Name: Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-02T12:55:00
Duration: 2 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis at JoVE.com

लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए कैथरीन फिल्पो लोपेज़ को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एलपी को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (GM122589 और AG051047) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
इन अध्ययनों ने कोलंबिया विश्वविद्यालय में हर्बर्ट इरविंग कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर के कॉन्फोकल और स्पेशलाइज्ड माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन का उपयोग किया, जिसे एनआईएच / एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट P30CA013696 के माध्यम से वित्त पोषित किया गया।

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

इस प्रोटोकॉल में, जीवित नवोदित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2का आकलन करने के लिए बायोसेंसर के रूप में एमटीहाइपर 7 का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। बायोसेंसर का निर्माण सीआरआईएसपीआर-आधारित विधि का उपयोग करके किया जाता है और चयन योग्य मार्करों के उपयोग के बिना खमीर जीनोम में एक संरक्षित जीन-मुक्त क्षेत्र में पेश किया जाता है। प्लास्मिड-जनित बायोसेंसर की तुलना में, एकीकृत लोगों को सभी कोशिकाओं में और लगातार स्तरों पर व्यक्त किया जाता है, जो अधिक विश्वसनीय परिमाणीकरण परिणाम प्रदान करते हैं। एमटीहाइपर 7-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कोई चयन योग्य मार्कर ों का उपयोग नहीं किया जाता है, जो तनाव पृष्ठभूमि की एक विस्तृत श्रृंखला के उपयोग की अनुमति देता है और बायोसेंसर-व्यक्त कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन की सुविधा प्रदान करता है। एमटीहाइपर 7 प्रोटीन को माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, कार्य, वितरण या सेलुलर विकास दर पर ध्यान देने योग्य प्रभाव के बिना माइटोकॉन्ड्रिया को सही ढंग से लक्षित किया जाता है। mtHyPer7 बाहरी रूप से जोड़े गए H 2 O2के लिए एक खुराक-निर्भर प्रतिक्रिया दिखाताहै। इसके अलावा, एमटीहाइपर 7 उपकोशिकीय संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता की विविधता पर रिपोर्ट करने में सक्षम है। अंत में, इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल-लक्षित बायोसेंसर के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के विपरीत स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने से फ्लोरोफोरे को कम फोटोब्लीचिंग होती है और उपकोशिकीय मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां उत्पन्न होती हैं।
सीमाएं और वैकल्पिक दृष्टिकोण यह विधि 10 मिनट से अधिक समय तक इमेजिंग कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि कोशिकाएं कवरस्लिप के नीचे सूख जाएंगी। लंबी अवधि की इमेजिंग के लिए, अगर पैड विधि46 का उपयोग करना या एससी माध्यम से भरे ग्लास-बॉटम कल्चर डिश में कोशिकाओं को गतिहीन करना बेहतर है।
बायोसेंसर की पसंद प्रयोगात्मक परिस्थितियों में लक्ष्य की एकाग्रता द्वारा निर्देशित होनी चाहिए। यदि HyPer7 की संवेदनशीलता बहुत अधिक है, तो एक अलग HyPer संस्करण की सिफारिश की जाएगी, जैसे HyPer3 या HyPerRed47,48। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य हाइपर जांच अधिक पीएच-संवेदनशील हैं। उच्च संवेदनशीलता के लिए, पेरोक्सीरेडॉक्सिन-आधारित आरओजीएफपी अधिक उपयुक्त हो सकता है (roGFP2Tsa2ΜCR)27.
एच 2 ओ2सेंसर की ऑक्सीकरण स्थिर स्थिति ऑक्सीकरण और कमी दर दोनों से जुड़ी है। बायोसेंसर की ऑक्सीकरण दर मुख्य रूप से एच 2 ओ2के कारण होती है, लेकिन कमी दर सेल और ऑर्गेनेल में सक्रिय एंटीऑक्सिडेंट कमी प्रणालियों पर निर्भर करती है। यह दिखाया गया है कि हाइपर 7 मुख्य रूप से खमीर साइटोसोल में थियोरेडॉक्सिन प्रणाली द्वारा कम हो जाता है, और इसकी कमी आरओजीएफपी 2टीएसए 2 2 सीआर27 की तुलना में तेजी से होती है। इसलिए, एच 2 ओ2बायोसेंसर के माप की व्याख्या करते समय जांच के विभिन्न कमी तंत्र और प्रतिक्रिया गतिशीलता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। विशेष रूप से, बायोसेंसर रीडआउट से एच 2 ओ2स्तरों का अनुमान लगाने के लिए, यह माना जाना चाहिए कि प्रयोग के दौरान कमी प्रणाली एक निरंतर क्षमता बनाए रखती है। यहां वर्णित स्क्रिप्ट के विकल्प के रूप में, रेडॉक्स सेंसर49 के विश्लेषण के लिए कई अन्य सॉफ्टवेयर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कराए गए हैं।
महत्वपूर्ण कदम किसी भी बायोसेंसर के साथ, यह प्रदर्शित करना महत्वपूर्ण है कि बायोसेंसर स्वयं मापी जा रही प्रक्रिया को प्रभावित नहीं करता है। इसलिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के तहत उपभेदों के विकास और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान की तुलना करना महत्वपूर्ण है। यहां, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन माइटोट्रैकर रेड का उपयोग करके किया जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया को झिल्ली संभावित-निर्भर तरीके से दाग देता है। हालांकि, अपरिवर्तित और बायोसेंसर-रूपांतरित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की तुलना टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम), एक वैकल्पिक झिल्ली क्षमता-संवेदी माइटोकॉन्ड्रियल महत्वपूर्ण डाई, या मिटोट्रैकर ग्रीन के साथ धुंधला करके पूरा किया जा सकता है, जो झिल्ली क्षमता से स्वतंत्र माइटोकॉन्ड्रिया को दाग देता है। यदि हानिकारक प्रभावों का संदेह है, तो अभिव्यक्ति स्तर को कम करने या एकीकरण साइट को बदलने में मदद मिल सकती है।
मजबूत परिणाम एकत्र करने के लिए जांच के खुराक-प्रतिक्रिया व्यवहार और इमेजिंग तकनीक के सिग्नल-टू-शोर अनुपात को मान्य करना भी आवश्यक है। यदि किसी समूह के भीतर परिवर्तनशीलता समूहों के बीच परिवर्तनशीलता से अधिक है, तो मतभेदों का पता लगाना मुश्किल हो जाता है। इंट्राग्रुप परिवर्तनशीलता वास्तविक जनसंख्या भिन्नता, या पहचान प्रक्रिया में शोर के परिणामस्वरूप हो सकती है। सिग्नल: शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण कदम छवि अधिग्रहण (पिक्सेल मूल्य सीमा और शोर), पृष्ठभूमि घटाव और थ्रेशोल्डिंग हैं।
गणना चरणों के दौरान शोर प्रभाव को भी कम किया जा सकता है। सबसे सीधा तरीका अनुपात छवि माप (परिणाम .csv) से भारित औसत तीव्रता की गणना करना है, जहां प्रत्येक पिक्सेल उत्तेजना क्षमता के बीच स्थानीय अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक "पिक्सेलवाइज" अनुपात पैदा करता है। हालांकि, यदि छवि संकेत: शोर अनुपात कम है, तो प्रगणक और भाजक चैनलों दोनों में आरओआई के लिए भारित औसत तीव्रता की गणना करके और फिर इन दो भारित साधनों ("क्षेत्रवार" अनुपात) के बीच अनुपात की गणना करके अधिक मजबूत परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।
थ्रेशोल्डिंग विधि का चयन करने के लिए, फिजी कमांड इमेज | समायोजित करें | ऑटो थ्रेशोल्ड का उपयोग स्वचालित रूप से सभी अंतर्निहित फिजी विधियों को आज़माने के लिए किया जा सकता है। विभाजन (थ्रेशोल्डिंग) का मूल्यांकन करने के लिए, एक सहेजे गए मास्क को संपादित करें पर क्लिक करके चयन में परिवर्तित किया जाता है चयन | चयन बनाएँ, ROI प्रबंधक में जोड़ा गया ( T दबाकर), और फिर कच्ची छवि फ़ाइल पर सक्रिय करें। यदि माइटोकॉन्ड्रिया का पर्याप्त रूप से पता नहीं लगाया जाता है, तो एक अलग विभाजन विधि का प्रयास किया जाना चाहिए।
छवियों की तुलना करते समय, समान इमेजिंग स्थितियों के साथ सभी छवियों को प्राप्त करना आवश्यक है, साथ ही समान विपरीत वृद्धि के साथ सभी छवियों को प्रदर्शित करना आवश्यक है।
इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करते समय माइटोकॉन्ड्रियल आंदोलन पर विचार किया जाना चाहिए। यदि माइटोकॉन्ड्रिया 405 और 488 एनएम पर उत्तेजना के बीच काफी आगे बढ़ते हैं, तो अनुपात छवि सटीक नहीं होगी। एक्सपोजर समय <500 एमएस रखने और उपलब्ध सबसे तेज़ विधि (जैसे ट्रिगर पल्स या एकोस्टो-ऑप्टिक टैपेबल फिल्टर) द्वारा उत्तेजना को बदलने की सिफारिश की जाती है। जेड स्टैक को कैप्चर करते समय, अगले जेड चरण में जाने से पहले प्रत्येक जेड चरण के लिए दोनों उत्तेजना ओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
परिणामों के प्रदर्शन के लिए, तीव्रता में परिवर्तन की तुलना में मानव आंखों के लिए रंग (रंग) में परिवर्तन अधिक स्पष्ट हैं। इसलिए, अनुपात मान को आसान दृश्य व्याख्या के लिए रंग पैमाने में परिवर्तित किया जाता है। रंगीन छवियों को अनमॉड्यूलेटेड किया जा सकता है, जहां सभी माइटोकॉन्ड्रियल पिक्सेल एक ही चमक, या तीव्रता-मॉड्यूलेटेड पर दिखाई देते हैं, जहां मूल छवि में पिक्सेल तीव्रता का उपयोग रंगीन छवि में तीव्रता सेट करने के लिए किया जाता है।
संशोधन और समस्या निवारण पैराक्वाट के साथ चुनौती द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की पुष्टि करने के विकल्प के रूप में, कोशिकाओं को प्रतिकृति-चढ़ाया जा सकता है या किण्वनीय और गैर-किण्वनीय कार्बन स्रोतों में टीका लगाया जा सकता है।
पृष्ठभूमि घटाव के लिए, रोलिंग बॉल घटाव (प्रक्रिया पर नेविगेट करके ) पृष्ठभूमि घटाएं ...) रोशनी की गैर-एकरूपता को दूर करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि कोशिकाओं की उपस्थिति पृष्ठभूमि को घटाए जाने में बदलाव नहीं करती है ( पृष्ठभूमि बनाने और परिणाम की जांच करने के विकल्प की जांच करके)।
सारांश में, एमटीहाइपर 7 जांच जीवित कोशिकाओं में खमीर माइटोकॉन्ड्रिया की रूपात्मक और कार्यात्मक स्थिति से संबंधित एक सुसंगत, न्यूनतम इनवेसिव विधि प्रदान करती है, और आनुवंशिक रूप से साध्य, आसानी से सुलभ मॉडल प्रणाली में एक महत्वपूर्ण सेलुलर तनाव और सिग्नलिंग अणु के अध्ययन की अनुमति देती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, या कार्यात्मक परिवर्तन, कई बीमारियों और स्थितियों में पाया जाता है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव और मस्कुलोस्केलेटल विकार, कैंसर और सामान्य उम्र बढ़ने शामिल हैं। यहां, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड, न्यूनतम इनवेसिव, अनुपातमेट्रिक बायोसेंसर का उपयोग करके सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्पों पर जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। बायोसेंसर, माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित हाइपर 7 (एमटीएचवाईपर 7), माइटोकॉन्ड्रिया में हाइड्रोजनपेरोक्साइड (एच 2 ओ2) का पता लगाता है। इसमें एक माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल अनुक्रम होता है जो एक गोलाकार फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक बैक्टीरियल ऑक्सीआर प्रोटीन के एच 2 ओ2-उत्तरदायीडोमेन से जुड़ा होता है। बायोसेंसर को सीआरआईएसपीआर-कैस 9 मार्कर-मुक्त प्रणाली का उपयोग करके खमीर जीनोम में उत्पन्न और एकीकृत किया जाता है, जो प्लास्मिड-जनित संरचनाओं की तुलना में अधिक सुसंगत अभिव्यक्ति के लिए होता है।
एमटीहाइपर 7 मात्रात्मक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित है, खमीर विकास दर या माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं है, और सामान्य विकास स्थितियों के तहत और ऑक्सीडेटिव तनाव के संपर्क में माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2के लिए एक मात्रात्मक रीडआउट प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग करके इमेजिंग स्थितियों को कैसे अनुकूलित किया जाए और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक विश्लेषण किया जाए। ये उपकरण कोशिकाओं के भीतर और आबादी में कोशिकाओं के बीच माइटोकॉन्ड्रिया पर समृद्ध स्थानिक जानकारी एकत्र करना संभव बनाते हैं। इसके अलावा, यहां वर्णित वर्कफ़्लो का उपयोग अन्य बायोसेंसर को मान्य करने के लिए किया जा सकता है।

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

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Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2 ओ2) ऑक्सीडेटिव क्षति और सिग्नलिंग अणु दोनों का स्रोत है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि जीवित खमीरमें माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित हाइपर 7 (एमटीएचवाईपर 7), आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अनुपातमीट्रिक बायोसेंसर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल एच 2 ओ2 को कैसे मापा जाए। यह बताता है कि इमेजिंग स्थितियों को कैसे अनुकूलित किया जाए और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मात्रात्मक सेलुलर और उपकोशिकीय विश्लेषण किया जाए।

जीवित खमीर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल पेरोक्साइड के लिए एक अनुपातमीट्रिक बायोसेंसर, एमटीहाइपर 7 की इमेजिंग

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं के भीतर ऑर्गेनेल हैं जो ऊर्जा जुटाने, केंद्रीय चयापचय, महत्वपूर्ण मैक्रोमोलेक्यूल्स के उत्पादन, कैल्शियम भंडारण और सिग्नल ट्रांसडक्शन की सुविधा प्रदान करते हैं। नतीजतन, वे सेलुलर फ़ंक्शन, फिटनेस और जीवनकाल नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हमारा शोध एक मॉडल जीव के रूप में उभरते खमीर सैकरोमाइसेस सेरेविसिया का उपयोग करके उम्र बढ़ने पर माइटोकॉन्ड्रिया के प्रभाव की जांच करने पर केंद्रित है।लाइव सेल इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में भिन्नता का निरीक्षण करने के लिए हमारा सबसे अच्छा उपकरण है। यहां हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अनुपात मीट्रिक स्पेक्ट्रल शिफ्टिंग बायोसेंसर का उपयोग करता है जिसे माइटोकॉन्ड्रियल हाइपर 7 कहा जाता है। एमटीहाइपर 7 हाइड्रोजन पेरोक्साइड, एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति का पता लगाता है, जो सेलुलर घटकों को नुकसान पहुंचा सकता है, लेकिन जीवित कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया में एक सिग्नलिंग अणु के रूप में भी कार्य करता है।mtHyPer7 हाइड्रोजन पेरोक्साइड के लिए एक उच्च संबंध और पीएच के लिए कम संवेदनशीलता है। यह खमीर जीनोम में एकीकृत है, जिसके परिणामस्वरूप खमीर कोशिका आबादी में स्थिर और सुसंगत अभिव्यक्ति होती है। अंत में, यह मात्रात्मक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को लक्षित है और सेलुलर या माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन या फिटनेस पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं है।एमटीहाइपर 7 जैसे बायोसेंसर उपकोशिकीय संकल्प पर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण में अंतर्निहित तंत्र खोजने के लिए, और यह जांचने के लिए कि यह प्रक्रिया सेल फिटनेस, फ़ीड और जीवनकाल को कैसे प्रभावित करती है। एमटीहाइपर 7 दाग प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्बनिक रंगों के विपरीत लगातार श्रम प्रदान करता है। फ्रेट-आधारित सेंसर की तुलना में, एमटीहाइपर 7 अधिक कॉम्पैक्ट है और क्रॉस-उत्तेजना और रक्तस्राव जैसे मुद्दों से बचता है, साथ ही सटीक स्थिति और फ्रेट के लिए अभिविन्यास आवश्यकताओं से भी बचता है।