Name: Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00
Duration: 2 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM148741 IRS), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Vakfı, Körlüğü Önleme Araştırmaları (JRC) ve R01 EY006641, R01 EY017863 ve R21 EY032597 (JBH) tarafından finanse edilmiştir.

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol>
	<li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro:+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin.">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li><li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells.">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li><li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ATP/ADP+in+pancreatic+islets.">Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets.</a> Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).</li><li>Chertov, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+glucose+in+photoreceptor+survival.">Roles of glucose in photoreceptor survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+Can+Shuttle+Reducing+Power+from+the+Hypoxic+Retina+to+the+O2-Rich+Pigment+Epithelium.">Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium.</a> Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mitochondrial+pyruvate+transport+by+zaprinast+causes+massive+accumulation+of+aspartate+at+the+expense+of+glutamate+in+the+retina.">Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).</li><li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+metabolism+in+the+retinal+pigment+epithelium+uncouples+respiration+from+ATP+synthesis.">Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis.</a> Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism.">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, e66716 (2021).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (1995).</li><li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test.">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).</li><li>Engel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+dysfunction+in+Sorsby+patient-derived+retinal+pigment+epithelium.">Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium.</a> Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mitochondrial+Respiration+Impairs+Nutrient+Consumption+and+Metabolite+Transport+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelium.">Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).</li><li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+Metabolism+and+Metabolism+in+the+Pigmented+Epithelium:+A+Busy+Intersection.">Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+activation+and+photoreceptor+survival+in+retinal+detachment.">Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).</li><li>Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+consumption+by+mammalian+rod+photoreceptors+in+darkness+and+in+light.">ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light.</a> Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).</li><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+of+engineering+retinal+organoids+and+organoid-on-a-chip+in+modeling+intraocular+drug+delivery:+Current+progress+and+future+perspectives.">Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).</li><li>Arjamaa, O., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-dependent+diseases+in+the+retina:+role+of+hypoxia-inducible+factors.">Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors.</a> Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Versatile+Multi-Channel+Fluidics+System+for+the+Maintenance+and+Real-Time+Metabolic+and+Functional+Assessment+of+Tissue+or+Cells.">A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells.</a> Cell Reports Methods. In Press. , (2023).</li><li>Neal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Low-Level+Drug+Effects+Using+Real-Time,+in+vitro+Measurement+of+Oxygen+Consumption+Rate.">Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate.</a> Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).</li><li>Jung, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cytochrome+C+is+an+essential+regulator+of+sustained+insulin+secretion+by+pancreatic+islets.">Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).</li><li>Rountree, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+insulin+secretion+by+cytochrome+C+and+calcium+signaling+in+islets+with+impaired+metabolism.">Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).</li><li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers.">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li><li>Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+mitochondrial+damage+in+retinal+cells+and+tissues+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+mitochondrial+DNA+damage+and+extracellular+flux+assay+for+mitochondrial+respiration+activity.">Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).</li><li>Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+alterations+in+mitochondrial+reserve+capacity;+a+means+to+predict+subsequent+photoreceptor+cell+death.">Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function.">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).</li><li>Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitic+acid+acutely+inhibits+acetylcholine-+but+not+GLP-1-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+pancreatic+islets.">Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).</li></ol>

I.R.S., M.G. ve K.B.'nin bu çalışmada açıklanan BaroFuse perifüzyon sisteminin üreticisi/distribütörü olan EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA) ile finansal bağları vardır. Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Biyoenerjetiklerin hücre fonksiyonunun tüm yönlerinde ve gözün çeşitli bileşenlerinin korunmasındaki önemi nedeniyle, regülasyonunu incelemek için yöntemlere kritik bir ihtiyaç vardır. Özellikle, nöral retina ve RPE, hem enerji üretimi hem de hücre içi ve hücreler arası sinyalleşme için metabolizmaya bağlıdır14,15,16,17. Yüksek oksidatif kapasiteleri nedeniyle, gözün izole edilmiş dokuları statik koşullar altında iyi korunmaz18,19 ve bu nedenle gözün izole bileşenlerinin incelenmesi, metabolik süreçleri hem koruyabilen hem de değerlendirebilen akış sistemleri gerektirir. Fluidics sistemi, çok çeşitli doku tiplerinden OCR ve LPR verileri üretmek için geliştirilmiştir ve bu yazıda optimal sonuçlar verdiği tespit edilen ayrıntılı protokolleri sunduk.
Akış sistemini kullanarak sağlam veriler üretmek için ana belirleyici, 39 °C'de CO2 bazlı ortamın/tamponun ön denkleştirilmesini içerir (perifüzyonatın deney sırasında gazı giderecek çözünmüş gazla aşırı doymamış olmasını sağlamak için). Özellikle, 4 °C'de depolanan ortam veya KRB tamponu, 37 °C'ye göre aşırı doymuş olacak ve ön dengeleme süreleri yetersizse deney sırasında gazı giderecektir. Ek olarak, doku odacıklarına yüklenen doku, yırtılma veya tam ayrılma nedeniyle dokunun uygun olmayan şekilde izole edilmesi veya düşük miktarda bikarbonat bazlı tampon içindeki dokunun çok uzun süre atmosferik havaya maruz bırakılması ile travmatize edilmemelidir. O2 algılamanın sıcaklık kontrolü, akış kararlılığı ve güvenilirliği çok az değişkenliğe sahiptir ve bu faktörler arıza oranına önemli ölçüde katkıda bulunmaz.
Cihaz, her rezervuar için dört doku odası olmak üzere iki rezervuardan perifüzyon ile beslenen aynı anda çalışan sekiz akış kanalına/doku odasına sahiptir. OCR'nin en doğru zaman rotalarını elde etmek için, kinetik eğriler, doku yüklü olmayan odalar tarafından düzeltilir. Bu nedenle, tipik bir deneysel protokol, üç doku odasından oluşan iki grubu içerecektir. Protokoller genel olarak iki kategoriye ayrılır: biri her iki taraftaki farklı test bileşiği protokolleridir (örneğin, MRM'nin bir tarafında ilaç/araç ve diğer tarafında sadece araç); ikincisi, MRM'nin her iki tarafında aynı test bileşiği enjeksiyon protokolüdür, ancak MRM'nin her iki tarafında farklı doku veya doku modelidir. Bu yazıda, oligomisin ve FCCP'nin retina üzerindeki etkileri, herhangi bir test bileşiğine maruz kalmayan dokular tarafından OCR ile karşılaştırıldı ve dokuya özgü davranışı belirlemek için iki doku aynı protokol ve koşullar altında eşzamanlı olarak değerlendirildi. İkincisi, bu çalışmada, aynı deneyde paralel olarak retinaya göre RPE-koroid-sklera tarafından artan dinamik metabolik hız aralığı gösterilerek gösterilmiştir. Diğer raporlar, OCR ve LPR üzerindeki değişen O2 seviyelerinin etkilerinin ölçülmesi ve yakıtların, ilaçların ve toksinlerin konsantrasyon bağımlılıklarının ölçülmesi de dahil olmak üzere daha geniş bir çalışma tasarımı yelpazesini tanımlamıştır20,21. Ek olarak, çıkış fraksiyonlarının analizini laktat ölçümü ve LPR'nin hesaplanması ile sınırlamış olsak da, hücrelerden çıkabilen hormonlar, nörotransmiterler, hücre sinyalleri ve metabolitler gibi çıkış fraksiyonlarındaki birden fazla bileşik ve bileşik sınıfı test edilirse, bir deneyin bilgi içeriği büyük ölçüde artar20,22, 23.
İzole retina veya RPE-koroid-skleranın yüklenmesi basittir ve izole edildikten sonra bu dokular forseps ile doku odalarının tepesine yerleştirilir ve frite batmasına izin verilir. Filtre eklerinde kültürlenen RPE hücreleri, kültürde 4-8 hafta sonra uygun polarizasyon ve RPE olgunluğu belirteçleri geliştirir. RPE olgunluğu ve polarizasyonu korunacaksa, transwell membranına bağlandıktan sonra canlı hücre analizi için RPE'nin çıkarılması mümkün değildir24. Perifüzyon odası, tampona daldırılırken bir neşter ile kesilen ve doku odalarına hızla yerleştirilen transwell membran şeritlerini barındırabilir. Kesme filtre şeritleri statik bir sisteme24 yerleştirilmiş olmasına rağmen, bu önemli hücre tiplerini değerlendirmek için başka bir akışkan yöntemi mevcut değildir. RPE hücrelerinin tepkileri, retina veya RPE-koroid-skleradan daha hızlı ve daha dinamikti, muhtemelen kısmen, membran eki üzerinde tek tabaka olarak yapılandırılmış RPE hücrelerinin hem apikal hem de bazal yönlerine anında erişim nedeniyle.
Verilerin gürültüye karşı en yüksek sinyale sahip olmasını sağlamada bir başka faktör, akış hızına göre perifüzyon odalarına yüklenen dokunun optimal oranını seçmektir. Akış hızına göre çok az doku, giriş ve çıkış arasında çok küçük ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi zor olan çözünmüşO2 konsantrasyonu farkına neden olur. Buna karşılık, akış çok yavaşsa,O2 konsantrasyonu o kadar düşük olur ki, doku hipoksiden etkilenir. Bununla birlikte, gaz basıncıyla çalışan sıvı akışı, doğru OCR ve LPR ölçümleri için yalnızca az miktarda doku gerektiren 5 mL/dk'ya kadar akış hızlarında tutulabilir. Burada gösterilen deneylerde, bir retina, iki RPE-koroid-sklera veya 360.000 RPE hücresi için uygun olan yaklaşık 20 mL / dak / kanal kullanıldı. Dokunun enjekte edilen test bileşiğine maruz kalmasını geciktiren ve dağıtan sistem etkilerini en aza indirmek için, doku miktarının (ve akış hızının) odanın uygun boyutuyla eşleşmesi için birden fazla boyutta doku odası sağlanır.
Bu yazıda gösterilen analizlerden elde edilen veriler iki şekilde temsil edilmiştir: orana göre mutlak büyüklük veya kararlı duruma veya taban çizgisine göre kesirli değişiklikler. Odak noktası, test bileşiklerine verilen yanıtların ölçümünün gösterilmesiydi. Bununla birlikte, akışkan sistemi, genetik modifikasyonlar gibi perifüzyon analizinden önce doku tedavisinin etkilerini değerlendirmek ve karşılaştırmak için çok uygundur. Bir tedavinin kontrolden farklı olup olmadığının test edilmesi, tedavinin test bileşiklerinin normalleştirilmiş yanıtları üzerindeki etkileri analiz edilirse en sağlamdır. Analiz mutlak büyüklükler gerektiriyorsa, ön işleme tabi tutulan örneklerin analizlerinin istatistiksel gücü, değerlendirme ve kontrolleri aynı perifüzyon deneyinde gerçekleştirilirse en üst düzeye çıkarılır.
Karıştırıcı haricinde sıvı ile temas eden tüm parçalar üretici firma tarafından sarf malzemesi olarak temin edilmekte ve sterilize edilmektedir. Eksik temizlik ve kirlenmiş yüzeyler nedeniyle deneyler zaman zaman kaybolacağından bu parçalar tekrar kullanılmamalıdır. Kurulumun başlangıcındaki sistem sterildir. Bununla birlikte, MRM'ye ortam eklenir ve steril olmayan koşullar altında dokular odalara yüklenir. OCR'yi steril olan parçalarla bir araya getirilen, ancak deneyin kendisinin steril olmayan koşullar altında gerçekleştirildiği sistemde ölçtük. Bakterilerin ölçülebilir OCR'ye (yayınlanmamış sonuçlar) sahip olma noktasına kadar birikmesi yaklaşık 14 saat sürer. 10 saatten daha kısa protokoller kullanılırsa, bakteri birikimi ve bunlardan kaynaklanan etkiler ihmal edilebilir olacaktır.
Birçok araştırmacı, nispeten yüksek bir verime sahip tek katmanlı bir hücrenin statik inkübasyonu altında OCR'yi ölçmek için tasarlanmış araçlar kullanır25,26. Buna karşılık, bu yazıda test ettiğimiz ve tarif ettiğimiz akışkan alet, doku örneklerinde bulunan daha büyük difüzyon mesafeleri için kritik olan yeterliO2 iletimini sağlayarak dokuyu korur. Ek olarak, OCR ile paralel olarak birden fazla parametrenin değerlendirilmesine izin veren kesirleri toplayabilir ve bu da aralarındaki ilişkileri inceleme yeteneğini büyük ölçüde geliştirir. Son olarak, çözünmüş gaz konsantrasyonları (O2 ve CO2 gibi) kontrol edilebilir, bu da bikarbonat bazlı ortam ve tampon ile yapılan deneylerin süresini artırarak kullanıcınınO2'nin etkilerini incelemesini sağlar. Belirtmek gerekir ki, her iki metodoloji için de bir sınırlama, diğer perifüzyon sistemlerinin sahip olduğu bir işlevsellikolan test bileşiklerinin yıkanmasını inceleyememektir 4,27,28. Optimal analiz yöntemini belirlerken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer husus, akışkan sistemlerin statik sistemlere göre daha fazla ortam ve test bileşiği kullanmasıdır. Mevcut akışkan sistemleri ile ekstra masraf, sistemin kullanılabileceği düşük akış hızları nedeniyle en aza indirilmiştir.
Genel olarak, yeni bir akış/değerlendirme aracıyla deneyler yapmak için protokollerin ayrıntılı bir açıklaması açıklanmaktadır. Retina ve RPE-koroid-sklera ile elde edilen veriler, kullanımı çok daha zor olan (ve kolayca bulunamayan) sistemlerle elde edilen önceki sonuçları özetledi. Ayrıca sistemin, hücrelerin kırılganlığı nedeniyle daha önce akış sistemleriyle analiz edilmemiş çok önemli bir hücresel model olan transwell membranlarına bağlı RPE hücrelerini koruyabildiğini ve değerlendirebildiğini gösterdi. Protokolün ana bölümleri, 75 dakikalık bir kurulum süresi, ardından 90 dakikalık bir dengeleme süresi ve akışkan sistemlerinin işletiminde uzmanlaşmamış laboratuvarlar tarafından rutin kullanıma uygun hale getirilen deneysel protokolden oluşur. Dokunun test bileşiklerine akut tepkisini ölçmeye odaklanmış olsak da, sistem, hayvan modelleri veya genetiği değiştirilmiş veya test tedavileri/koşulları uygulanmış hücre modelleri gibi çeşitli kaynaklardan alınan dokuları karşılaştırmak için çok uygundur. Ek olarak, çıkış fraksiyonları üzerinde gerçekleştirilebilecek testlerin kapsamı geniş kapsamlıdır ve metabolitleri, hücre sinyal moleküllerini ve salgılanan hormonları/nörotransmiterleri ve ayrıca fraksiyonlar ve doku üzerinde kütle spektrometrisi ile oluşturulan çok bileşenli analizleri içerir.

Perifüzyon sistemlerinin yaşam bilimlerinde uzun bir geçmişi vardır. Özellikle, adacıklar tarafından salgı fonksiyonunun incelenmesi için, sekretagoglara yanıt olarak insülin sekresyonunun kinetiğini karakterize etmek için kullanılmıştır1. Hormonların ve metabolitlerin müteakip tahlili için çıkış fraksiyonlarının toplanmasına ek olarak, ağırlıklı olarak oksijen tüketiminin tespiti için gerçek zamanlı sensörlerdahil edilmiştir 2,3,4. Göz hastalıklarına aracılık eden mekanizmaları daha iyi anlamaya yönelik yaygın çabalar, retina, retina pigment epitelyal (RPE)-koroid-sklera ve kültürlenmiş RPE hücreleri dahil olmak üzere gözün çeşitli izole bileşenlerinin metabolik regülasyonunu ve düzensizliğini değerlendirmek için fizyolojik olarak ilgili yöntemlerin eksikliği nedeniyle sınırlandırılmıştır. Kültürlenmiş hücreler için tasarlanmış statik sistemler doku5 için uyarlanmıştır, ancak doku yeterli oksijenasyon için akışa ihtiyaç duyar. Akış sistemleri, retina ve RPE-koroid-sklera tarafından oksijen tüketim oranındaki (OCR) gerçek zamanlı yanıtları doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmede başarılı olmuştur ve dokular 8 saatten fazla metabolik olarak stabil kalarak birden fazla test bileşiğiiçeren son derece bilgilendirici protokollere izin verir 4,6,7,8,9. Bununla birlikte, akışkan sistemlerin işletilmesi, tarihsel olarak özel yapım bir aparat ve standartlaştırılmamış metodolojilerde eğitimli teknik personel gerektirmiştir. Bu tür sistemler çoğu laboratuvarda standart metodoloji olarak benimsenmemiştir. BaroFuse, pompalara değil, birden fazla kanal ve doku odasından akışı sağlamak için gaz basıncına dayanan yeni geliştirilmiş bir akışkan sistemidir (Şekil 1). Her kanal OCR için sürekli olarak izlenir ve çıkış, daha sonra içeriğin tahlili için plaka bazlı bir fraksiyon toplayıcı ile toplanır. Daha da önemlisi, alet için doku perifüzyon odaları, çeşitli geometri ve boyutlardaki dokuları barındıracak şekilde tasarlanmıştır.
Cihazın kalbi, akışın kapalı, basınçlı bir rezervuardan küçük iç çaplı (ID) borulardan (sıvı devresindeki en önemli akış direncine katkıda bulunan) dokuyu barındıran cam doku odalarına sürüldüğü akışkan sistemidir. Medya rezervuar modülüne (MRM) basınç, bir gaz karışımı (tipik olarak %21 O 2,% 5 CO 2, denge N 2) içeren bir gaz silindirine bağlı düşük basınçlı ve yüksek basınçlı regülatörler tarafından sağlanır ve rezervuar, doku odası tertibatlarını (TCA'lar) tutan perifüzyon odası modülü (PCM) tarafından üstten kapatılır. Akış hızı, direnç borularının uzunluğu ve kimliği ve düşük basınç regülatörünün basınç ayarı ile kontrol edilir. Doku odalarının tepesine bağlanan çıkış tüpleri, sıvıyı ya bir atık kabına (akış hızının otomatik olarak belirlenmesi için sürekli olarak tartılır) ya da fraksiyon toplayıcı tarafından kontrol edilen 96 oyuklu bir plakanın kuyularına iletir. O 2 algılama sistemi, dokunun akış aşağısındaki cam doku odalarının her birinin içine boyanmış O2'ye duyarlı bir boyanın ömrünü ölçer. Bu bilgiler daha sonra OCR'yi sürekli olarak hesaplamak için kullanılır. Tüm akışkan sistemi, sıcaklık kontrollü bir muhafaza içinde bulunur ve gaz tankı, fraksiyon toplayıcı ve bilgisayar, cihazın ana bileşenleridir (Şekil 2A). Son olarak, cihazı çalıştıran yazılım, çalışmasını kontrol etmeye (enjekte edilen test bileşiklerinin hazırlanması ve zamanlaması, akış ölçüm sistemi ve fraksiyon toplayıcı zamanlaması dahil) ve ayrıca OCR verilerinin ve diğer ek ölçümlerin işlenmesine ve grafiğinin çizilmesine hizmet eder.
Bu yazıda, gözün çeşitli izole bileşenleri için OCR ve laktat üretim hızını (LPR) perifüze etmek ve değerlendirmek için akışkan sistemi kullanma protokollerini açıklıyoruz. LPR, çiftinhücre 10'daki karbonhidratlardan enerji üretiminin iki ana dalını açıkladığı OCR'yi oldukça tamamlayıcı olan glikolitik hızı yansıtan bir parametredir. Dokunun hazırlanması ve doku odalarına yüklenmesi en iyi prosedürü izleyerek öğrenildiğinden, video, kurulum ve çalıştırma sırasında gerçekleştirilen ve yalnızca metinle kolayca aktarılamayan kritik adımların birçoğunu göstermeye yardımcı olacaktır.
Protokolün açıklaması, deneyin farklı aşamalarına karşılık gelen 8 bölüme ayrılmıştır (Şekil 2B): 1. deney öncesi hazırlık; 2. perifusatın hazırlanması / dengelenmesi; 3. enstrüman kurulumu; 4. doku dengesi; 5. Deney protokolü; 6. enstrüman arızası; 7. Veri işleme; ve 8. çıkış fraksiyonlarının tahlilleri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

Doku fonksiyonunu ve hücre biyolojisini araştırmak için kullanılan birçok in vitro model, fonksiyonun ve canlılığın sürdürülmesi için gerekli olan yeterli oksijenasyonu ve optimal hücre koşullarını sağlamak için bir ortam akışı gerektirir. Bu amaçla, doku ve hücreleri kültürde tutmak ve in-line sensörler ve/veya çıkış fraksiyonlarının toplanması yoluyla işlev ve canlılığı sürekli olarak değerlendirmek için çok kanallı bir akış kültürü sistemi geliştirdik. Sistem, metabolitlerin üretim hızlarını ve hormon salgısını aynı anda ölçmek için oksijen tüketim oranının 8 kanallı, sürekli optik algılamasını dahili bir fraksiyon toplayıcı ile birleştirir. Adacıklar, kas ve hipotalamus dahil olmak üzere çok çeşitli doku ve hücre modellerini koruyabilmesine ve değerlendirebilmesine rağmen, burada çalışma prensiplerini ve izole fare retinası, fare retina pigment epiteli (RPE)-koroid-sklera ve kültürlenmiş insan RPE hücrelerinin biyoenerjetik regülasyonunu araştırmak için kullandığımız deneysel preparatları/protokolleri açıklıyoruz. Pompasız sıvı akışı gibi sistemin tasarımındaki yenilikler, çok kanallı bir akış sisteminin büyük ölçüde basitleştirilmiş bir çalışmasını sağlamıştır. Cihazın nasıl birleştirileceğini, bir deney için nasıl hazırlanacağını ve farklı doku/hücre modellerinin perifüzyon odalarına nasıl yükleneceğini gösteren videolar ve görüntüler gösterilmektedir. Ek olarak, tutarlı ve stabil kültür koşulları elde etmek için doğru akış hızının doku oranının ayarlanması ve tüketim ve üretim oranlarının doğru belirlenmesi de dahil olmak üzere, protokol ve dokuya özgü deneyler için koşulların seçilmesine yönelik kılavuzlar tanımlanmış ve tartışılmıştır. Optimal doku bakımı ve birden fazla parametrenin gerçek zamanlı değerlendirmesinin kombinasyonu, göz fizyolojisi araştırmaları ve görme bozukluğunun tedavisi için ilaç keşfi için büyük fayda sağlayacak son derece bilgilendirici veri setleri sağlar.

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

Gözün izole bileşenlerinden üretilen verilerin çözünürlüğünü göstermek için, OCR ve LPR, yaygın olarak kullanılan bir protokol (mitokondriyal stres testi10; Şekil 10, Şekil 11 ve Şekil 12). Her doku için kullanılan doku miktarı Tablo 1'de gösterilmiştir. Veriler, akışkan sistem için geliştirilen yazılım paketi kullanılarak işlendi ve grafiklendirildi. Retina ve RPE-koroid-skleranın hazırlanması nispeten basittir ve her doku tipi için 20 dakikadan az sürer. OCR, test bileşiklerinin enjekte edildiği süre boyunca sabitti, bu da dokunun stabil sağlığını ve işlevini gösterir ve yöntemin geçerliliğini destekler (Şekil 10). Her doku tipi için doğrulandıktan sonra, her deney için hiçbir test bileşiğinin enjekte edilmediği kontrollerin çalıştırılmasını gerekli bulmadık. Daha konvansiyonel perifüzyon yöntemleri kullanılarak elde edilen verilerle tutarlı6,8,13, oligomisin yanıtında OCR azalması ve FCCP'ye yanıt olarak OCR'de artış olması. LPR'deki değişiklikler, OCR için gözlemlenenlerin tersi yöndeydi: oligomisin, LPR'yi arttırdı, bu daha sonra FCCP'ye yanıt olarak azaldı (ancak sadece biraz) (Şekil 11). Her bir sıralı test bileşiğinin etkisinin istatistiksel anlamlılığını karşılaştırmak için, t-testleri yapıldı (cihazla birlikte gelen yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanan). Makalenin amacı, yöntemin nasıl uygulanacağını açıklamak olduğundan, taşınan kopyaların sayısı her zaman istatistiksel anlamlılık üretecek kadar yüksek değildi. Bununla birlikte, genel olarak, kopya sayısı 3 veya daha fazla olduğunda, FCCP ve oligomisinin hem OCR hem de LPR üzerindeki etkileri önemliydi.
RPE hücreleri daha önce akış sistemleriyle analiz edilmemiştir, ancak RPE-koroid-skleraya benzer şekilde yanıt vermiştir (OCR'nin büyük bir kısmının RPE hücrelerine bağlı olduğu görüşüyle tutarlıdır; Şekil 11). Bu açıklayıcı örnekler, kontrol kanallarında OCR'nin stabilitesi ve 100'e 1'den fazla olan oligomisin ve FCCP tarafından indüklenen büyüklükteki OCR'deki değişiklikler için yüksek sinyal-gürültü oranı ile yansıtıldığı gibi sistemin doku canlılığını sürdürme yeteneğini vurgulamaktadır. Ek olarak, hücre dışı sıvı ile değiş tokuş edilen çok çeşitli bileşiklerin alım veya üretim hızını ilişkilendirmek için çıkış fraksiyonlarının tahlilleri kullanılabilir, OCR'yi (bu durumda LPR) tamamlayıcı niteliktedir. Cihazın bu özellikleri, paralel olarak gerçekleştirilen doku tipleri arasındaki doku tepkilerindeki karakteristik farklılıkların doğru bir şekilde ölçülmesine izin verdi. RPE-koroid-sklera ve RPE hücreleri tarafından OCR, oligomisin'e retinadan sürekli olarak daha duyarlıdır (Şekil 11 ve Şekil 12), ancak RPE-koroid-sklera için FCCP'ye maruz kalma süresi kararlı duruma ulaşmak için yeterince uzun değildi. DMSO'yu çözücü olarak kullanırken dikkate alınması gereken bir nokta ortaya çıktı. Daha yüksek konsantrasyonlarda, (% 0.2) DMSO, retina tarafından OCR üzerinde geçici bir etkiye sahipti (muhtemelen DMSO'nun membran geçirgenliği üzerindeki etkisinin neden olduğu ozmotik basınçtaki bir değişikliğin etkisini yansıtıyordu).
KCN'nin sitokrom c oksidaz üzerindeki doğrudan etkisiyle solunumu tamamen inhibe ettiği varsayımına dayanarak, KCN maruziyetinin sonundaki OCR 0 olarak ayarlanır ve tüm OCR değerleri KCN değerine göre değişime göre hesaplanır. OCR, solunum zincirinden ve sitokrom c oksidazdan bağımsız olarak ortaya çıkabilir. Bununla birlikte, genel OCR'ye bu katkının büyüklüğü genellikle yüzde birkaçından fazla değildir (veriler gösterilmemiştir) ve dokunun KCN'ye maruz kaldığı sürenin uzaması, elektron taşıma zincirinin bir parçası olmayan oksidaz substratlarının tükenmesini sağlar.
İstatistiksel analiz Tekli deneyler şekillerde gösterildiği gibi, ancak ortalaması alınan çoklu kanallarla gösterilmiştir. Veriler daha sonra standart hatanın ortalaması ± grafiklendirildi (SE; SD / √n olarak hesaplandı).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> Şekil 1. Akışkanlar/değerlendirme sisteminin şeması. Başlıca bileşenler arasında muhafaza, sıcaklık kontrol elemanları, akışkanlar ve doku odası sistemleri, perifüzyonatın üzerindeki kafa boşluğundaki gaz basıncının düzenlenmesi, fraksiyon toplayıcı/akış hızı izleme veO2 dedektörleri bulunur. Kısaltmalar: MRM = Medya Rezervuar Modülü, PCM = Perifüzyon Odası Modülü, TCA = Doku Odası Montajları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> Şekil 2. (A) Cihazın ana bileşenlerinin resmi. Ana bileşenler gaz tankı (basınç regülatörleri), muhafaza, fraksiyon toplayıcı ve bilgisayardan oluşur. (B) Ana adım kategorilerini ve bunları tamamlamak için gereken süreyi gösteren deneysel akış şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> Şekil 3. MRM'nin görünümü. MRM, MRM eklerinin altına (MRM Bölücünün her iki tarafına yerleştirilmiş) yerleştirilmiş bir MRM eki (solda) ve karıştırma çubukları (sağda) ile gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> Şekil 4. MRM'de boru montajı ve boşaltma borusu tertibatı. (A) MRM'deki bağlantı noktalarına bağlı bileşik enjeksiyon borusu tertibatını ve boşaltma borusu tertibatını test edin. (İ.Ö.) Test bileşiği enjeksiyon tertibatı ve boşaltma borusu tertibatı (B), Muhafazanın (C) önündeki oluğa yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> Şekil 5. MRM sıcaklık kontrol cihazını çalıştırma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> Şekil 6. Doku odaları ve gaz tankı. O2 dedektörünün dedektör standına yerleştirilmesi (MRM ve PCM'yi de destekler) ve bandın doku odalarını yerinde sabitlemeye yardımcı olan PCM kanatçıklarının etrafına yerleştirilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> Şekil 7. (A) Benzin deposundaki yüksek ve alçak basınç regülatörleri. (İ.Ö.) Temizleme tüpü. Boşaltma borusu, MRM'deki üst boşluğun havadan temizlenmesini ve besleme tankından gazla doldurulmasını sağlar. Açık boşaltma tüpünü (B) ve kapalı boşaltma borusunu (C) gösteren resimler. Test bileşiği enjeksiyon düzeneği, temizleme işlemi boyunca kapalı kalır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> Şekil 8. Doku odası ve çıkış ayarı. (A) Transwell membranının eşit genişlikte üç şerit halinde kesildikten sonraki boyutları. (B) Çıkış çoklu tüp desteği. (C) Doku odalarının yakınındaki boru adaptörleri ile muhafazanın dudağına yerleştirilmiş çıkış çoklu tüp desteği. (D) Doku odalarına bağlı çıkış borusu tertibatlarının resmi. (E) Kapaksız muhafazanın havadan görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> Şekil 9. MRM'de bileşik enjeksiyonu. 5 mL'lik bir şırınga kullanarak enjeksiyon portundan MRM'ye bir test bileşiğinin enjekte edilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> Şekil 10. Test bileşiklerine yanıt olarak OCR ve LPR eğrileri. Belirtildiği gibi test bileşiklerinin varlığına veya yokluğuna (kontrolüne) yanıt olarak farelerden (1 retina / kanal) izole edilen retina tarafından OCR ve LPR. Her eğri, tek bir deneyden 6 kopyanın ortalamasıdır (hata çubukları SE'dir; p-değerleri, her test aracısı için kararlı durum değerlerini önceki test aracısınınkiyle karşılaştıran eşleştirilmiş t-testleri gerçekleştirilerek hesaplanır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> Şekil 11. OCR eğrileri. Farelerden (1 retina veya 2 RPE-koroid-sklera / kanal) izole edilen RPE-koroid-sklera ve retina ile OCR, belirtildiği gibi test bileşiklerine yanıt olarak paralel olarak ölçülür. Veriler, tek bir deneyden elde edilen kopyaların ortalamasıdır (RPE-koroid-sklera ve retina için sırasıyla n = 2 ve 4; p değerleri, her bir test ajanı için kararlı durum değerlerini önceki test ajanınınkiyle karşılaştıran eşleştirilmiş t-testleri gerçekleştirilerek hesaplanır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> Şekil 12. RPE hücrelerinden OCR ve LPR eğrileri. Şeritler halinde kesilen ve perifüzyon odalarına yüklenen transwell membranlarına bağlanan RPE hücrelerinden OCR ve LPR. Veriler, tek bir deneyden elde edilen kopyaların ortalamasıdır (n = 3, 1.5 membran/kanal (360.000 hücre/kanal); p-değerleri, her bir test aracısı için kararlı durum değerlerini önceki test aracısınınkiyle karşılaştıran eşleştirilmiş t-testleri gerçekleştirilerek hesaplanır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>DOKU/HÜCRE</td>
			<td>Miktar/Kanal</td>
			<td>AKIŞ HIZI: mL/dak</td>
		</tr><tr><td>Retina (fare)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-koroid-sklera (fare)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>Transwell Membranları Üzerindeki RPE Hücreleri</td>
			<td>360.000 Hücre (4 x 1/3 filtre şeridi)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1. Farklı dokular için önerilen çalışma özellikleri.
Ek Şekil 1. Deneysel tasarımın grafiksel gösterimi. Test bileşiklerine maruz kalmanın zamanlaması ve bileşimi ve fraksiyon toplama zamanlaması. Konsantrasyon artışı (Conc Inc), uygulanacak konsantrasyondaki değişikliktir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2. Başlangıçta kullanıcı arayüzü. PCM'ye yerleştirilen doku odalarındaki O 2'yi izleyen O2 algılama yazılımının başlangıç penceresinin kullanıcı arayüzü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 3. Deneme ayarları için kullanıcı arabirimi. Deneysel bilgilerin girilmesi (solda) ve çıkış fraksiyonlarının toplanması için zamanları seçmek (sağda) için kullanıcı arayüzü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 4. Enjeksiyon sayfasının kullanıcı arayüzü. İstenen test bileşiği konsantrasyonlarına ve MRM'de kalan hacme göre enjeksiyon hacimlerini hesaplayan enjeksiyon sayfası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Doku örneği hazırlama yöntemleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment (Video) | JoVE

Canlı dokunun gerçek zamanlı analizi, önemli fonksiyonel ve mekanik veriler sağlar. Bu makale, çok çeşitli doku ve hücre modellerini koruyan ve değerlendiren yeni ve pompasız çok kanallı akışkan bir sistem tarafından doğru ve tekrarlanabilir veri üretimini sağlamak için protokolleri ve kritik değişkenleri açıklamaktadır.

Yeni bir pompasız akışkan sistemi kullanarak gözün çeşitli doku ve hücre tiplerinin bakımı ve değerlendirilmesi

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

Oksijen tüketimini ölçmek için kullanılan en yaygın cihazlar, çıkış fraksiyonlarının aynı anda toplanmasını desteklemez. Metabolizmayı doku fonksiyonu ile ilişkilendirmek için çıkışı test etmek de çok önemlidir. Teknolojinin her ikisini de ölçmesi, doku fonksiyonuna ve hastalığa aracılık eden hücresel mekanizmaları daha iyi değerlendirebilir.Oksijen tüketiminin ve canlı dokunun ölçülmesindeki en önemli zorluk, doku canlılığını ve işlevini sürdürmek için yeterli oksijen sağlamaktır. Bu en iyi akış sistemleri ile gerçekleştirilir. Standart peristaltik pompalar yerine gaz basıncının kullanılması, prosedürü büyük ölçüde basitleştirir ve ayrıca kabarcık oluşumunu ortadan kaldırır.Metabolik bir ölçümün faydası, yalnızca sonuçları ölçme ve çoğaltma yeteneği kadar iyidir. Protokolümüz, hem giriş hem de çıkışta çözünmüş oksijenin kararlı kullanım ömrü tespiti ile hassas bir şekilde kontrol edilen akış hızının kombinasyonundan yararlanır. Bu yaklaşım, oksijen tüketimindeki sadece yüzde birkaç değişikliği bile tekrarlanabilir şekilde çözebilir.Retina fonksiyonuna aracılık eden biyokimyasal süreçler, gözün çeşitli dokuları arasındaki metabolik etkileşimin sonucudur. Akış sistemimizin farklı geometrilere sahip birden fazla doku tipini değerlendirme yeteneği, her hücre tipinin benzersiz içsel özelliklerinin ve koordineli işlevlerinin incelenmesini kolaylaştırır. Gözü etkileyen birçok hastalık, bozulmuş metabolik yollardan ve sinyalleşmeden kaynaklanır.Retina hastalıklarının ve dejenerasyonunun gelişimini karakterize etmek, anlamak ve tedavi etmek için oksijen tüketimini ve metabolik yan ürünlerin göz dokuları tarafından salınmasını ölçmeye odaklanıyoruz.