Name: Author Spotlight: Advancing Knowledge in Far-From-Equilibrium Materials Through Light-Sheet Microscopy
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00
Duration: 1 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) a J.S. Siamo grati per la guida fornita dal Dr. Bin Yang e dal Dr. Manish Kumar durante il processo di allineamento. Ringraziamo la Dott.ssa Jenny Ross e la K. Alice Lindsay per le istruzioni di preparazione dei motori della chinesina.

Customizable Fluorescence Microscope to Visualize Cytoskeleton Networks

<ol>
	<li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter.">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834 (2021).</li><li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography.">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. 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L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+(SOPi)+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging.">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals.">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li><li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics.">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681 (2020).</li><li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo.">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li><li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton.">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, (2016).</li><li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. 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Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023)</li><li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss Available from: <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023)</li><li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossbill:+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform.">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+microscopy:+A+tutorial.">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li><li>Pitrone, P. 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L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes.">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119 (2022).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors.">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002 (2016).</li><li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High NA single-objective lightsheet. , (2019).</li><li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope.">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li><li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy.">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969 (2022).</li><li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy.">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare. Tutte le ricerche sono state condotte in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potessero essere interpretate come un conflitto di interessi.

Due dettagli importanti relativi a questo protocollo sono il costo complessivo del sistema e il tempo previsto di costruzione e allineamento. Sebbene il costo esatto sia variabile, possiamo tranquillamente stimare che il costo in toto di questo SOLS o di un sistema fai-da-te simile si aggirerebbe intorno agli 85.000 dollari. Notiamo che questa stima considera il prezzo al dettaglio di tutti i componenti, quindi questo prezzo complessivo può essere notevolmente ridotto acquistando componenti usati. In termini di tempo di costruzione, sarebbe ragionevole aspettarsi che un utente con poca esperienza ottica costruisca e allinei l'intero sistema SOLS entro 1-2 mesi, a condizione che tutti i componenti siano disponibili e pronti. Nonostante la lunghezza e la complessità del protocollo, riteniamo che la quantità di dettagli nel manoscritto scritto, abbinata al protocollo video, dovrebbe rendere questo protocollo semplice e veloce da seguire.
Ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, il posizionamento del galvo determina il posizionamento di molti obiettivi in quanto fa parte di tre coppie di lenti 4f separate. È fondamentale che il galvo sia coniugato con i piani focali posteriori di O1 e O2 e centrato correttamente per garantire una scansione invariante dell'inclinazione. In secondo luogo, la qualità dell'immagine è estremamente sensibile all'allineamento di O2 e O3 l'uno rispetto all'altro. In questo caso, è necessario prestare attenzione per garantire che, in primo luogo, l'angolo di allineamento da O3 a O2 corrisponda all'inclinazione del foglio luminoso di eccitazione, fornendo così un'illuminazione il più possibile piatta attraverso il FoV inclinato in modo simile. In secondo luogo, l'O3 deve essere posizionato alla distanza assiale corretta per mantenere un FoV piatto con un'area il più ampia possibile. In terzo luogo, l'O3 deve essere posizionato alla corretta distanza laterale dall'O2 per massimizzare il segnale che passa attraverso l'interfaccia O2-O3.

In termini di FoV utilizzabile, questo sistema ha ottenuto un campo piatto e affidabile con un'illuminazione costante su un'area di 80 μm x 80 μm. Quest'area è più piccola del FoV massimo fornito dalla telecamera, quindi il FoV utilizzabile è indicato dal riquadro giallo nella Figura 13. In termini di potere risolutivo, questo sistema ha raggiunto una distanza minima risolvibile di 432 nm lungo l'asse x e 421 nm lungo l'asse y, che è stata misurata trovando la media sigma x e y delle funzioni di diffusione gaussiane (PSF) nel FoV buono e moltiplicando per due. Notiamo che questo sistema non è stato ottimizzato in termini di NA totale, il che significa che c'è spazio per miglioramenti significativi se gli utenti desiderano un potere risolutivo superiore a quello che questo sistema ha raggiunto. Ci sono una moltitudine di opzioni di obiettivi compatibili per questo tipo di build SOLS, molte delle quali contribuirebbero a una maggiore risoluzione del sistema ma con gli svantaggi di un costo più elevato, un FoV più piccolo o tecniche di allineamento più complicate all'interfaccia del relè 8,11,13,20. Separatamente, se gli utenti desiderano un FoV più ampio, l'incorporazione di un secondo galvo per consentire la scansione 2D raggiungerebbe questo obiettivo, ma richiederebbe l'integrazione di ottiche e meccanismi di controllo aggiuntivi nel progetto32. Abbiamo fornito maggiori dettagli sulle modifiche al sistema sulla pagina del nostro sito Web, insieme a collegamenti ad altre risorse utili relative al processo di progettazione23.

Oltre a migliorare i componenti specifici per questo particolare progetto, sarebbe molto fattibile aggiungere altre tecniche o modalità di microscopia ad alta risoluzione a questa build. Uno di questi miglioramenti sarebbe quello di incorporare l'illuminazione a più lunghezze d'onda, che comporterebbe l'allineamento di laser di eccitazione aggiuntivi al percorso di eccitazione originale8. Inoltre, poiché questo tipo di design SOLS lascia il campione accessibile, l'aggiunta di ulteriori funzioni al microscopio, tra cui, ma limitatamente, pinzette ottiche, microfluidica e reometria, è relativamente semplice 2,33.

Rispetto alla miriade di guide light-sheet che sono state pubblicate, questo protocollo fornisce istruzioni a un livello di comprensione che un utente senza una significativa esperienza ottica può trovare utile. Rendendo accessibile a un pubblico più ampio una build SOLS di facile utilizzo con le tradizionali capacità di montaggio dei vetrini campione, speriamo di consentire un'ulteriore espansione delle applicazioni della ricerca basata su SOLS in tutti i campi in cui lo strumento è stato o potrebbe essere utilizzato. Anche con le applicazioni degli strumenti SOLS in rapida crescita nel numero 2,34,35, crediamo che molti vantaggi e utilizzi degli strumenti di tipo SOLS rimangano ancora inesplorati ed esprimiamo entusiasmo per le possibilità di questo tipo di strumento in futuro.

La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) rappresenta una famiglia di tecniche di imaging a fluorescenza ad alta risoluzione in cui la luce di eccitazione è modellata in un foglio 1,2, tra cui la microscopia a illuminazione piana selettiva (SPIM), l'eccitazione planare ad allineamento confocale (SCAPE) e la microscopia a piano obliquo (OPM)3,4,5,6,7. A differenza di altre modalità di microscopia come l'epifluorescenza, la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) o la microscopia confocale, la fototossicità è minima nella LSFM e i campioni possono essere sottoposti a imaging su scale temporali più lunghe perché solo il piano del campione oggetto dell'imaging attivo è illuminato 8,9,10. Pertanto, le tecniche LSFM sono estremamente utili per l'imaging di campioni 3D per periodi di tempo prolungati, in particolare anche quelli troppo spessi per le tecniche di microscopia confocale. Per questi motivi, dal suo sviluppo originale nel 2004, LSFM è diventata la tecnica di imaging preferita da molti fisiologi, biologi dello sviluppo e neuroscienziati per la visualizzazione di interi organismi come pesci zebra vivi ed embrioni di Drosophila 3,4,6,11 . In questi ultimi due decenni, i vantaggi di LSFM sono stati sfruttati per visualizzare la struttura e la dinamica su scale progressivamente più piccole, tra cui la scalatissutale 11,12, cellulare e subcellulare, sia in vivo che in vitro13,14,15,17.
Nonostante le segnalazioni di casi d'uso di successo in letteratura, l'elevato costo dei sistemi LSFM commerciali (~0,25 milioni di dollari al momento della stesura di questo articolo)18,19 impedisce l'uso diffuso della tecnica. Per rendere le build fai-da-te un'alternativa fattibile per i ricercatori, sono state pubblicate diverse guide alla compilazione 8,13,20,21, tra cui lo sforzo ad accesso aperto OpenSPIM 22. Tuttavia, ad oggi, i ricercatori con un'esperienza ottica minima possono utilizzare solo progetti LSFM precedenti, che sono incompatibili con i tradizionali campioni montati su vetrino (Figura 1A). La recente implementazione SOLS (single-goal, light-sheet) utilizza un unico obiettivo sia per l'eccitazione che per il rilevamento (Figura 1C), superando così la limitazione relativa alla compatibilità 5,6,8,13,20. Tuttavia, il costo per la versatilità del progetto SOLS è un aumento sostanziale della complessità della costruzione a causa della necessità di due obiettivi aggiuntivi per trasmettere, de-inclinare e ricreare l'immagine del piano dell'oggetto sulla fotocamera per l'imaging (Figura 1D). Per facilitare l'accesso alle complesse configurazioni in stile SOLS, questo documento presenta una guida passo passo sulla progettazione, la costruzione, il processo di allineamento e l'uso di un sistema SOLS compatibile con le diapositive, che sarebbe utile ai ricercatori con conoscenza solo di un corso di ottica entry-level.
Sebbene il protocollo stesso sia succinto, i lettori devono fare riferimento ad altre risorse durante le fasi di preparazione per saperne di più su parti particolari del progetto o considerazioni sull'hardware. Tuttavia, se un lettore intende seguire le specifiche di questo progetto, potrebbe non essere necessario capire come selezionare particolari componenti ottici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Figura 1: Caratteristiche delle diverse configurazioni LSFM. (A) La configurazione con due obiettivi ortogonali comuni nei primi progetti LSFM. In questa configurazione, per contenere il campione viene utilizzato un tubo capillare o un cilindro di gel, che non è compatibile con le tradizionali tecniche di montaggio del vetrino. (B) Uno schema di un progetto di foglio luminoso SOLS che mostri quanto segue: (C) l'unico obiettivo utilizzato sia per l'eccitazione che per la raccolta delle emissioni sul piano del campione (O1); ciò consente di montare una slitta tradizionale sulla parte superiore e (D) il sistema di obiettivi a relè nel percorso di emissione SOLS. O2 raccoglie la luce di emissione e ingrandisce l'immagine. O3 riprende l'aereo con l'angolo di inclinazione corretto sul sensore della fotocamera. Abbreviazioni: LSFM = microscopia a fluorescenza a foglio luminoso; SOLS = foglio luminoso monoobiettivo; O1-O3 = obiettivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1&#34; Plano-Concave Lens f = -50 mm</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>LC1715-A-ML</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $49.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 100 mm (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A-ML</td>
			<td>L2, L4 and alignment laser 
			Estimated Cost: $342.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 125 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-125-A-ML</td>
			<td>SL2 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 150 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>L3 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 150 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A-ML</td>
			<td>TL2 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 45 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-045-A-ML</td>
			<td>L1 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Achromatic Doublet f = 75 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-075-A-ML</td>
			<td>SL1 
			Estimated Cost: $114.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Cylindrical Lens f = 100 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1567RM</td>
			<td>CL3 
			Estimated Cost: $117.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Cylindrical Lens f = 200 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1653RM</td>
			<td>CL2 
			Estimated Cost: $111.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Cylindrical Lens f = 50 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ1695RM</td>
			<td>CL1 
			Estimated Cost: $117.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Mounted Pinhole, 30 &#181;m Pinhole Diameter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P30K</td>
			<td>Estimated Cost: $77.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#34; Silver Mirror (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td>M1, M2, one for alignment 
			Estimated Cost: $168.78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#34; Elliptical Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PFE20-P01</td>
			<td>M3 
			Estimated Cost: $179.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#34; Post Holder (x11)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH2</td>
			<td>For custom laser mount, ND wheel, safety screens 
			Estimated Cost: $98.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#34; Posts (x47)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>For custom laser mount and optical components 
			Estimated Cost: $277.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; Posts (x4)&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>TR3</td>
			<td>For M3 supports and other mounts 
			Estimated Cost: $24.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; Post Holder (x4)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>PH3</td>
			<td>Estimated Cost: $38.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 to 60 mm Cage Adapter&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP33</td>
			<td>To mount O1 
			Estimated Cost: $45.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Cage Filter Wheel</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFW6</td>
			<td>To mount ND filters 
			Estimated Cost: $172.36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Cage Plate (x6)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP33</td>
			<td>To build alignment cage and alignment laser 
			Estimated Cost: $114.54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB1</td>
			<td>To mount M1 and M2 and for alignment laser 
			Estimated Cost: $463.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Post Holder (x30)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Estimated Cost: $320.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm Laser and Power Supply&#160;</td>
			<td>Opto Engine LLC</td>
			<td>MGL-FN-561-100mW</td>
			<td>Excitation laser 
			Estimated Cost: $6000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Cage Plate (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LCP01</td>
			<td>To mount TL1 and M3 mount 
			Estimated Cost: $88.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KCB2</td>
			<td>To mount M3 
			Estimated Cost: $187.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90&#176; Flip Mount</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>TRF90</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $95.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1A9</td>
			<td>To connect lens tube to camera 
			Estimated Cost: $20.96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1A10</td>
			<td>To connect tube lens to lens mount 
			Estimated Cost: $21.82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A12</td>
			<td>To mount O1 and O2 
			Estimated Cost: $47.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A27</td>
			<td>To mount O3 
			Estimated Cost: $22.38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment Disk</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1A7</td>
			<td>Estimated Cost: $20.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment Laser</td>
			<td>BISKEE</td>
			<td></td>
			<td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM 
			Estimated Cost: $16.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoluorescent Plastic Slide, Red&#160;</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>92001</td>
			<td>Estimated Cost: $20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Shutter&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1SH1</td>
			<td>To block laser light 
			Estimated Cost: $65.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage Rotation Mount (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CRM1T</td>
			<td>To mount CL1-3 
			Estimated Cost: $282.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 1&#34; (x8)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER1</td>
			<td>To mount M3 and O1 
			Estimated Cost: $44.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 3&#34; (x2)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER3</td>
			<td>To mount O3 
			Estimated Cost: $14.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 4&#34; (x4)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER4</td>
			<td>To mount slit 
			Estimated Cost: $30.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 8&#34; (x2)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>ER8</td>
			<td>For tube lens alignment 
			Estimated Cost: $25.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage System Rods 12&#34; (x8)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ER12</td>
			<td>For alignment cage 
			Estimated Cost: $145.36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Estimated Cost: ~$14,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping Fork (x35)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CF125</td>
			<td>To clamp down post mounts 
			Estimated Cost: $338.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 22 x 22 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td>For slide samples 
			Estimated Cost: $265</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic&#160;</td>
			<td>AVR</td>
			<td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td>
			<td>To split exciation/emission paths 
			Estimated Cost: $965</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12</td>
			<td>To translate pinhole 
			Estimated Cost: $90.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELHO600</td>
			<td>Estimated Cost: $140.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Glass Alignment Disk (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1</td>
			<td>For alignment cage and intermediate plane 
			Estimated Cost: $75.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>HP 33120A 15 MHz</td>
			<td>To control galvo 
			Estimated Cost: $900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometer - 1D Large Beam Diameter System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS011</td>
			<td>Estimated Cost: $1715.78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometer Power Supply</td>
			<td>Siglent</td>
			<td>SPD3303C</td>
			<td>Estimated Cost: $300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelrite</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G35020-100.0</td>
			<td>Gellan gum for 3D bead sample 
			Estimated Cost: $68.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Software</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate/ Stirrer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-220</td>
			<td>For preparing sample solutions 
			Estimated Cost: $550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Cube Brushed Motor Controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td>Drives Z825B 
			Estimated Cost: $757.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinematic Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100S</td>
			<td>To mount dichroic 
			Estimated Cost: $92.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesis Software</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Light Blocker&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>LB1</td>
			<td>For ND filter reflections 
			Estimated Cost: $57.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Mount</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>3D printed 
			Estimated Cost: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Safety Screen (x2)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>TPS4</td>
			<td>For blocking stray laser light 
			Estimated Cost: $92.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Tube Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200MP</td>
			<td>TL1 
			Estimated Cost: $1491</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Mount (x10)&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1</td>
			<td>To mount all lens and extra alignment mirror. 
			Estimated Cost: $164.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ruler</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BHM4</td>
			<td>To check alignment 
			Estimated Cost: $52.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager Software&#160;</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12550400</td>
			<td>For slide samples 
			Estimated Cost: $123.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Stage&#160;</td>
			<td>ASI</td>
			<td>FTP-2000 with custom parts</td>
			<td>To fine-translate samples 
			Estimated Cost: ~$16,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Vortex Mixer&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-688</td>
			<td>For sample preparation 
			Estimated Cost: $152.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z825B</td>
			<td>To fine-translate M1 
			Estimated Cost: $729.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Standard Iris (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID20</td>
			<td>At least 2 for alignment 
			Estimated Cost: $118.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ND Filter Set&#160;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NDK01&#160;</td>
			<td>To reduce excitation intensity 
			Estimated Cost: $726.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens 1</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td>
			<td>O1 
			Estimated Cost: ~$15,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens 2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TU Plan Fluor 100X/0.90&#160;</td>
			<td>O2 
			Estimated Cost: ~$6,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens 3</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>Plan Apo HR 50X/0.75</td>
			<td>O3 
			Estimated Cost: ~$6,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPM Deskewing Software</td>
			<td>Open-source</td>
			<td></td>
			<td>For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM 
			Estimated Cost: Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>S121C</td>
			<td>For measuring laser intensity 
			Estimated Cost: $379.68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Grid Distortion Target</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>R1L3S3P</td>
			<td>Brightfield alignment 
			Estimated Cost: $267.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Meter Digital Console</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>For measuring laser intensity 
			Estimated Cost: $1245.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J62315.14</td>
			<td>For fluorescent coated slide sample 
			Estimated Cost: $27.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for Posts</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>RA90</td>
			<td>For M3 support and flip down mirror 
			Estimated Cost: $32.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RMS-Threaded Cage Plate (x2)&#160;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>CP42</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $70.56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate 2.5-5.0 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI050P&#160;</td>
			<td>Estimated Cost: $182.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate 5.0-10.0 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI100P</td>
			<td>Estimated Cost: $201.47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate 10.0-25.4 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI254P</td>
			<td>Estimated Cost: $236.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shear Plate Viewing Screen</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SIVS</td>
			<td>Estimated Cost: $337.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SI035</td>
			<td>For checking collimation 
			Estimated Cost: $465.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slip-On Post Collar (x35)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>R2</td>
			<td>To maintain post height 
			Estimated Cost: $208.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VA100</td>
			<td>Estimated Cost: $294.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted Lens Tube, 3&#34;</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>SM1L30C</td>
			<td>For alignment laser 
			Estimated Cost: $77.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Mirror, 1 x 1&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0&#38;hva 
			did=642191768069&#38;hvpos=&#38;hvne 
			tw=g&#38;hvrand=1336734911900437 
			4691&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvqmt= 
			&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint=&#38; 
			hvlocphy=9031212&#38;hvtargid=pla-1 
			943952718742&#38;gclid=Cj0KCQiA6L 
			yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL 
			q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA 
			Lw_wcB&#38;th=1 
			Estimated Cost: $14.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable Lens Tube 1/2&#34; (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
			<td>To mount CL1-3 
			Estimated Cost: $40.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable Lens Tube 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L10</td>
			<td>To mount O3 
			Estimated Cost: $15.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackable Lens Tube 2&#34; (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
			<td>For camera path 
			Estimated Cost: $35.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studded Pedestal Base Adapter (x37)</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>BE1</td>
			<td>To attach post mounts to table 
			Estimated Cost: $400.71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translating Lens Mount (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY</td>
			<td>To fine-translate pinhole, O2 and O3 
			Estimated Cost: $441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation Stage with Standard Micrometer (x2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1/M</td>
			<td>TS1-2 
			Estimated Cost: $647.54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel Manual Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CT1A</td>
			<td>O3 cage translation mount 
			Estimated Cost: $497.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA20696</td>
			<td>TL3 
			Estimated Cost: $359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Mounted LED</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>MNWHL4</td>
			<td>Brightfield light source 
			Estimated Cost: $171.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTIONAL COMPONENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grasshopper3 USB3</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>&#160;GS3-U3-23S6C-C</td>
			<td>For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. 
			Estimated Cost: $1089</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and building of a customizable, single-objective, light-sheet fluorescence microscope for the visualization of cytoskeleton networks

I compositi del citoscheletro ricostituito sono emersi come un valido sistema modello per lo studio della materia soffice di non equilibrio. L'acquisizione fedele della dinamica di queste reti 3D e dense richiede il sezionamento ottico, che è spesso associato ai microscopi confocali a fluorescenza. Tuttavia, i recenti sviluppi della microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) l'hanno resa un'alternativa economica e, a volte, superiore. Per rendere LSFM accessibile ai ricercatori di citoscheletri che hanno meno familiarità con l'ottica, presentiamo una guida passo passo per principianti alla costruzione di un microscopio a fluorescenza versatile a foglio luminoso da componenti standard. Per consentire il montaggio del campione con i tradizionali campioni di vetrini, questo LSFM segue il design SOLS (single-objective light-sheet), che utilizza un unico obiettivo sia per l'eccitazione che per la raccolta delle emissioni. Descriviamo la funzione di ogni componente del SOLS in modo sufficientemente dettagliato da consentire ai lettori di modificare la strumentazione e progettarla in base alle loro esigenze specifiche. Infine, dimostriamo l'uso di questo strumento SOLS personalizzato visualizzando gli astri in reti di microtubuli guidate dalla chinesina.

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Sono state eseguite scansioni volumetriche di perle da 1 μm incorporate nella gomma di gellano. La Figura 14 mostra le proiezioni di intensità massima delle scansioni volumetriche raddrizzate lungo le direzioni x, y e z.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Figura 14: Imaging volumetrico di microsfere fluorescenti da 1 μm in gomma di gellano. Vengono mostrate le proiezioni di massima intensità delle scansioni volumetriche raddrizzate. Barre di scala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Abbiamo dimostrato l'uso del microscopio a foglio di luce monoobiettivo per caratterizzare reti di citoscheletri ricostituiti eseguendo scansioni volumetriche di campioni di astri microtubuli. In breve, i microtubuli marcati con rodamina e stabilizzati con taxolo sono stati polimerizzati da dimeri ricostituiti mediante GTP; quindi, dopo la polimerizzazione, i cluster motori della chinesina a base di streptavidina sono stati miscelati in campioni insieme all'ATP per concentrazioni finali di microtubuli da 6 μM, dimeri di chinesina da 0,5 μM e ATP da 10 mM. Protocolli e guide approfonditi per la preparazione di microtubuli stabilizzati con taxolo e cluster motori di chinesina sono disponibili sui siti web del Mitchson Lab e del Dogic Lab25,26. I campioni sono stati pipettati delicatamente in vetrini da microscopio, sigillati e lasciati riposare per 8 ore prima dell'imaging per consentire la cessazione dell'attività motoria in modo che i campioni raggiungessero uno stato strutturale stabile che assomigliava agli astri.
Gli studi sui sistemi di citoscheletro ricostituito impiegano più frequentemente la microscopia confocale o a epifluorescenza per l'immagine di filamenti marcati. Tuttavia, entrambe queste tecniche sono limitate nella loro capacità di visualizzare campioni 3D densi27. Mentre sono stati fatti molti progressi nella ricerca sulla materia attiva basata sul citoscheletro in vitro vincolando i campioni ad essere quasi 2D28,29, le reti di citoscheletro sono intrinsecamente 3D e molti sforzi attuali risiedono nella comprensione degli effetti che possono verificarsi solo nei campioni 3D29,30, creando così la necessità di imaging 3D ad alta risoluzione.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Figura 15: Facilitazione della visualizzazione 3D di campioni di citoscheletro ricostituiti mediante microscopia a foglio di luce a singolo obiettivo. (A) Immagini di astri di microtubuli fluorescenti acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica DMi8. Le immagini mostrano piani diversi da uno z-scan. Barra della scala = 30 μm. (B) Immagini raddrizzate deconvolute da una scansione volumetrica eseguita sulla configurazione del foglio luminoso a obiettivo singolo dello stesso campione. Barra della scala = 30 μm. L'area dell'immagine raddrizzata qui corrisponde al FoV utilizzabile (riquadro giallo) mostrato nella Figura 13B. Mentre il confocale eccelle nell'imaging di singoli piani vicino al vetrino coprioggetto, la densità del campione fluorescente introduce complicazioni quando si esegue l'imaging su piani più alti a causa del segnale aggiuntivo proveniente da sotto il piano di imaging. Il foglio luminoso aggira questo problema illuminando solo il piano di imaging, consentendo così un'immagine uniformemente nitida su diversi piani in z. Abbreviazioni: SOLS = foglio luminoso monoobiettivo; FoV = campo visivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Nella Figura 15, mostriamo l'imaging volumetrico di una rete di microtubuli ricostituita contratta in strutture simili ad aster da cluster motori di chinesina. Come mostrato in una precedente ricerca28,31, queste strutture 3D tendono a crescere dense verso il centro, risultando in regioni luminose di fluorescenza che sono predominanti nel segnale. Nei piani di imaging vicino al vetrino coprioggetto (basso livello z), la microscopia confocale (Figura 15A) può risolvere singoli filamenti intorno alla periferia dell'astro, con uno sfondo aggiuntivo verso il centro a causa dei segnali di fluorescenza fuori fuoco dall'alto. Tuttavia, spostandosi di alcuni micron in z si riduce rapidamente la qualità delle immagini a causa delle sezioni dense fuori fuoco dell'astro che sono predominanti nel segnale nel piano di imaging. L'illuminazione su un solo piano del foglio luminoso (Figura 15B) elimina i segnali sfocati dalle parti dense dell'astro sopra e sotto il piano di imaging, consentendo così una qualità dell'immagine comparabile tra i piani. La capacità del foglio luminoso di produrre dati di scansione volumetrica affidabili e di alta qualità apre la possibilità di visualizzare e caratterizzare fenomeni 3D in sistemi di citoscheletro ricostituiti.

Watch this Scientific Journal Video about Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks at JoVE.com

Author Spotlight: Advancing Knowledge in Far-From-Equilibrium Materials Through Light-Sheet Microscopy

Questo protocollo descrive in dettaglio come costruire un microscopio a fluorescenza a singolo obiettivo e il suo utilizzo per la visualizzazione di reti di citoscheletro.

Progettazione e costruzione di un microscopio a fluorescenza personalizzabile, monoobiettivo, a foglio luminoso per la visualizzazione di reti di citoscheletri

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Il nostro lavoro mira a far progredire le conoscenze sulla relazione tra le dinamiche di trans lavoro, la struttura locale e le proprietà meccaniche in materiali lontani dall'equilibrio. La visualizzazione di materiali lontani dall'equilibrio, come le reti di citoscheletro, richiede la capacità di visualizzare campioni densi e tridimensionali con una qualità dell'immagine comparabile in tutto il volume del campione, causando al contempo danni minimi tramite fotosbiancamento, un compito tecnicamente impegnativo per il quale la microscopia a fluorescenza è più adatta. I sistemi di microscopio a fluorescenza a foglio di luce offrono eccellenti capacità di sezionamento ottico, che consentono l'imaging di questi campioni spessi e tridimensionali per lunghe scale temporali con un fotosbiancamento minimo.In particolare, il sistema a foglio luminoso a singolo obiettivo che presenteremo è compatibile con i tradizionali campioni montati su vetrino, il che lo rende uno strumento molto versatile. La stragrande maggioranza delle guide a foglio luminoso a obiettivo singolo sono scritte per utenti con una vasta esperienza di ottica. Per rendere più accessibile la complessa configurazione in stile foglio luminoso a obiettivo singolo, questa guida dettagliata fornisce i passaggi che un utente con una conoscenza approfondita del corso di ottica entry-level può seguire.