. Muito pouco tecido em relação à taxa de fluxo resulta em uma diferença de concentração de O2 dissolvido entre entrada e saída que é muito pequena e difícil de medir de forma confiável. Em contraste, se o fluxo é muito lento, então a concentração de O2 torna-se tão baixa que o tecido é afetado por hipóxia. No entanto, o fluxo de líquido impulsionado pela pressão do gás pode ser mantido em taxas de fluxo de até 5 mL/min, exigindo apenas pequenas quantidades de tecido para medições precisas de OCR e LPR. Nos experimentos aqui mostrados, foram utilizados cerca de 20 mL/min/canal, o que foi adequado para uma retina, duas escleras de EPR ou 360.000 células de EPR. Para minimizar os efeitos do sistema que retardam e dispersam a exposição do tecido ao composto teste injetado, vários tamanhos das câmaras de tecido são fornecidos, de modo que a quantidade de tecido (e a taxa de fluxo) seja combinada com o tamanho apropriado da câmara.
Os dados das análises apresentadas neste trabalho foram representados de duas maneiras: magnitude absoluta em relação à taxa, ou mudanças fracionárias em relação a um estado estacionário ou linha de base. O foco foi a ilustração da mensuração das respostas aos compostos de teste. No entanto, o sistema fluídico é adequado para avaliar e comparar os efeitos do tratamento tecidual antes da análise de perifusão, como modificações genéticas. Testar se um tratamento é diferente do controle é mais robusto se os efeitos do tratamento sobre as respostas normalizadas dos compostos de teste forem analisados. Se a análise requer magnitudes absolutas, o poder estatístico das análises de espécimes pré-tratados é maximizado se sua avaliação e controles forem realizados no mesmo experimento de perfusão.
Com exceção do agitador, todas as peças que entram em contato com o líquido são fornecidas pelo fabricante como consumíveis e foram esterilizadas. Essas peças não devem ser reutilizadas, pois experimentos ocasionalmente serão perdidos devido à limpeza incompleta e superfícies contaminadas. O sistema no início da configuração é estéril. No entanto, meios são adicionados à MRM, e o tecido é carregado nas câmaras em condições não estéreis. Medimos OCR no sistema que é montado com peças estéreis, mas onde o experimento em si é realizado em condições não estéreis. Leva cerca de 14 h para que as bactérias se acumulem a ponto de ter OCR mensurável (resultados não publicados). Se forem usados protocolos com menos de 10 h ou mais, o acúmulo de bactérias e quaisquer efeitos devido a elas serão insignificantes.
Muitos pesquisadores utilizam instrumentos que são projetados para medir OCR sob incubação estática de uma monocamada de células com um rendimento relativamente alto25,26. Em contraste, o instrumento fluídico que testamos e descrevemos neste trabalho mantém o tecido, garantindo a liberação adequada deO2, que é crítica para as maiores distâncias de difusão presentes nos espécimes teciduais. Além disso, é capaz de coletar frações permitindo a avaliação de múltiplos parâmetros em paralelo com o OCR, o que aumenta muito a capacidade de estudar relações entre eles. Finalmente, as concentrações de gás dissolvido (como O 2 e CO 2) podem ser controladas, aumentando a duração dos experimentos com meios à base de bicarbonato e tampão, permitindo ao usuário estudar os efeitos do O2. Deve-se ressaltar que uma limitação para ambas as metodologias é a impossibilidade de estudar o washout dos compostos de teste, funcionalidade que outros sistemas de perifusão possuem4,27,28. Outra consideração ao determinar a modalidade ótima de análise é o fato de que os sistemas fluídicos usam mais meios e compostos de teste do que os sistemas estáticos. O gasto extra é minimizado com os sistemas fluídicos atuais, devido às baixas taxas de vazão que o sistema pode ser usado.
De modo geral, descreve-se uma descrição detalhada dos protocolos para a realização de experimentos com um novo instrumento de fluxo/avaliação. Os dados gerados com retina e PSE-coróide-esclera recapitularam resultados anteriores obtidos com sistemas muito mais difíceis de usar (e não prontamente disponíveis). Também foi demonstrado que o sistema pode manter e avaliar células de EPR aderidas a membranas transwell, um modelo celular muito importante que não foi previamente analisado com sistemas de fluxo devido à fragilidade das células. As partes principais do protocolo consistem em um tempo de setup de 75 min, seguido por um período de equilíbrio de 90 min e o protocolo experimental tornando-o adequado para uso rotineiro por laboratórios não especializados na operação de sistemas fluídicos. Embora tenhamos nos concentrado em medir a resposta aguda do tecido a compostos de teste, o sistema é muito adequado para comparar tecidos de várias fontes, como modelos animais ou modelos de células que foram geneticamente alterados ou submetidos a tratamentos/condições de teste. Além disso, o escopo de ensaios que podem ser conduzidos sobre as frações de saída são abrangentes e incluem metabólitos, moléculas de sinalização celular e hormônios/neurotransmissores secretados, bem como análises multicomponentes geradas por espectrometria de massa nas frações, bem como no tecido.

Os sistemas de perifusão têm uma longa história nas ciências da vida. Em particular, para o estudo da função secretora pelas ilhotas, elas têm sido utilizadas para caracterizar a cinética de secreção de insulina em resposta aos secretagogos1. Além da coleta das frações de escoamento para posterior dosagem de hormônios e metabólitos, sensores em tempo real têm sido incorporados, predominantemente para a detecção do consumo de oxigênio 2,3,4. Esforços difundidos para melhor compreender os mecanismos mediadores de doenças do olho têm sido limitados pela falta de métodos fisiologicamente relevantes para avaliar a regulação metabólica e a desregulação dos vários componentes isolados do olho, incluindo a retina, o epitélio pigmentado da retina (EPR)-coróide-esclera e as células do EPR cultivadas. Sistemas estáticos projetados para células cultivadas foram adaptados para o tecido5, mas o tecido requer fluxo para oxigenação adequada. Os sistemas de fluxo têm sido bem-sucedidos em medir com precisão e reprodutibilidade as respostas em tempo real na taxa de consumo de oxigênio (OCR) pela retina e PSE-coróide-esclera, e os tecidos permanecem metabolicamente estáveis por mais de 8 h, permitindo protocolos altamente informativos envolvendo múltiplos compostos de teste 4,6,7,8,9 . No entanto, a operação de sistemas fluídicos tem historicamente exigido um aparato sob medida e pessoal técnico treinado em metodologias não padronizadas. Tais sistemas não têm sido adotados como metodologia padrão na maioria dos laboratórios. O BaroFuse é um sistema fluídico recém-desenvolvido que não depende de bombas, mas sim da pressão do gás para conduzir o fluxo através de múltiplos canais e câmaras de tecido (Figura 1). Cada canal é continuamente monitorado para OCR, e o fluxo de saída é coletado com um coletor de fração baseado em placa para posterior ensaio de conteúdo. É importante ressaltar que as câmaras de perifusão de tecido para o instrumento são projetadas para acomodar tecidos de várias geometrias e tamanhos.
O coração do instrumento é o sistema fluídico, onde o fluxo é conduzido de um reservatório selado e pressurizado através de tubos de pequeno diâmetro interno (ID) (contribuindo com a resistência ao fluxo mais significativa no circuito do fluido) até as câmaras de tecido de vidro que abrigam o tecido. A pressão para o módulo reservatório do meio (MRM) é fornecida por reguladores de baixa e alta pressão conectados a um cilindro de gás contendo uma mistura de gases (tipicamente 21% O 2, 5% CO 2, balanço N2), e o reservatório é selado a partir do topo pelo módulo da câmara de perifusão (PCM) que contém os conjuntos da câmara de tecido (TCAs). A vazão é controlada pelo comprimento e ID dos tubos de resistência e pelo ajuste de pressão de um regulador de baixa pressão. Os tubos de saída conectados ao topo das câmaras de tecido fornecem fluido para um recipiente de resíduos (que é continuamente pesado para determinação automática da taxa de fluxo) ou para poços de uma placa de 96 poços controlada pelo coletor de fração. O sistema de detecção O 2 mede a vida útil de um corante sensível ao O2 pintado no interior de cada uma das câmaras de tecido de vidro a jusante do tecido. Essas informações são usadas para calcular continuamente o OCR. Todo o sistema fluídico reside em um gabinete com temperatura controlada e o tanque de gás, o coletor de frações e o computador são os principais componentes do instrumento (Figura 2A). Finalmente, o software que executa o instrumento serve para controlar sua operação (incluindo a preparação e o tempo de compostos de teste injetados, o sistema de medição de vazão e o tempo do coletor de fração), bem como processar e representar graficamente os dados de OCR e outras medições suplementares.
Neste trabalho descrevemos os protocolos de utilização do sistema fluídico para perifundir e avaliar OCR e taxa de produção de lactato (RLF) para vários componentes isolados do olho. O RLF é um parâmetro que reflete a taxa glicolítica altamente complementar ao OCR, onde o par responde pelos dois principais ramos de geração de energia a partir de carboidratos na célula10. Como a preparação do tecido e o carregamento nas câmaras de tecido é melhor aprendido assistindo ao procedimento, o vídeo ajudará a ilustrar várias das etapas críticas que são realizadas durante a configuração e operação que não são facilmente transmitidas apenas pelo texto.
A descrição do protocolo é dividida em 8 seções que correspondem a diferentes fases do experimento (Figura 2B): 1. preparação pré-experimental; 2. preparação/equilíbrio do perifusato; 3. criação de instrumento; 4. equilíbrio tecidual; 5. protocolo experimental; 6. quebra de instrumento; 7. tratamento de dados; e 8º. ensaios de frações de escoamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

Muitos modelos in vitro usados para investigar a função tecidual e a biologia celular requerem um fluxo de meios para fornecer oxigenação adequada e condições celulares ótimas necessárias para a manutenção da função e viabilidade. Para este fim, desenvolvemos um sistema de cultura de fluxo multicanal para manter tecidos e células em cultura e avaliar continuamente a função e viabilidade por sensores em linha e/ou coleta de frações de escoamento. O sistema combina detecção óptica contínua de 8 canais da taxa de consumo de oxigênio com um coletor de fração integrado para medir simultaneamente as taxas de produção de metabólitos e secreção de hormônios. Embora seja capaz de manter e avaliar uma ampla gama de modelos de tecidos e células, incluindo ilhotas, músculo e hipotálamo, aqui descrevemos seus princípios operacionais e as preparações/protocolos experimentais que usamos para investigar a regulação bioenergética da retina isolada de camundongos, epitélio pigmentado da retina de camundongos (EPR)-esclera coroide e células de EPR humanas cultivadas. Inovações no projeto do sistema, como o fluxo de fluido sem bomba, produziram uma operação muito simplificada de um sistema de fluxo multicanal. São mostrados vídeos e imagens que ilustram como montar, preparar o instrumento para um experimento e carregar os diferentes modelos tecido/célula nas câmaras de perifusão. Além disso, diretrizes para a seleção de condições para experimentos específicos de protocolos e tecidos são delineadas e discutidas, incluindo o estabelecimento da relação correta entre fluxo e tecido para obter condições de cultura consistentes e estáveis e determinações precisas das taxas de consumo e produção. A combinação de manutenção tecidual ideal e avaliação em tempo real de múltiplos parâmetros produz conjuntos de dados altamente informativos que terão grande utilidade para a pesquisa na fisiologia do olho e descoberta de drogas para o tratamento da visão prejudicada.

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

Para ilustrar a resolução dos dados gerados a partir de componentes isolados do olho, OCR e RLF foram medidos com três tipos de tecido (retina, EPR-esclera coroide e células do EPR) seguindo um protocolo comumente utilizado (teste de estresse mitocondrial10; Figura 10, Figura 11 e Figura 12). A quantidade de tecido utilizada para cada tecido é mostrada na Tabela 1. Os dados foram processados e grafados utilizando-se o software desenvolvido para o sistema fluídico. A preparação da retina e da EPR-coróide-esclera é relativamente simples e leva menos de 20 min para cada tipo de tecido. OCR foi constante durante o tempo em que os compostos teste foram injetados, indicando estabilidade na saúde e função do tecido e apoiando a validade do método (Figura 10). Uma vez validado para cada tipo de tecido, não encontramos necessidade de executar controles onde nenhum composto de teste é injetado para cada experimento. Consistente com os dados obtidos usando métodos de perifusão mais convencionais 6,8,13, a OCR diminuiu na resposta à oligomicina e aumentou a OCR em resposta à FCCP. As alterações no RLF foram na direção oposta àquelas observadas para o OCR: a oligomicina aumentou o RLF, que então diminuiu (mas apenas ligeiramente) em resposta ao FCCP (Figura 11). Para comparar a significância estatística do efeito de cada composto de teste sequencial, foram realizados testes t (que são calculados automaticamente pelo software que acompanha o instrumento). Como o objetivo do trabalho foi descrever como realizar o método, o número de repetições carregadas nem sempre foi alto o suficiente para produzir significância estatística. Em geral, porém, quando o número de réplicas foi 3 ou mais, os efeitos do FCCP e da oligomicina sobre OCR e LPR foram significativos.
As células do EPR não foram previamente analisadas com sistemas de fluxo, mas responderam de forma semelhante ao EPR-coróide-esclera (consistente com a visão de que uma grande fração de OCR é devida às células do EPR; Gráfico 11). Esses exemplos ilustrativos destacam a capacidade do sistema em manter a viabilidade tecidual, refletida pela estabilidade do OCR nos canais de controle, e a alta relação sinal/ruído para mudanças no OCR da magnitude induzida pela oligomicina e FCCP, que foi superior a 100 para 1. Além disso, ensaios de frações de escoamento podem ser usados para correlacionar a taxa de captação ou produção de uma ampla gama de compostos trocados com o fluido extracelular são complementares ao OCR (neste caso, o LPR). Essas características do instrumento permitiram quantificar com precisão as diferenças características nas respostas teciduais entre os tipos teciduais realizadas em paralelo. OCR por RPE-coróide-esclera e células RPE são consistentemente mais sensíveis à oligomicina do que retina (Figura 11 e Figura 12), embora para o RPE-coróide-esclera a duração da exposição ao FCCP não tenha sido longa o suficiente para atingir o estado de equilíbrio. Um ponto a ser considerado surgiu ao usar DMSO como solvente. Em concentrações mais elevadas, (0,2%) DMSO teve um efeito transitório sobre OCR pela retina (presumivelmente refletindo um efeito de uma mudança na pressão osmótica provocada pelo efeito do DMSO na permeabilidade da membrana).
Com base na suposição de que a KCN inibe completamente a respiração por sua ação direta sobre a citocromo c oxidase, OCR no final da exposição KCN é definido como 0 e todos os valores de OCR são calculados com base na mudança em relação ao valor KCN. A OCR pode ocorrer independentemente da cadeia respiratória e da citocromo c oxidase. No entanto, a magnitude dessa contribuição para o OCR geral geralmente não é mais do que alguns por cento (dados não mostrados) e o longo período de tempo que o tecido é exposto ao KCN garante que os substratos de oxidases que não fazem parte da cadeia de transporte de elétrons tenham sido esgotados.
Análise estatística Experimentos únicos foram mostrados como indicado nas figuras, mas com múltiplos canais que foram medidos. Os dados foram então grafados como a média ± erro padrão (EP; calculado como DP/√n).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> Gráfico 1. Esquema da fluídica/sistema de avaliação. Os principais componentes incluem o invólucro, elementos de controle de temperatura, sistemas fluídicos e de câmara de tecido, regulação da pressão do gás no espaço da cabeça acima do perfusato, monitoramento da taxa de fluxo e coletor de frações/vazão e detectores de O2 . Abreviações: MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> Gráfico 2. (A) Imagem dos principais componentes do instrumento. Os principais componentes consistem em tanque de gás (reguladores de pressão), invólucro, coletor de fração e computador. (B) Fluxograma experimental mostrando as principais categorias de etapas e o tempo necessário para completá-las. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> Gráfico 3. Vista do MRM. O MRM é mostrado com uma inserção MRM (esquerda) e barras de agitação (direita) colocadas na parte inferior das inserções MRM (colocadas em cada lado do Divisor MRM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> Gráfico 4. Montagem de tubulação e montagem de tubulação de purga no MRM. (A) Conjunto de tubos de injeção compostos de teste e conjunto de tubos de purga conectados às portas do MRM. (B-C) O conjunto de injeção do composto de teste e o conjunto da tubulação de purga (B) são colocados no sulco na frente do compartimento (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> Gráfico 5. Ligando o controlador de temperatura MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> Gráfico 6. Câmaras de tecidos e tanque de gás. Posicionamento do detector O2 no suporte do detector (que também suporta o MRM e PCM) e colocação da banda ao redor das aletas do PCM que ajudam a fixar as câmaras de tecido no lugar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> Figura 7. (A) Reguladores de alta e baixa pressão no tanque de gás. (B-C) Tubo de purga. O tubo de purga permite que o headspace no MRM limpe o ar e se encha com gás do tanque de alimentação. Imagens mostrando tubo de purga aberto (B) e tubo de purga fechado (C). O conjunto de injeção do composto de teste permanece fechado durante o processo de purga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> Gráfico 8. Câmara de tecidos e configuração do escoamento. (A) Dimensões da membrana Transwell depois de cortada em três tiras de igual largura. (B) Suporte multitubo de saída. (C) Suporte multitubo de saída posicionado no lábio do compartimento com os adaptadores de tubulação próximos às câmaras de tecido. (D) Imagem dos conjuntos de tubos de saída fixados às câmaras de tecido. (E) Vista aérea do recinto sem a tampa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> Gráfico 9. Injeção de composto em MRM. Injetar um composto de teste através da porta de injeção no MRM usando uma seringa de 5 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> Figura 10. Curvas de OCR e LPR em resposta aos compostos de teste. OCR e LPR por retina isolada de camundongos (1 retina/canal) em resposta à presença ou ausência (controle) de compostos de teste conforme indicado. Cada curva é a média de 6 réplicas de um único experimento (as barras de erro são SE; os valores de p são calculados realizando testes t pareados comparando os valores de estado estacionário de cada agente de teste com os do agente de teste anterior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> Gráfico 11. Curvas de OCR. OCR por RPE-coróide-esclera e retina isolada de camundongos (1 retina ou 2 RPE-coróide-esclera/canal) medidos em paralelo em resposta aos compostos de teste conforme indicado. Os dados são a média de réplicas de um único experimento (n = 2 e 4 para PSE-coróide-esclera e retina, respectivamente; os valores de p são calculados por meio da realização de testes t pareados comparando os valores de estado estacionário de cada agente de teste com os do agente de teste anterior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> Gráfico 12. Curvas de OCR e LPR de células de EPR. OCR e LPR de células de EPR aderidas a membranas transwell que foram cortadas em tiras e carregadas nas câmaras de perifusão. Os dados são a média de réplicas de um único experimento (n = 3, com 1,5 membranas/canal (360.000 células/canal); os valores de p são calculados por meio da realização de testes t pareados comparando os valores de estado estacionário de cada agente de teste com os do agente de teste anterior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>TECO/CÉLULA</td>
			<td>Quantidade/Canal</td>
			<td>VAZÃO: mL/min</td>
		</tr><tr><td>Retina (rato)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-coróide-esclera (rato)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>Células de EPR em Membranas Transwell</td>
			<td>360.000 células (4 x 1/3 tiras de filtro)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1. Especificações operacionais recomendadas para diferentes tecidos.
Figura suplementar 1. Representação gráfica do desenho experimental. Tempo e composição da exposição aos compostos de teste e tempo de coleta da fração. Incremento de concentração (Conc Inc) é a mudança de concentração a ser implementada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 2. Interface do usuário na inicialização. UI da janela de inicialização do software de detecção O 2 que monitora o O2 nas câmaras de tecido inseridas no PCM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 3. Interface do usuário para configurações de experimento. UI para inserir informações experimentais (esquerda) e selecionar tempos para coleta de frações de escoamento (direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 4. Interface do usuário da página de injeção. Página de injeção que calcula os volumes de injeção com base nas concentrações desejadas do composto de teste e no volume deixado no MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 1: Métodos para preparação de amostras de tecido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE

A análise em tempo real de tecidos vivos fornece dados funcionais e mecanísticos importantes. Este artigo descreve os protocolos e variáveis críticas para garantir a geração precisa e reprodutível de dados por um novo sistema fluídico multicanal livre de bombas que mantém e avalia uma ampla gama de modelos de tecidos e células.

Manutenção e avaliação de vários tipos de tecidos e células do olho usando um novo sistema fluídico sem bomba

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

Os dispositivos mais comuns usados para medir o consumo de oxigênio não suportam a coleta simultânea de frações de saída. É fundamental também testar o fluxo de saída para correlacionar o metabolismo com a função do tecido. A medição da tecnologia pode avaliar melhor os mecanismos celulares que mediam a função tecidual e a doença.O principal desafio na medição do consumo de oxigênio e dos tecidos vivos é fornecer oxigênio adequado para manter a viabilidade e a função dos tecidos. Isso é melhor realizado com sistemas de fluxo. A utilização da pressão do gás em vez das bombas peristálticas padrão simplifica muito o procedimento e também elimina a formação de bolhas.A utilidade de uma medida metabólica é tão boa quanto sua capacidade de quantificar e reproduzir os resultados. Nosso protocolo aproveita a combinação de taxa de fluxo precisamente controlada com detecção estável de tempo de vida de oxigênio dissolvido tanto na entrada quanto na saída. Essa abordagem pode resolver de forma reprodutível mudanças no consumo de oxigênio de apenas alguns por cento.Os processos bioquímicos que mediam a função retiniana são o resultado da interação metabólica entre vários tecidos do olho. A capacidade do nosso sistema de fluxo de avaliar vários tipos de tecidos com geometrias diversas facilita o estudo das propriedades intrínsecas únicas de cada tipo celular e suas funções coordenadas. Muitas doenças que afligem o olho são causadas por vias metabólicas prejudicadas e sinalização.Estamos nos concentrando em medir o consumo de oxigênio e a liberação de subprodutos metabólicos pelos tecidos oculares, a fim de caracterizar, entender e tratar o desenvolvimento de doenças e degeneração da retina.