Name: Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights at JoVE.com

Das M.E.H. bedankt sich bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Projektnummer 413985647, für die finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians-Universität München, für seine großzügige und umfangreiche Unterstützung. Wir danken Walter Neupert für seinen wissenschaftlichen Input, seine hilfreichen Diskussionen und seine kontinuierliche Inspiration. J.F. bedankt sich bei der Graduate School Life Science Munich (LSM) für die Unterstützung.

1. Puffer und Vorratslösungen
<ol><li>Stellen Sie eine 1 M große 3-Morpholinopropan-1-sulfonsäure (MOPS)-Lösung in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 7,4 her. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 8,0 vor. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 2,4 M Sorbit in deionisiertem Wasser vor. Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>2,5 M Saccharose in entionisiertem Wasser zu...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

Die mitochondriale Subfraktionierung ist ein kompliziertes Experiment mit mehreren hochkomplexen Schritten. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, unsere etablierte Methode32 weiter zu verbessern und bis zu einem gewissen Grad zu vereinfachen. Die Herausforderungen lagen hier in der Anforderung an komplizierten und hochspezialisierten Geräten, bei denen es sich oft um Einzelkonstruktionen handelt, sowie dem enormen Zeit- und Energieverbrauch. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die Pumpen und Einz...

Mitochondrien erfüllen in Eukaryoten eine Vielzahl unterschiedlicher Funktionen, wobei die bekannteste die Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung ist. Weitere Funktionen sind die Produktion von Eisen-Schwefel-Clustern, die Lipidsynthese und in höheren Eukaryoten die Ca2+-Signalgebung und die Induktion der Apoptose 1,2,3,4. Diese Funktionen sind untrennbar mit ihrer komplexen Ultrastruktur verbunden.
Die mitochondriale Ultrastruktur wurde erstmals mittels Elektronenmikroskopie5 beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass Mitochondrien ziemlich komplexe Organellen sind, die aus zwei Membranen bestehen: der mitochondrialen Außenmembran und der mitochondrialen Innenmembran. Somit werden von diesen Membranen zwei wässrige Kompartimente gebildet: der Intermembranraum und die Matrix. Die mitochondriale Innenmembran kann noch weiter in verschiedene Abschnitte unterteilt werden. Die innere Grenzmembran bleibt in unmittelbarer Nähe zur äußeren Membran, und die Cristae bilden Einstülpungen. Sogenannte Crista Junctions verbinden die innere Grenzmembran mit den Cristae (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen osmotisch geschrumpfter Mitochondrien, dass es Stellen gibt, an denen die Mitochondrienmembranen fest miteinander verbunden sind 6,7. Diese sogenannten Kontaktstellen werden von Proteinkomplexen gebildet, die die beiden Membranen überspannen (Abbildung 1). Es wird angenommen, dass diese Interaktionsstellen aufgrund ihrer Bedeutung für die Regulierung der mitochondrialen Dynamik und Vererbung sowie für den Transfer von Metaboliten und Signalen zwischen dem Zytosol und der Matrix für die Lebensfähigkeit von Zellen unerlässlich sind8.
Der MICOS-Komplex in der mitochondrialen Innenmembran ist wahrscheinlich der am besten charakterisierte und vielseitigste kontaktstellenbildende Komplex. MICOS wurde 2011 in Hefe beschrieben und besteht aus sechs Untereinheiten 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 und Mic10. Diese bilden einen Komplex von ca. 1,5 MDa, der an den Crista-Kontakten 9,10,11 lokalisiert ist. Die Deletion einer der beiden Kernuntereinheiten, Mic10 oder Mic60, führt zum Fehlen dieses Komplexes 9,11, was bedeutet, dass diese beiden Untereinheiten für die Stabilität von MICOS essentiell sind. Interessanterweise bildet MICOS nicht nur eine, sondern mehrere Kontaktstellen mit verschiedenen mitochondrialen äußeren Membranproteinen und -komplexen: dem TOM-Komplex 11,12, dem TOB/SAM-Komplex 9,12,13,14,15,16, dem Fzo1-Ugo1-Komplex9,Por1 10, OM45 10 und Miro 17. Dies deutet stark darauf hin, dass der MICOS-Komplex an verschiedenen mitochondrialen Prozessen beteiligt ist, wie z. B. dem Proteinimport, dem Phospholipidstoffwechsel und der Bildung der mitochondrialen Ultrastruktur18. Die letztgenannte Funktion ist wahrscheinlich die Hauptfunktion von MICOS, da das Fehlen des MICOS-Komplexes, der durch die Deletion von MIC10 oder MIC60 induziert wird, zu einer abnormen mitochondrialen Ultrastruktur führt, der es praktisch vollständig an regelmäßigen Cristae mangelt. Stattdessen akkumulieren interne Membranvesikel ohne Verbindung zur inneren Grenzmembran19, 20. Wichtig ist, dass MICOS in Form und Funktion von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist21. Die Assoziation von Mutationen in MICOS-Untereinheiten mit schweren menschlichen Erkrankungen unterstreicht auch seine Bedeutung für höhere Eukaryoten22,23. Obwohl MICOS sehr vielseitig ist, müssen zusätzliche Kontaktstellen vorhanden sein (basierend auf unseren unveröffentlichten Beobachtungen). In der Tat wurden mehrere andere Kontaktstellen identifiziert, zum Beispiel die mitochondrialen Fusionsmaschinen Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 oder Mdm31-Por1, das an der Biosynthese des mitochondrial-spezifischen Phospholipids Cardiolipin beteiligt ist 27. Kürzlich haben wir die Methode, die uns zur Identifizierung von MICOS führte, verbessert, um Cqd1 als Teil einer neuartigen Kontaktstelle zu identifizieren, die mit dem äußeren Membrankomplex Por1-Om1428 gebildet wurde. Interessanterweise scheint diese Kontaktstelle auch an mehreren Prozessen wie der Homöostase der mitochondrialen Membran, dem Phospholipidstoffwechsel und der Verteilung von Coenzym Q28,29 beteiligt zu sein.
Hier haben wir eine Variation der zuvor beschriebenen Fraktionierung der Mitochondrien 9,30,31,32,33 verwendet. Die osmotische Behandlung von Mitochondrien führt zur Störung der mitochondrialen Außenmembran und zu einer Schrumpfung des Matrixraums, so dass die beiden Membranen nur noch an Kontaktstellen in unmittelbarer Nähe sind. Dies ermöglicht die Erzeugung von Vesikel, die ausschließlich aus der mitochondrialen Außenmembran oder der mitochondrialen Innenmembran bestehen oder an Kontaktstellen beider Membranen durch milde Beschallung enthalten. Da die mitochondriale Innenmembran ein viel höheres Protein-zu-Lipid-Verhältnis aufweist, weisen mitochondriale Innenmembranvesikel im Vergleich zu mitochondrialen Außenmembranvesikeln eine höhere Dichte auf. Der Dichteunterschied kann genutzt werden, um die Membranvesikel durch Saccharose-Auftriebsdichtegradientenzentrifugation zu trennen. So akkumulieren die mitochondrialen äußeren Membranvesikel bei niedrigen Saccharosekonzentrationen, während die mitochondrialen inneren Membranvesikel bei hohen Saccharosekonzentrationen angereichert sind. Die Vesikel, die Kontaktstellen enthalten, konzentrieren sich bei mittleren Saccharosekonzentrationen (Abbildung 2). Das folgende Protokoll beschreibt diese verbesserte Methode, die im Vergleich zu unserer zuvor etablierten Methode32 weniger spezialisierte Ausrüstung, Zeit und Energie erfordert, im Detail und bietet ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung möglicher Proteine an der Kontaktstelle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

Mitochondrien sind in praktisch allen eukaryotischen Zellen vorhanden und erfüllen essentielle Funktionen, die weit über die Energiegewinnung hinausgehen, z. B. die Synthese von Eisen-Schwefel-Clustern, Lipiden oder Proteinen, die Ca2+ -Pufferung und die Induktion von Apoptose. Ebenso führt eine mitochondriale Dysfunktion zu schweren menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Neurodegeneration. Um diese Funktionen erfüllen zu können, müssen die Mitochondrien über ihre Hülle, die aus zwei Membranen besteht, mit dem Rest der Zelle kommunizieren. Daher müssen diese beiden Membranen ständig miteinander interagieren. Proteinhaltige Kontaktstellen zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien sind dabei essentiell. Bisher wurden mehrere Kontaktstellen identifiziert. Bei der hier beschriebenen Methode werden die Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae verwendet, um Kontaktstellen zu isolieren und so Kandidaten zu identifizieren, die für Kontaktstellenproteine in Frage kommen. Wir haben diese Methode verwendet, um den mitochondrialen Kontaktstellen- und Cristae-Organisierungssystem-Komplex (MICOS) zu identifizieren, einen der wichtigsten kontaktstellenbildenden Komplexe in der mitochondrialen Innenmembran, der von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist. Kürzlich haben wir diese Methode weiter verbessert, um eine neue Kontaktstelle zu identifizieren, die aus Cqd1 und dem Por1-Om14-Komplex besteht.

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Es ist relativ einfach, die innere und äußere Membran der Mitochondrien zu trennen. Die Erzeugung und Trennung von Vesikeln, die Kontaktstellen enthalten, ist jedoch wesentlich schwieriger. Unserer Meinung nach sind zwei Schritte entscheidend und wesentlich: die Beschallungsbedingungen und der verwendete Gradient.
In der Regel wird angenommen, dass lineare Farbverläufe im Vergleich zu Stufengradienten eine bessere Auflösung haben. Ihre reproduzierbare Herstellung ist jedoch langwierig und ...

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Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Mitochondriale Kontaktstellen sind Proteinkomplexe, die mit mitochondrialen inneren und äußeren Membranproteinen interagieren. Diese Stellen sind essentiell für die Kommunikation zwischen den mitochondrialen Membranen und damit zwischen dem Zytosol und der mitochondrialen Matrix. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Kandidaten, die sich für diese spezifische Klasse von Proteinen qualifizieren.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Unser Ziel ist es, die molekulare Funktion der mitochondrialen Kontaktstellen zu verstehen, die die Kommunikation zwischen den beiden Mitochondrienmembranen ermöglichen. Dies ist tatsächlich eine Voraussetzung, um die Funktion für die mitochondriale Biogenese und damit die Lebensfähigkeit von Zellen zu verstehen. Wir entdeckten eine neue Kontaktstelle zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien, die von Cqd1 und Om14-Por1 gebildet wurde.Unsere Daten deuten darauf hin, dass diese Stelle beim Import von Lipiden wie Phosphatidsäure helfen könnte. Basierend auf der Identifizierung des MICOS-Komplexes trugen wir zu einem tieferen Verständnis bei, wie die mitochondriale Membranarchitektur erzeugt wird. Dies ermöglichte es uns, ein Arbeitsmodell zu entwickeln, das erklärt, wie die beiden Formen der mitochondrialen Cristae, lamelläre und tubuläre Cristae, gebildet werden.Unsere Forschung wurde in der Vergangenheit an Hefe durchgeführt. Wir sind jedoch davon überzeugt, dass die Bildung einer korrekten mitochondrialen Architektur auch für höhere Eukaryoten wichtig ist. Der nächste Schritt in unserer Forschung ist daher die Analyse der Rolle von mitochondrialen Architekturelementen in komplexeren Modellen wie primären Neuronen.