Name: Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-05-12T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Dette arbejde modtog støtte fra et tilskud fra Japanese Society for the promotion of Science (bevilling nr. JP 23K14675).

Alle museforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Juntendo University School of Medicine (godkendelsesnummer 290238) og blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.
1. Generelle bemærkninger til eksperimentet
<ol><li>Anstald musene i individuelle bure i dyrefaciliteten under kontrollerede, patogenfrie forhold ved 23 °C ± 2 °C med 50 % ± 10 % fugtighed og en 12 timers lys/mørk cy...

Immunogenicity Enhancement by Mycobacterium paratuberculosis in Autoimmune Encephalomyelitis

<ol>
	<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+as+a+model+for+multiple+sclerosis+(MS).">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li><li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pertussis+toxin+induces+angiogenesis+in+brain+microvascular+endothelial+cells.">Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).</li><li>Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+adjuvants.">Mechanisms of action of adjuvants.</a> Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).</li><li>Kubota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+of+Mycobacteria-derived+mycolic+acids.">Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids.</a> Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).</li><li>Nicolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+in+the+adjuvant+modulates+the+balance+of+Th+immune+response+to+self-antigen+of+the+CNS+without+influencing+a+&amp;#34;core&amp;#34;+repertoire+of+specific+T+cells.">Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a &amp;#34;core&amp;#34; repertoire of specific T cells.</a> International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).</li><li>O'Connor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+immunotherapy+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+immature+myeloid+cells+expressing+CXCL10+and+CXCL16+attract+CXCR3+CXCR6++and+myelin-specific+T+cells+to+the+draining+lymph+nodes+rather+than+the+central+nervous+system.">Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system.</a> Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).</li><li>Libbey, J. E., Fujinami, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+as+a+testing+paradigm+for+adjuvants+and+vaccines.">Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines.</a> Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conflicting+role+of+Mycobacterium+species+in+multiple+sclerosis.">Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis.</a> Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+and+antigenic+properties+of+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+on+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).</li><li>Biet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopentapeptide+induces+a+strong+host+humoral+response+and+distinguishes+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+from+M.+avium+subsp.+avium.">Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium.</a> Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+humoral+immunity+to+mycobacterial+antigens+in+Japanese+patients+affected+by+inflammatory+demyelinating+diseases+of+the+central+nervous+system.">Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).</li><li>Cossu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucosal+immune+response+induced+by+oral+administration+of+heat-killed+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+exacerbates+EAE.">A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE.</a> Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Guerin+Tokyo-172+vaccine+provides+age-related+neuroprotection+in+actively+induced+and+spontaneous+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models.">Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models.</a> Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).</li></ol>

Vi demonstrerede en robust alternativ protokol til aktivt at inducere svær EAE i C57BL/6J-mus ved hjælp af peptidet MOG35-55 emulgeret i en adjuvans indeholdende M. paratuberculosis10. Induktion af EAE ved denne metode resulterede i en mere alvorlig sygdom end den, der blev induceret af den fælles protokol med CFA. Denne forskel kan skyldes de forskellige lipidiske komponenter i mykobakteriernes cellevæg11. Faktisk producerer M. paratuberculosis<...

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en fælles model til undersøgelse af humane demyeliniserende lidelser1. Der er flere modeller af EAE: aktiv immunisering ved anvendelse af forskellige myelinpeptider i kombination med potente adjuvanser, passiv immunisering ved in vitro-overførsel af myelinspecifikke CD4 + lymfocytter og transgene modeller af spontan EAE2. Hver af disse modeller har specifikke funktioner, der gør det muligt at studere forskellige aspekter af EAE, såsom starten, effektorfasen eller den kroniske fase. Myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG) modellen af EAE er en god model til at studere de immunmedierede mekanismer for kronisk neuroinflammation og demyelinisering, da den er karakteriseret ved mononukleær inflammatorisk infiltration, demyelinering i perifer hvid substans og reduceret genopretning efter sygdommens top1.
MOG-EAE induceres ved immunisering af modtagelige mus med peptidet MOG35-55 i komplet Freunds adjuvans (CFA) efterfulgt af en intraperitoneal injektion af kighostetoksin. Dette øger permeabiliteten af blod-hjerne-barrieren og tillader myelinspecifikke T-celler aktiveret i periferien at nå centralnervesystemet (CNS), hvor de vil blive genaktiveret3. CFA spiller en central rolle i induktionen af EAE ved at øge antigenoptagelsen af antigenpræsenterende celler og ekspressionen af cytokiner relateret til humoral- og cellemedierede reaktioner4. Denne mekanisme skyldes hovedsageligt tilstedeværelsen af dræbt Mycobacterium tuberculosis emulgeret i olie, hvis komponenter giver en stærk stimulus til immunsystemet5. Faktisk er induktionen af EAE direkte relateret til mængden af mycobacterium, der er til stede under den antigene udfordring6.
Tilsætningen af andre dræbte mykobakterier, såsom Mycobacterium butyricum, til ufuldstændig Freunds adjuvans7 samt effekten af adjuvanskombinationer8 kan modulere EAE's kliniske forløb og følgelig påvirke resultaternes reproducerbarhed. Mycobacterium avium underarter paratuberculosis (MAP), det ætiologiske middel til Johnes sygdom hos drøvtyggere, har været forbundet med inflammatoriske lidelser hos den humane CNS 9, da dets antigene komponenter er i stand til at fremkalde et stærkt humoral- og cellemedieret respons hos patienter med multipel sklerose og neuromyelitis optica spektrumforstyrrelse9. Derfor viser vi i denne protokol en alternativ og reproducerbar metode til at inducere MOG-EAE ved at erstatte M. tuberculosis i CFA med M. paratuberculosis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD115 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>135505</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>101215</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>117313</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>116004</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD8a&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>100753</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse I-A/I-E antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>107635</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly-6C&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>128023</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook OADC Enrichment</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BD 211886</td>
			<td>for isolation and cultivation of mycobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Charles River Laboratory, Japan</td>
			<td></td>
			<td>3 weeks old, male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 10279-106</td>
			<td>Gibco Life Techologies, USA</td>
			<td>42F9155K</td>
			<td>for cell culture, warm at 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer machine</td>
			<td>Eyela, Tokyo, Japan</td>
			<td>FDU-1200</td>
			<td>for bacteria lyophilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incomplete e Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Difco Laboratories, MD, USA</td>
			<td>263810</td>
			<td>for use in adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>Difco Laboratories, MD, USA</td>
			<td>90003-876</td>
			<td>help in the growth of Mycobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10</td>
			<td>ATCC, USA</td>
			<td>BAA-968</td>
			<td>bacteria from bovine origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated</td>
			<td>BD Biosciences, USA</td>
			<td>743-26880-EA</td>
			<td>for use in adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobactin J</td>
			<td>Allied Laboratory, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td>growth promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55</td>
			<td>AnaSpec, USA</td>
			<td>AS-60130-10</td>
			<td>encephalotigenic peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (257-264)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>S7951-1MG</td>
			<td>negative control antigen&#160; for proliferative assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin solution</td>
			<td>Fujifilm Wako, Osaka Japan</td>
			<td>168-22471</td>
			<td>From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytron homogenizer PT 3100</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td></td>
			<td>for mixing the antigen with the adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td>Gibco Life Techologies, USA</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>NET027W001MC</td>
			<td>for proliferation assay, use (1 &#956;Ci/well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>423105</td>
			<td>&#160;cytofluorimetry, for cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adjuvant activity of mycobacterium paratuberculosis in enhancing the immunogenicity of autoantigens during experimental autoimmune encephalomyelitis

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) induceret af myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG) kræver immunisering af et MOG-peptid emulgeret i komplet Freunds adjuvans (CFA) indeholdende inaktiveret Mycobacterium tuberculosis. De antigene komponenter i mycobakterien aktiverer dendritiske celler for at stimulere T-celler til at producere cytokiner, der fremmer Th1-responset via toll-lignende receptorer. Derfor er mængden og arten af mykobakterier, der er til stede under den antigene udfordring, direkte relateret til udviklingen af EAE. Dette metodepapir præsenterer en alternativ protokol til at inducere EAE i C57BL/6-mus ved hjælp af en modificeret ufuldstændig Freunds adjuvans indeholdende den varmedræbte Mycobacterium avium-underart paratuberkulosestamme K-10.
M. paratuberculosis, et medlem af Mycobacterium avium-komplekset, er årsagsmidlet til Johnes sygdom hos drøvtyggere og er blevet identificeret som en risikofaktor for flere humane T-cellemedierede lidelser, herunder multipel sklerose. Samlet set viste mus immuniseret med Mycobacterium paratuberculosis tidligere debut og større sygdomssværhedsgrad end mus immuniseret med CFA indeholdende stammen af M. tuberculosis H37Ra i de samme doser på 4 mg / ml. De antigene determinanter for Mycobacterium avium underarter paratuberculosis (MAP) stamme K-10 var i stand til at inducere et stærkt Th1-cellulært respons under effektorfasen, kendetegnet ved signifikant højere antal T-lymfocytter (CD4 + CD27 +), dendritiske celler (CD11c + I-A / I-E +) og monocytter (CD11b + CD115+) i milten sammenlignet med mus immuniseret med CFA. Desuden syntes det proliferative T-cellerespons på MOG-peptidet at være højest hos M. paratuberculosis-immuniserede mus. Anvendelsen af et encephalitogen (f.eks. MOG35-55) emulgeret i en adjuvans indeholdende M. paratuberculosis i formuleringen kan være en alternativ og valideret metode til aktivering af dendritiske celler til priming af myelinepitopspecifikke CD4+ T-celler under induktionsfasen af EAE.

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Grupper af C57BL/6 mus (total n = 15/gruppe) blev immuniseret med MOG35-55 i en emulsion indeholdende M. paratuberculosis eller ved den fælles metode med CFA. Alle grupper af mus manifesterede en akut monofasisk sygdom karakteriseret ved en enkelt top af handicap observeret efter 14-17 dage efterfulgt af en delvis genopretning af symptomer i løbet af de næste 10 dage (figur 1A). Mus, der var immuniseret med adjuvansen indeholdende M...

Watch this Scientific Journal Video about Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (Video) | JoVE 

Her præsenterer vi en alternativ protokol til aktivt at inducere eksperimentel autoimmun encephalomyelitis i C57BL/6-mus ved hjælp af den immunogene epitop myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG)35-55 suspenderet i ufuldstændig Freunds adjuvans indeholdende den varmedræbte Mycobacterium avium underart paratuberculosis.

Adjuverende aktivitet af Mycobacterium paratuberculosis til forbedring af immunogeniciteten af autoantigener under eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...

Vi studerede patogenesen af flere neurologiske sygdomme med nye teknikker udviklet af vores eksperter til at forbedre behandlingen af patienter med bevægelsesforstyrrelser, der har interaktive sygdomme. En del af vores forskning fokuserer på patogeners rolle og ætiologien af nye inflammatoriske sygdomme som multipel sklerose eller NMOSD, som er kendetegnet ved et komplekst samspil mellem genetiske og miljømæssige faktorer. Forskellige patogener har været forbundet med disse sygdomme, selvom deres rolle er uklar.Vi fandt, at antigene komponenter af Mycobacterium fuglecellearter paratuberkulose kan fremkalde en stærk humoral og cellemedieret respons hos patienter med multipel sklerose. Desuden demonstrerede vi, at mykobakterier giver indsat autogent potentiale ved at virke på tarmens immunhjerneakse i EAE-modellen. Vi identificerede Mycobacterium paratuberculosis som en potent adjuvanskandidat ved induktion af aktivt EAE, hvilket resulterede i en mere alvorlig sygdom end den, der blev induceret af inaktiveret Mycobacterium tuberculosis.Denne forskel kan skyldes, at Mycobacterium paratuberculosis producerer et lipopentapeptidantigen på cellevægsoverfladen i stedet for glycopeptidlipider. Et af målene med vores fremtidige forskning er at belyse krydstalen mellem immunresponset i det perifere og centrale nervesystem og at forstå mekanismen bag infektionsmedieret neuroinflammation. Til dette udviklede vi en unik genetisk model af neuroinflammationer.