Name: Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-05-12T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Detta arbete fick stöd från ett bidrag från Japanese Society for the promotion of Science (bidrag nr. JP 23K14675).

Alla musförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Juntendo University School of Medicine (godkännandenummer 290238) och genomfördes i enlighet med National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.
1. Allmänna kommentarer om experimentet
<ol><li>Inhysa mössen i enskilda burar i djuranläggningen under kontrollerade, patogenfria förhållanden vid 23 °C ± 2 °C med 50 % ± 10 % luftfuktighet och en 12 timmars ljus/mörk cyk...

Immunogenicity Enhancement by Mycobacterium paratuberculosis in Autoimmune Encephalomyelitis

<ol>
	<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).</li><li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+as+a+model+for+multiple+sclerosis+(MS).">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li><li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pertussis+toxin+induces+angiogenesis+in+brain+microvascular+endothelial+cells.">Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).</li><li>Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+adjuvants.">Mechanisms of action of adjuvants.</a> Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).</li><li>Kubota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+activity+of+Mycobacteria-derived+mycolic+acids.">Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids.</a> Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).</li><li>Nicolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+in+the+adjuvant+modulates+the+balance+of+Th+immune+response+to+self-antigen+of+the+CNS+without+influencing+a+&amp;#34;core&amp;#34;+repertoire+of+specific+T+cells.">Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a &amp;#34;core&amp;#34; repertoire of specific T cells.</a> International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).</li><li>O'Connor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+immunotherapy+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+immature+myeloid+cells+expressing+CXCL10+and+CXCL16+attract+CXCR3+CXCR6++and+myelin-specific+T+cells+to+the+draining+lymph+nodes+rather+than+the+central+nervous+system.">Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system.</a> Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).</li><li>Libbey, J. E., Fujinami, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+as+a+testing+paradigm+for+adjuvants+and+vaccines.">Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines.</a> Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conflicting+role+of+Mycobacterium+species+in+multiple+sclerosis.">Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis.</a> Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjuvant+and+antigenic+properties+of+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+on+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).</li><li>Biet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopentapeptide+induces+a+strong+host+humoral+response+and+distinguishes+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+from+M.+avium+subsp.+avium.">Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium.</a> Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+humoral+immunity+to+mycobacterial+antigens+in+Japanese+patients+affected+by+inflammatory+demyelinating+diseases+of+the+central+nervous+system.">Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).</li><li>Cossu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucosal+immune+response+induced+by+oral+administration+of+heat-killed+Mycobacterium+avium+subsp.+paratuberculosis+exacerbates+EAE.">A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE.</a> Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).</li><li>Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Guerin+Tokyo-172+vaccine+provides+age-related+neuroprotection+in+actively+induced+and+spontaneous+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models.">Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models.</a> Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).</li></ol>

Vi demonstrerade ett robust alternativt protokoll för att aktivt inducera svår EAE i C57BL / 6J-möss med peptiden MOG35-55 emulgerad i ett adjuvans innehållande M. paratuberculosis10. Induktionen av EAE med denna metod resulterade i en allvarligare sjukdom än den som inducerades av det gemensamma protokollet med CFA. Denna skillnad kan bero på de olika lipidkomponenterna i mykobakteriernas cellvägg11. I själva verket, till skillnad från andra my...

Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) är en vanlig modell för studier av humana demyeliniserande störningar1. Det finns flera modeller av EAE: aktiv immunisering med olika myelinpeptider i kombination med potenta adjuvanser, passiv immunisering genom in vitro-överföring av myelinspecifika CD4+ lymfocyter och transgena modeller av spontan EAE2. Var och en av dessa modeller har specifika funktioner som gör att olika aspekter av EAE kan studeras, såsom start, effektorfas eller kronisk fas. Myelinoligodendrocytglykoproteinmodellen (MOG) av EAE är en bra modell för att studera de immunmedierade mekanismerna för kronisk neuroinflammation och demyelinisering, eftersom den kännetecknas av mononukleär inflammatorisk infiltration, demyelinisering i perifer vit substans och minskad återhämtning efter sjukdomen topp1.
MOG-EAE induceras genom immunisering av känsliga möss med peptiden MOG35-55 i fullständigt Freunds adjuvans (CFA), följt av en intraperitoneal injektion av kikhostetoxin. Detta ökar permeabiliteten hos blod-hjärnbarriären och tillåter myelinspecifika T-celler aktiverade i periferin att nå centrala nervsystemet (CNS), där de kommer att reaktiveras3. CFA spelar en nyckelroll i induktionen av EAE genom att förbättra antigenupptaget av antigenpresenterande celler och uttrycket av cytokiner relaterade till humoral- och cellmedierade svar4. Denna mekanism beror huvudsakligen på närvaron av dödad Mycobacterium tuberculosis emulgerad i olja, vars komponenter ger en stark stimulans för immunsystemet5. Faktum är att induktionen av EAE är direkt relaterad till mängden mykobakterie närvarande under den antigena utmaningen6.
Tillägg av andra dödade mykobakterier, såsom Mycobacterium butyricum, till ofullständig Freunds adjuvans7, liksom effekten av adjuvanskombinationer8, kan modulera det kliniska förloppet av EAE och följaktligen påverka resultatens reproducerbarhet. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), det etiologiska medlet för Johnes sjukdom hos idisslare, har associerats med inflammatoriska störningar i humant CNS 9, eftersom dess antigena komponenter kan framkalla ett starkt humoralt och cellmedierat svar hos patienter med multipel skleros och neuromyelit optica spectrum disorder9. Därför visar vi i detta protokoll en alternativ och reproducerbar metod för att inducera MOG-EAE genom att ersätta M. tuberculosis i CFA med M. paratuberculosis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD115 antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>135505</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>101215</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>117313</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD16/32&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>116004</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD8a&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>100753</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse I-A/I-E antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>107635</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ly-6C&#160; antibody</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>128023</td>
			<td>for cytofluorimetry 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook OADC Enrichment</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BD 211886</td>
			<td>for isolation and cultivation of mycobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Charles River Laboratory, Japan</td>
			<td></td>
			<td>3 weeks old, male and female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS 10279-106</td>
			<td>Gibco Life Techologies, USA</td>
			<td>42F9155K</td>
			<td>for cell culture, warm at 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dryer machine</td>
			<td>Eyela, Tokyo, Japan</td>
			<td>FDU-1200</td>
			<td>for bacteria lyophilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incomplete e Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Difco Laboratories, MD, USA</td>
			<td>263810</td>
			<td>for use in adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>Difco Laboratories, MD, USA</td>
			<td>90003-876</td>
			<td>help in the growth of Mycobacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10</td>
			<td>ATCC, USA</td>
			<td>BAA-968</td>
			<td>bacteria from bovine origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated</td>
			<td>BD Biosciences, USA</td>
			<td>743-26880-EA</td>
			<td>for use in adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobactin J</td>
			<td>Allied Laboratory, MO, USA</td>
			<td></td>
			<td>growth promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55</td>
			<td>AnaSpec, USA</td>
			<td>AS-60130-10</td>
			<td>encephalotigenic peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (257-264)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>S7951-1MG</td>
			<td>negative control antigen&#160; for proliferative assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pertussis toxin solution</td>
			<td>Fujifilm Wako, Osaka Japan</td>
			<td>168-22471</td>
			<td>From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytron homogenizer PT 3100</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td></td>
			<td>for mixing the antigen with the adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td>Gibco Life Techologies, USA</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>NET027W001MC</td>
			<td>for proliferation assay, use (1 &#956;Ci/well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie NIR Fixable Viability Kit</td>
			<td>Biolegend, USA</td>
			<td>423105</td>
			<td>&#160;cytofluorimetry, for cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adjuvant activity of mycobacterium paratuberculosis in enhancing the immunogenicity of autoantigens during experimental autoimmune encephalomyelitis

Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) inducerad av myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) kräver immunisering av en MOG-peptid emulgerad i fullständigt Freunds adjuvans (CFA) innehållande inaktiverad Mycobacterium tuberculosis. De antigena komponenterna i mykobakterien aktiverar dendritiska celler för att stimulera T-celler att producera cytokiner som främjar Th1-svaret via tollliknande receptorer. Därför är mängden och arten av mykobakterier som finns under den antigena utmaningen direkt relaterade till utvecklingen av EAE. Detta metodpapper presenterar ett alternativt protokoll för att inducera EAE i C57BL / 6-möss med hjälp av en modifierad ofullständig Freunds adjuvans innehållande den värmedödade Mycobacterium avium-underarten paratuberculosis stam K-10.
M. paratuberculosis, en medlem av Mycobacterium avium-komplexet, är orsakssambandet till Johnes sjukdom hos idisslare och har identifierats som en riskfaktor för flera humana T-cellmedierade störningar, inklusive multipel skleros. Sammantaget visade möss immuniserade med Mycobacterium paratuberculosis tidigare debut och större sjukdomssvårighetsgrad än möss immuniserade med CFA innehållande stammen av M. tuberculosis H37Ra vid samma doser på 4 mg / ml. De antigena determinanterna för Mycobacterium avium-underarten paratuberculosis (MAP) stam K-10 kunde inducera ett starkt Th1-cellulärt svar under effektorfasen, kännetecknat av signifikant högre antal T-lymfocyter (CD4 + CD27 +), dendritiska celler (CD11c + I-A / I-E +) och monocyter (CD11b + CD115 +) i mjälten jämfört med möss immuniserade med CFA. Vidare verkade det proliferativa T-cellssvaret på MOG-peptiden vara högst hos M. paratuberkulosimmuniserade möss. Användning av en encefalitogen (t.ex. MOG35-55) emulgerad i ett adjuvans innehållande M. paratuberculosis i formuleringen kan vara en alternativ och validerad metod för att aktivera dendritiska celler för priming av myelinepitopspecifika CD4+ T-celler under induktionsfasen av EAE.

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Grupper av C57BL/6-möss (totalt n = 15/grupp) immuniserades med MOG35-55 i en emulsion innehållande M. paratuberculosis eller med den vanliga metoden med CFA. Alla grupper av möss manifesterade en akut monofasisk sjukdom som kännetecknades av en enda topp av funktionshinder observerad vid 14-17 dagar, följt av en partiell återhämtning av symtom under de närmaste 10 dagarna (figur 1A). Möss immuniserade med adjuvansen innehållande...

Watch this Scientific Journal Video about Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (Video) | JoVE 

Här presenterar vi ett alternativt protokoll för att aktivt inducera experimentell autoimmun encefalomyelit hos C57BL/6-möss, med användning av det immunogena epitopmyelinoligodendrocytglykoproteinet (MOG)35-55 suspenderat i ofullständig Freunds adjuvans innehållande den värmedödade Mycobacterium avium-underarten paratuberkulos.

Adjuvant aktivitet av Mycobacterium paratuberculosis för att förbättra immunogeniciteten hos autoantigener under experimentell autoimmun encefalomyelit

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...

Vi studerade patogenesen av flera neurologiska sjukdomar med nya tekniker utvecklade av våra experter för att förbättra behandlingen för patienter med rörelsestörningar som har interaktiva sjukdomar. En del av vår forskning fokuserar på patogeners roll och etiologin för nya inflammatoriska sjukdomar som multipel skleros eller NMOSD, som kännetecknas av ett komplext samspel mellan genetiska och miljömässiga faktorer. Olika patogener har associerats med dessa sjukdomar, även om deras roll är oklar.Vi fann att antigena komponenter i Mycobacterium avian cell arter paratuberculosis kan framkalla ett starkt humoralt och cellmedierat svar hos patienter med multipel skleros. Vidare visade vi att Mycobacteria ger infälld autogen potential genom att verka på tarmens immuna hjärnaxel i EAE-modellen. Vi identifierade Mycobacterium paratuberculosis som en potent adjuvanskandidat vid induktion av aktiv EAE, vilket resulterade i en allvarligare sjukdom än den som inducerades av inaktiverad Mycobacterium tuberculosis.Denna skillnad kan bero på att Mycobacterium paratuberculosis producerar ett lipopentapeptidantigen på cellväggsytan istället för glykopeptidlipider. Ett av målen med vår framtida forskning är att belysa överhörningen mellan immunsvaret i perifera och centrala nervsystemet, och att förstå mekanismen för infektionsmedierad neuroinflammation. För detta utvecklade vi en unik genetisk modell av neuroinflammationer.