Name: Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00
Duration: 2 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Esta investigación fue financiada por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, Fundación BrightFocus, Investigación para Prevenir la Ceguera (J.R.C.) y R01 EY006641, R01 EY017863 y R21 EY032597 (J.B.H.).

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol>
	<li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro:+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin.">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li><li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells.">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li><li>Sweet, I. 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I.R.S., M.G. y K.B. tienen vínculos financieros con EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), el fabricante/distribuidor del sistema de perifusión BaroFuse descrito en este estudio. Todos los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.

Debido a la importancia de la bioenergética en todos los aspectos de la función celular y el mantenimiento de varios componentes del ojo, existe una necesidad crítica de métodos para estudiar su regulación. En particular, la retina neural y el EPR dependen del metabolismo tanto para la generación de energía como para la señalización intra e intercelular14,15,16,17. Debido a su alta capacidad oxidativa, los tejidos aislados del ojo no están bien mantenidos en condiciones estáticas18,19 y, por lo tanto, el estudio de los componentes aislados del ojo requiere sistemas de flujo que puedan mantener y evaluar los procesos metabólicos. El sistema de fluídica se desarrolló para generar datos de OCR y LPR de una amplia gama de tipos de tejidos y en este artículo presentamos protocolos detallados que produjeron resultados óptimos.
El principal determinante para generar datos robustos utilizando el sistema de flujo incluye el preequilibrio del medio/tampón basado en CO2 a 39 °C (para garantizar que el perifusado no se sobresature con gas disuelto que se desgasificaría durante el experimento). En particular, los medios o tampones KRB almacenados a 4 °C se sobresaturarán en relación con 37 °C y se desgasificarán durante el experimento si los tiempos de preequilibrio son insuficientes. Además, el tejido cargado en las cámaras tisulares no debe estar traumatizado por un aislamiento inadecuado del tejido debido a un desgarro o separación incompleta del tejido, o por la exposición del tejido en baja cantidad de tampón a base de bicarbonato al aire atmosférico durante demasiado tiempo. El control de la temperatura, la estabilidad del flujo y la confiabilidad de la detección de O2 tienen poca variabilidad y estos factores no contribuyen significativamente a la tasa de fallas.
El instrumento tiene ocho canales de flujo/cámaras de tejido que funcionan simultáneamente y que se alimentan de perifusato desde dos depósitos, cuatro cámaras de tejido para cada depósito. Para obtener los cursos de tiempo más precisos de OCR, las curvas cinéticas se corrigen desde la línea de base mediante cámaras que no están cargadas con tejido. Por lo tanto, un protocolo experimental típico involucraría dos grupos de tres cámaras de tejido. Los protocolos en general se dividen en dos categorías: una son los diferentes protocolos de compuestos de prueba en cada lado (por ejemplo, medicamento/vehículo en un lado del MRM, y solo vehículo en el otro); el segundo es el mismo protocolo de inyección de compuesto de prueba en ambos lados de la MRM, pero diferente tejido o modelo de tejido en cada lado de la MRM. En este artículo, los efectos de la oligomicina y la FCCP en la retina se compararon con el OCR por tejido que no fue expuesto a ningún compuesto de prueba, y dos tejidos se evaluaron concomitantemente bajo el mismo protocolo y condiciones para identificar el comportamiento específico del tejido. Esto último se ilustró en este estudio al mostrar un aumento del rango dinámico de la tasa metabólica por EPR-coroides-esclerótica en relación con la retina en paralelo en el mismo experimento. Otros informes han descrito una gama más amplia de diseños de estudio que incluyen la medición de los efectos de la variación de los niveles deO2 en OCR y LPR, y las dependencias de la concentración de combustibles, drogas y toxinas20,21. Además, aunque hemos limitado el análisis de las fracciones de salida a la medición del lactato y al cálculo de la LPR, el contenido de información de un experimento aumenta considerablemente si se analizan múltiples compuestos y clases de compuestos en las fracciones de salida, como hormonas, neurotransmisores, señales celulares y metabolitos que pueden salir de las células20,22, Artículo 23.
La carga de la retina aislada o EPR-coroides-esclerótica es sencilla, y una vez aislados, estos tejidos simplemente se colocan en la parte superior de las cámaras tisulares con fórceps y se dejan hundir hasta la frita. Las células del EPR cultivadas en insertos filtrantes desarrollan una polarización adecuada y marcadores de madurez del EPR después de 4-8 semanas en cultivo. No es factible extraer el EPR para el análisis de células vivas una vez adherido a la membrana transpocillo, si se quiere mantener la madurez y la polarización del EPR24. La cámara de perifusión puede acomodar tiras de la membrana transwell que se cortan con un bisturí mientras se sumergen en tampón y se insertan rápidamente en las cámaras de tejido. Aunque el corte de tiras filtrantes se ha colocado en un sistema estático24, no se dispone de ningún otro método fluídico para evaluar estos importantes tipos de células. Las respuestas de las células del EPR fueron rápidas y más dinámicas que las de la retina o la esclerótica coroidea del EPR, probablemente en parte debido al acceso inmediato de los aspectos apical y basal de las células del EPR configuradas como una monocapa en el inserto de la membrana.
Otro factor para garantizar que los datos tengan la señal más alta en relación con el ruido es seleccionar la proporción óptima de tejido cargado en las cámaras de perifusión en relación con la velocidad de flujo. Muy poco tejido en relación con la velocidad de flujo da como resultado una diferencia de concentración de O2 disuelto entre el flujo de entrada y el flujo de salida que es muy pequeña y difícil de medir de manera confiable. Por el contrario, si el flujo es demasiado lento, la concentración deO2 se vuelve tan baja que el tejido se ve afectado por la hipoxia. No obstante, el flujo de líquido impulsado por la presión del gas se puede mantener a caudales de hasta 5 mL/min, lo que requiere solo pequeñas cantidades de tejido para mediciones precisas de OCR y LPR. En los experimentos que se muestran aquí, se utilizaron alrededor de 20 ml/min/canal, lo que fue adecuado para una retina, dos escleróticas coroideas del EPR o 360.000 células del EPR. Para minimizar los efectos del sistema que retrasan y dispersan la exposición del tejido al compuesto de prueba inyectado, se suministran múltiples tamaños de cámaras de tejido, de modo que la cantidad de tejido (y el caudal) coincida con el tamaño adecuado de la cámara.
Los datos de los análisis mostrados en este artículo se representaron de dos maneras: magnitud absoluta con respecto a la tasa, o cambios fraccionarios en relación con un estado estacionario o línea de base. La atención se centró en la ilustración de la medición de las respuestas a los compuestos de ensayo. Sin embargo, el sistema fluídico es adecuado para evaluar y comparar los efectos del tratamiento tisular antes del análisis de perifusión, como las modificaciones genéticas. La comprobación de si un tratamiento es diferente del control es más sólida si se analizan los efectos del tratamiento sobre las respuestas normalizadas de los compuestos de prueba. Si el análisis requiere magnitudes absolutas, el poder estadístico de los análisis de las muestras pretratadas se maximiza si su evaluación y controles se realizan en el mismo experimento de perifusión.
A excepción del agitador, todas las piezas que entran en contacto con el líquido son suministradas por el fabricante como consumibles y han sido esterilizadas. Estas piezas no deben reutilizarse, ya que los experimentos se perderán ocasionalmente debido a una limpieza incompleta y superficies contaminadas. El sistema al comienzo de la configuración es estéril. Sin embargo, se agregan medios al MRM y el tejido se carga en las cámaras en condiciones no estériles. Hemos medido el OCR en el sistema que se ensambla con piezas que son estériles, pero donde el experimento en sí se lleva a cabo en condiciones no estériles. Las bacterias tardan unas 14 horas en acumularse hasta el punto de tener un OCR medible (resultados no publicados). Si se utilizan protocolos de menos de 10 h más o menos, la acumulación de bacterias y los efectos debidos a ellas serán insignificantes.
Muchos investigadores utilizan instrumentos diseñados para medir la OCR bajo incubación estática de una monocapa de células con un rendimiento relativamente alto25,26. Por el contrario, el instrumento de fluídica que hemos probado y descrito en este artículo mantiene el tejido asegurando un suministro adecuado deO2, que es fundamental para las mayores distancias de difusión que están presentes en las muestras de tejido. Además, es capaz de recoger fracciones permitiendo la evaluación de múltiples parámetros en paralelo con el OCR, lo que mejora enormemente la capacidad de estudiar las relaciones entre ellos. Por último, se pueden controlar las concentraciones de gases disueltos (como el O2 y el CO2), lo que aumenta la duración de los experimentos con medios y tampones a base de bicarbonato, lo que permite al usuario estudiar los efectos delO2. Cabe señalar que una limitación para ambas metodologías es la imposibilidad de estudiar el lavado de los compuestos de prueba, funcionalidad que tienen otros sistemas de perifusión 4,27,28. Otra consideración a la hora de determinar la modalidad de análisis óptima es el hecho de que los sistemas fluídicos utilizan más medios y compuestos de prueba que los sistemas estáticos. Sin embargo, el gasto adicional se minimiza con los sistemas de fluídicos actuales debido a los bajos caudales que se puede utilizar el sistema.
En general, se describe detalladamente los protocolos para realizar experimentos con un nuevo instrumento de flujo/evaluación. Los datos generados con retina y EPR-coroides-esclerótica recapitularon resultados previos obtenidos con sistemas que son mucho más difíciles de usar (y no están fácilmente disponibles). También se demostró que el sistema puede mantener y evaluar células EPR adheridas a membranas transpocillo, un modelo celular muy importante que no se ha analizado previamente con sistemas de flujo debido a la fragilidad de las células. Las partes principales del protocolo consisten en un tiempo de configuración de 75 minutos, seguido de un período de equilibrio de 90 minutos y el protocolo experimental, lo que lo hace adecuado para el uso rutinario de laboratorios que no se especializan en la operación de sistemas de fluídica. Aunque nos centramos en medir la respuesta aguda del tejido a los compuestos de prueba, el sistema es muy adecuado para comparar tejidos de diversas fuentes, como modelos animales o modelos celulares que han sido alterados genéticamente o se han sometido a tratamientos/condiciones de prueba. Además, el alcance de los ensayos que se pueden realizar en las fracciones de salida es amplio e incluye metabolitos, moléculas de señalización celular y hormonas/neurotransmisores secretados, así como análisis de componentes múltiples generados por espectrometría de masas en las fracciones y en el tejido.

Los sistemas de perifusión tienen una larga historia en las ciencias de la vida. En particular, para el estudio de la función secretora de los islotes, se han utilizado para caracterizar la cinética de la secreción de insulina en respuesta a secretagogos1. Además de la recolección de fracciones de salida para el posterior ensayo de hormonas y metabolitos, se han incorporado sensores en tiempo real, predominantemente para la detección del consumo de oxígeno 2,3,4. Los esfuerzos generalizados para comprender mejor los mecanismos que median las enfermedades oculares se han visto limitados por la falta de métodos fisiológicamente relevantes para evaluar la regulación metabólica y la desregulación de los diversos componentes aislados del ojo, incluida la retina, el epitelio pigmentario de la retina (EPR), la esclerótica coroidea y las células EPR cultivadas. Los sistemas estáticos diseñados para células cultivadas se han adaptado para el tejido5, pero el tejido requiere flujo para una oxigenación adecuada. Los sistemas de flujo han tenido éxito en la medición precisa y reproducible de las respuestas en tiempo real en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) por parte de la retina y el EPR-coroides-esclerótica, y los tejidos permanecen metabólicamente estables durante más de 8 h, lo que permite protocolos altamente informativos que involucran múltiples compuestos de prueba 4,6,7,8,9 . Sin embargo, la operación de los sistemas de fluídica ha requerido históricamente un aparato hecho a medida y personal técnico capacitado en metodologías no estandarizadas. Estos sistemas no se han adoptado como metodología estándar en la mayoría de los laboratorios. El BaroFuse es un sistema de fluídica recientemente desarrollado que no depende de bombas, sino de la presión del gas para impulsar el flujo a través de múltiples canales y cámaras de tejido (Figura 1). Cada canal se monitorea continuamente para OCR, y el flujo de salida se recolecta con un colector de fracciones basado en placas para el posterior análisis del contenido. Es importante destacar que las cámaras de perifusión tisular del instrumento están diseñadas para acomodar tejidos de diversas geometrías y tamaños.
El corazón del instrumento es el sistema de fluídica, donde el flujo se impulsa desde un depósito sellado y presurizado a través de una tubería de pequeño diámetro interior (ID) (que contribuye a la resistencia al flujo más significativa en el circuito de fluidos) hasta las cámaras de tejido de vidrio que albergan el tejido. La presión al módulo de depósito de medios (MRM) es suministrada por reguladores de baja y alta presión conectados a un cilindro de gas que contiene una mezcla de gases (típicamente 21% deO2, 5% de CO 2, equilibrio de N2), y el depósito está sellado desde la parte superior por el módulo de cámara de perifusión (PCM) que contiene los conjuntos de cámara de tejido (TCA). El caudal se controla mediante la longitud y el diámetro interior de los tubos de resistencia y el ajuste de presión de un regulador de baja presión. Los tubos de salida conectados a la parte superior de las cámaras de tejido suministran fluido a un recipiente de desechos (que se pesa continuamente para la determinación automática del caudal) o a los pocillos de una placa de 96 pocillos controlada por el colector de fracciones. El sistema de detección de O2 mide la vida útil de un colorante sensible alO2 pintado en el interior de cada una de las cámaras de tejido de vidrio aguas abajo del tejido. Esta información se utiliza para calcular continuamente el OCR. Todo el sistema de fluidos reside en un recinto con temperatura controlada y el tanque de gas, el colector de fracciones y la computadora son los componentes principales del instrumento (Figura 2A). Por último, el software que ejecuta el instrumento sirve para controlar su funcionamiento (incluida la preparación y la sincronización de los compuestos de prueba inyectados, el sistema de medición de flujo y la sincronización del colector de fracciones), así como para procesar y graficar los datos de OCR y otras mediciones complementarias.
En este trabajo describimos los protocolos para utilizar el sistema de fluídica para perifundir y evaluar el OCR y la tasa de producción de lactato (LPR) para varios componentes aislados del ojo. La LPR es un parámetro que refleja la tasa glucolítica y que es altamente complementaria a la OCR, donde el par representa las dos ramas principales de la generación de energía a partir de carbohidratos en la célula10. Como la preparación del tejido y su carga en las cámaras de tejido se aprende mejor viendo el procedimiento, el video ayudará a ilustrar varios de los pasos críticos que se realizan durante la configuración y la operación que no se transmiten fácilmente solo por texto.
La descripción del protocolo se divide en 8 secciones que corresponden a diferentes fases del experimento (Figura 2B): 1. preparación preexperimental; 2. preparación/equilibrio del perifusato; 3. Instalación del instrumento; 4. equilibrio tisular; 5. protocolo experimental; 6. Desglose del instrumento; 7. tratamiento de datos; y 8. Ensayos de fracciones de salida.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

Muchos modelos in vitro utilizados para investigar la función tisular y la biología celular requieren un flujo de medios para proporcionar una oxigenación adecuada y las condiciones celulares óptimas necesarias para el mantenimiento de la función y la viabilidad. Con este fin, hemos desarrollado un sistema de cultivo de flujo multicanal para mantener el tejido y las células en cultivo y evaluar continuamente la función y la viabilidad mediante sensores en línea y/o la recolección de fracciones de flujo de salida. El sistema combina la detección óptica continua de 8 canales de la tasa de consumo de oxígeno con un colector de fracciones incorporado para medir simultáneamente las tasas de producción de metabolitos y secreción de hormonas. Aunque es capaz de mantener y evaluar una amplia gama de modelos tisulares y celulares, incluidos los islotes, el músculo y el hipotálamo, aquí describimos sus principios operativos y las preparaciones/protocolos experimentales que hemos utilizado para investigar la regulación bioenergética de la retina aislada de ratón, el epitelio pigmentario de la retina de ratón (EPR), la esclerótica coroides y las células humanas cultivadas de EPR. Las innovaciones en el diseño del sistema, como el flujo de fluido sin bomba, han producido una operación muy simplificada de un sistema de flujo multicanal. Se muestran vídeos e imágenes que ilustran cómo ensamblar, preparar el instrumento para un experimento y cargar los diferentes modelos de tejido/célula en las cámaras de perifusión. Además, se delinean y discuten las pautas para seleccionar las condiciones para los experimentos específicos de protocolo y tejido, incluido el establecimiento de la relación correcta entre el caudal y el tejido para obtener condiciones de cultivo consistentes y estables y determinaciones precisas de las tasas de consumo y producción. La combinación del mantenimiento óptimo de los tejidos y la evaluación en tiempo real de múltiples parámetros produce conjuntos de datos altamente informativos que tendrán una gran utilidad para la investigación en la fisiología del ojo y el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de la visión deficiente.

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

Para ilustrar la resolución de los datos generados a partir de componentes aislados del ojo, se midió la OCR y la LPR con tres tipos de tejido (retina, células EPR-coroides-esclerótica y EPR) siguiendo un protocolo de uso común (la prueba de esfuerzo mitocondrial10; Figura 10, Figura 11 y Figura 12). La cantidad de tejido utilizado para cada tejido se muestra en la Tabla 1. Los datos se procesaron y graficaron utilizando el paquete de software que se desarrolló para el sistema de fluídica. La preparación de la retina y el EPR-coroides-esclerótica es relativamente sencilla y toma menos de 20 minutos para cada tipo de tejido. El OCR fue constante durante el tiempo en que se inyectaron los compuestos de prueba, lo que indica una salud y función estables del tejido y apoya la validez del método (Figura 10). Una vez validado para cada tipo de tejido, no hemos considerado necesario realizar controles en los que no se inyecten compuestos de prueba para cada experimento. De acuerdo con los datos obtenidos utilizando métodos de perifusión más convencionales 6,8,13, la OCR disminuyó en respuesta a oligomicina y aumentó la OCR en respuesta a FCCP. Los cambios en la LPR fueron en la dirección opuesta a los observados para la OCR: la oligomicina aumentó la LPR, que luego disminuyó (pero solo ligeramente) en respuesta a la FCCP (Figura 11). Para comparar la significación estadística del efecto de cada compuesto de prueba secuencial, se realizaron pruebas t (que son calculadas automáticamente por el software que viene con el instrumento). Dado que el objetivo del artículo era describir cómo realizar el método, el número de réplicas llevadas no siempre era lo suficientemente alto como para producir significación estadística. Sin embargo, en general, cuando el número de réplicas fue de 3 o más, los efectos de la FCCP y la oligomicina tanto en el OCR como en el LPR fueron significativos.
Las células del EPR no se han analizado previamente con sistemas de flujo, pero respondieron de manera similar al EPR-coroides-esclerótica (lo que concuerda con la opinión de que una gran fracción de la OCR se debe a las células del EPR; Figura 11). Estos ejemplos ilustrativos ponen de relieve la capacidad del sistema para mantener la viabilidad tisular, tal y como se refleja en la estabilidad de la OCR en los canales de control, y la alta relación señal/ruido para los cambios en la OCR de la magnitud inducida por la oligomicina y la FCCP, que fue superior a 100 a 1. Además, los ensayos de fracciones de salida se pueden utilizar para correlacionar la tasa de absorción o producción de una amplia gama de compuestos que se intercambian con el líquido extracelular y que son complementarios al OCR (en este caso, LPR). Estas características del instrumento permitieron cuantificar con precisión las diferencias características en las respuestas tisulares entre los tipos de tejido realizadas en paralelo. La OCR por parte de las células EPR-esclerótica coroidea y EPR son consistentemente más sensibles a la oligomicina que la retina (Figura 11 y Figura 12), aunque para el EPR-esclerótica coroidea la duración de la exposición a FCCP no fue lo suficientemente larga como para alcanzar el estado estacionario. Surgió un punto a tener en cuenta al usar DMSO como solvente. A concentraciones más altas, (0,2%) el DMSO tuvo un efecto transitorio sobre el OCR por la retina (presumiblemente reflejando un efecto de un cambio en la presión osmótica provocado por el efecto del DMSO sobre la permeabilidad de la membrana).
Sobre la base de la suposición de que el KCN inhibe completamente la respiración por su acción directa sobre la citocromo c oxidasa, el OCR al final de la exposición al KCN se establece en 0 y todos los valores de OCR se calculan en función del cambio en relación con el valor del KCN. El OCR puede ocurrir independientemente de la cadena respiratoria y de la citocromo c oxidasa. Sin embargo, la magnitud de esta contribución a la OCR general generalmente no es más que un pequeño porcentaje (datos no mostrados) y el período prolongado de tiempo que el tejido está expuesto a KCN asegura que los sustratos de oxidasas que no forman parte de la cadena de transporte de electrones se han agotado.
Análisis estadístico Los experimentos individuales se mostraron como se indica en las figuras, pero con múltiples canales que se promediaron. A continuación, los datos se graficaron como el promedio ± error estándar (SE; calculado como SD/√n).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> Figura 1. Esquema del sistema de fluídica/evaluación. Los componentes principales incluyen el recinto, los elementos de control de temperatura, los sistemas de cámaras de fluidos y tejidos, la regulación de la presión del gas en el espacio de cabeza por encima del perifusato, el control del colector de fracciones/caudal y los detectores de O2 . Abreviaturas: MRM = Módulo de reservorio de medios, PCM = Módulo de cámara de perifusión, TCA = Conjuntos de cámara de tejido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> Figura 2. (A) Imagen de los principales componentes del instrumento. Los componentes principales consisten en un tanque de gas (reguladores de presión), un gabinete, un colector de fracciones y una computadora. (B) Diagrama de flujo experimental que muestre las principales categorías de pasos y el tiempo que se tarda en completarlos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> Figura 3. Vista del MRM. El MRM se muestra con un inserto MRM (izquierda) y barras de agitación (derecha) colocados en la parte inferior de los insertos MRM (colocados a cada lado del divisor MRM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> Figura 4. Montaje de tubos y montaje de tubos de purga en el MRM. (A) Pruebe el conjunto de tubería de inyección de compuesto y el conjunto de tubería de purga unidos a los puertos del MRM. (B-C) El conjunto de inyección del compuesto de prueba y el conjunto de tubos de purga (B) se colocan en la ranura de la parte delantera de la carcasa (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> Figura 5. Encendido del controlador de temperatura MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> Figura 6. Cámaras de tejido y tanque de gas. Colocación del detector de O2 en el soporte del detector (que también soporta el MRM y el PCM), y colocación de la banda alrededor de las aletas del PCM que ayudan a asegurar las cámaras de tejido en su lugar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> Figura 7. (A) Reguladores de alta y baja presión en el tanque de gas. (B-C) Tubo de purga. El tubo de purga permite que el espacio de cabeza en el MRM se despeje de aire y se llene con gas del tanque de suministro. Imágenes que muestran el tubo de purga abierto (B) y el tubo de purga cerrado (C). El conjunto de inyección del compuesto de prueba permanece cerrado durante el proceso de purga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> Figura 8. La cámara de tejidos y la configuración del flujo de salida. (A) Dimensiones de la membrana Transwell después de cortarla en tres tiras de igual ancho. (B) Soporte multitubo de salida. (C) Soporte multitubo de salida colocado en el borde de la carcasa con los adaptadores de tubo cerca de las cámaras de tejido. (D) Imagen de los conjuntos de tubos de salida unidos a las cámaras de tejido. (E) Vista aérea del recinto sin la tapa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> Figura 9. Inyección de compuesto en MRM. Inyección de un compuesto de prueba a través del puerto de inyección en el MRM con una jeringa de 5 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> Figura 10. Curvas OCR y LPR en respuesta a compuestos de prueba. OCR y LPR por retina aislada de ratones (1 retina/canal) en respuesta a la presencia o ausencia (control) de compuestos de ensayo según lo indicado. Cada curva es el promedio de 6 réplicas de un solo experimento (las barras de error son SE; los valores p se calculan realizando pruebas t emparejadas comparando los valores de estado estacionario de cada agente de prueba con los del agente de prueba anterior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> Figura 11. Curvas OCR. OCR por EPR-esclerótica coroidea y retina aislada de ratones (1 retina o 2 EPR-esclerótica-coroides/canal) medido en paralelo en respuesta a los compuestos de prueba indicados. Los datos son el promedio de las réplicas de un solo experimento (n = 2 y 4 para el EPR-coroides-esclerótica y la retina respectivamente; los valores p se calculan realizando pruebas t pareadas comparando los valores de estado estacionario de cada agente de prueba con los del agente de prueba anterior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> Figura 12. Curvas OCR y LPR de celdas RPE. OCR y LPR de células EPR adheridas a membranas transpocillas que se cortaron en tiras y se cargaron en las cámaras de perifusión. Los datos son el promedio de réplicas de un solo experimento (n = 3, con 1,5 membranas/canal (360.000 células/canal); los valores p se calculan realizando pruebas t pareadas comparando los valores de estado estacionario de cada agente de prueba con los del agente de prueba anterior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>TEJIDO/CÉLULA</td>
			<td>Importe/Canal</td>
			<td>CAUDAL: mL/min</td>
		</tr><tr><td>Retina (ratón)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>EPR-coroides-esclerótica (ratón)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>Células EPR en membranas transpocillas</td>
			<td>360.000 celdas (4 tiras de filtro de 1/3)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1. Especificaciones de funcionamiento recomendadas para diferentes tejidos.
Figura complementaria 1. Representación gráfica del diseño experimental. Momento y composición de la exposición a los compuestos de ensayo y momento de recogida de fracciones. El incremento de concentración (Conc Inc) es el cambio en la concentración que se va a implementar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2. Interfaz de usuario al inicio. Interfaz de usuario de la ventana de inicio del software de detección de O 2 que monitorea el O2 en las cámaras de tejido insertadas en el PCM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3. Interfaz de usuario para la configuración del experimento. Interfaz de usuario para introducir información experimental (izquierda) y seleccionar los tiempos de recogida de fracciones de salida (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4. Interfaz de usuario de la página de inyección. Página de inyección que calcula los volúmenes de inyección en función de las concentraciones deseadas del compuesto de prueba y el volumen que queda en el MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: Métodos para la preparación de muestras de tejido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE

El análisis en tiempo real del tejido vivo proporciona importantes datos funcionales y mecanicistas. Este documento describe los protocolos y las variables críticas para garantizar la generación precisa y reproducible de datos mediante un sistema de fluídica multicanal novedoso y sin bomba que mantiene y evalúa una amplia gama de modelos de tejidos y células.

Mantenimiento y evaluación de varios tipos de tejidos y células del ojo mediante un novedoso sistema de fluídica sin bomba

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

Los dispositivos más comunes utilizados para medir el consumo de oxígeno no admiten la recolección simultánea de fracciones de flujo de salida. Es fundamental analizar también el flujo de salida para correlacionar el metabolismo con la función tisular. La tecnología que mide ambos puede evaluar mejor los mecanismos celulares que median la función tisular y la enfermedad.El desafío clave en la medición del consumo de oxígeno y el tejido vivo es el suministro de oxígeno adecuado para mantener la viabilidad y la función del tejido. Esto se logra mejor con sistemas de flujo. El uso de presión de gas en lugar de bombas peristálticas estándar simplifica enormemente el procedimiento y también elimina la formación de burbujas.La utilidad de una medición metabólica es tan buena como su capacidad para cuantificar y reproducir los resultados. Nuestro protocolo aprovecha la combinación de un caudal controlado con precisión con una detección estable de oxígeno disuelto durante toda la vida útil tanto en la entrada como en la salida. Este enfoque puede resolver de manera reproducible los cambios en el consumo de oxígeno incluso de solo un pequeño porcentaje.Los procesos bioquímicos que median la función de la retina son el resultado de la interacción metabólica entre varios tejidos del ojo. La capacidad de nuestro sistema de flujo para evaluar múltiples tipos de tejidos con diversas geometrías facilita el estudio de las propiedades intrínsecas únicas de cada tipo de célula y sus funciones coordinadas. Muchas enfermedades que afligen al ojo son causadas por vías metabólicas y señalización alteradas.Nos centramos en medir el consumo de oxígeno y la liberación de subproductos metabólicos por parte de los tejidos oculares con el fin de caracterizar, comprender y tratar el desarrollo de enfermedades y degeneraciones de la retina.