Name: transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de volgende financiering: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), de Shulsky Foundation (MSS), het Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), de Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (onbeperkte subsidie aan het Wilmer Eye Institute aan de Johns Hopkins University en het Cullen Eye Institute aan het Baylor College of Medicine). We danken Dr. Malia Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) voor het geven van training over de microscoop.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-publicaties nr. 8023, herzien 1978) en de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en oogheelkundig onderzoek. Alle procedures zijn goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (goedkeuring M021M459).
1. Dieren
<ol><li>Gebruik Rho::EGFP-muizen (verouderd P3-P6) als donoren van retinale celsuspensies. OPMERKING: Deze soort was een vriendelijk geschenk van Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine.</li>
	<li>Gebruik OPN1LW-EGFP/NRL-/- muizen14 (leeftijd P3) als donoren van netvliesbeschermers.</li>
	<li>Gebruik volwassen retinale degeneratie Rd1/NS-muizen met immuundeficiëntie (beide geslachten) als ontvangers.</li>
	<li>Huisvest alle muizen in kooien onder een licht-donkercyclus van 12:12 uur met toegang tot water en voedsel als dat nodig is.</li>
</ol>2. Verzamel neuraal netvlies (Figuur 1)
OPMERKING: Alle volgende stappen zijn uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Leveranciersinformatie over de onderzoekstools en -producten vindt u in de materiaaltabel.
<ol><li>Voorbereiding van donormuizen: Euthanaseer donormuizen met een overdosis kooldioxide en bevestig euthanasie met cervicale dislocatie.</li>
	<li>Isoleer de oogbollen van muizen. Volg hiervoor de onderstaande stappen.<ol><li>Open voorzichtig de oogleden van de pups met een microschaar om de oogbol bloot te leggen.</li>
		<li>Gebruik een gladde pincet om de oogzenuw vast te pakken en trek de oogbol eruit met een pincet.</li>
	</ol></li>
	<li>Isoleer neuraal netvlies OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop.<ol><li>Snijd een gaatje in het midden van het hoornvlies met een steriele naald van 25 G.</li>
		<li>Snijd het hoornvlies, door het gat, doormidden en vergroot de incisie naar de sclera en RPE, verwijder vervolgens de sclera en RPE.</li>
		<li>Gebruik een microgetande pincet om de lens en het glasvocht voorzichtig te verwijderen om het neurale netvlies te isoleren.</li>
		<li>Ga verder met sectie 3 om de netvliessuspensie van de donor voor te bereiden of sectie 4 om het netvliesblad van de donor voor te bereiden, indien nodig.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bereid de netvliessuspensie van de donor voor (Figuur 1)
<ol><li>Incubeer het neurale netvlies in Papaïne-oplossing bij 37 °C gedurende 20-30 minuten totdat er geen celklonten worden gedetecteerd. OPMERKING: Pipetteer het celmengsel 15x per 10 min voorzichtig.</li>
	<li>Volg de instructies van de fabrikant van de Papaïne-dissociatiekit om afzonderlijke cellen te verzamelen.</li>
</ol>4. Bereid netvliesvellen van de donor voor (Figuur 1)
OPMERKING: Deze stap volgt sectie 2 en wordt uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop.
<ol><li>Plaats de geïsoleerde neurale netvliesbeker in een petrischaal van 35 mm met voorgekoelde steriele PBS.</li>
	<li>Gebruik een microschaar om de neurale netvliesbeker in meerdere netvliesvellen te knippen (ongeveer 1 mm x 2 mm).</li>
</ol>5. Bereid ontvangende muizen voor
<ol><li>Verdoof ontvangende muizen met intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazinehydrochloride (20 mg/kg lichaamsgewicht).</li>
	<li>Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie door te zorgen voor het verlies van knipper- en pijnreflexen, regelmatige ademhaling en ademhaling.</li>
	<li>Beoordeel de anesthesiediepte door het gebrek aan reactie op de staartknijp of het terugtrekken van de pedaalreflexen.</li>
	<li>Controleer tijdens de operatieve procedure altijd opnieuw de anesthesiediepte en pas de anesthesiediepte aan als het dier op pijn reageert. Houd de muizen op de voorverwarmde operatietafel om onderkoeling te voorkomen.</li>
	<li>Verwijd de pupillen van de ontvanger 5 minuten voor de operatie met 1% (gew./vol) tropicamide oogdruppels. Een goed verwijde pupil kan de visualisatie van de oogschaduw onder de operatiemicroscoop vergemakkelijken.</li>
	<li>Desinfecteer het operatieoog van de muis en de omliggende oogweefsels met povidonjodium, was met gesteriliseerde PBS.</li>
	<li>Breng 0,5% Proparacaïnehydrochloride aan op het oog van de muis voor analgesie.</li>
</ol>6. Subretinale transplantatie van retinale transplantaten (Figuur 2)
OPMERKING: Alle volgende stappen zijn uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Chirurgische instrumenten werden geautoclaveerd (gebruik instrumentenbakjes om de uiteinden van het gereedschap te beschermen en haal de zuiger uit de microspuiten om te voorkomen dat ze vast komen te zitten in het lumen). Leveranciersinformatie over de onderzoekstools en -producten vindt u in de materiaaltabel.
<ol><li>Paracentese van de voorste oogkamer: Penetreer het perifere hoornvlies in de voorste oogkamer met een insulinenaald om kamerwater passief te laten ontsnappen, om de intraoculaire druk (IOP) pieken tijdens transplantatie te voorkomen. OPMERKING: Een succesvolle paracentese wordt aangegeven door de uitvloeiing van kamerwater door het hoornvliesgat.</li>
	<li>Breng een druppel natriumhyaluronaat en een glazen dekglaasje (5 mm diameter) aan op het hoornvlies om transpupillaire visualisatie van de fundus onder de chirurgische scoop mogelijk te maken.</li>
	<li>Gebruik een getande pincet om de injectielocus (1 mm postcorneale limbus) bloot te leggen door de bovenste of inferieure oogwand, zoals vereist door het experiment, in de richting van het midden van het oogzicht te drukken.</li>
	<li>Gebruik een micro-injectienaald om loodrecht in de sclera te dringen.</li>
	<li>Draai de naaldrichting voorzichtig tangentieel om volledige penetratie van het sclera-choroïde-RPE-complex in de subretinale ruimte mogelijk te maken.</li>
	<li>Steek de naald tangentieel in om toegang te krijgen tot de terminale injectielocus. NOTITIE: Controleer de volledige positionering van de afschuining van de naald door middel van ooggeleiding. Gebruik de oppervlakkige netvliesvaten als anatomische referentie voor een nauwkeurige positionering van de naald in de subretinale ruimte.</li>
	<li>Injecteer retinale transplantaten OPMERKING: De aanwezigheid van kleine belletjes die vooraf in de spuit zijn geladen, kan de validatie van de nauwkeurige subretinale positionering van donorcellen vergemakkelijken. Verhoogde IOD als gevolg van de subretinale injectie verhoogt het risico op reflux van donorcellen.<ol><li>Als het hoornvlies troebel wordt24,25, een indicator van een hoge IOD, houd de naald dan minimaal 3 minuten in de subretinale ruimte totdat het hoornvlies is verdwenen, een indicator dat de IOP voldoende is verminderd. OPMERKING: In zeldzame gevallen kan het langer duren voordat de IOD is genormaliseerd, en het wordt aanbevolen om de naald op zijn plaats te houden totdat de helderheid van het hoornvlies is hersteld, zelfs als dit 8-10 minuten zou duren. Observeer onder een chirurgische microscoop om schade aan netvliesstructuren te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Pak de rand van het injectiegat vast met een microgetande pincet en trek de naald snel terug. OPMERKING: De criteria voor succesvolle subretinale toediening van een retinale celsuspensie en -vel zijn respectievelijk een constante bleb en een zichtbaar wit vel in de subretinale ruimte.</li>
	<li>Reinig het operatiegebied van het oog met kunsttranen en breng indien nodig zalf aan.</li>
	<li>Toediening na de operatie<ol><li>Plaats getransplanteerde muizen in een voorverwarmde (37 °C) schone herstelkooi en controleer zorgvuldig op ongemak.</li>
		<li>Breng 2-3 keer een druppel actueel 0,5% proparacaïnehydrochloride aan op het chirurgische oog als er nood optreedt.</li>
		<li>Breng muizen terug naar de huiskooi nadat de muizen volledig alert en mobiel zijn. Plaats een klein aantal voedselpellets en een gelbeker in de kooi als de muizen moeite hebben om de voedseltrechter te bereiken. NOTITIE: Houd het oogoppervlak vochtig totdat de anesthesie is uitgewerkt om cataractvorming te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Multimodale confocale scanning laser oftalmoscopie (cSLO) beeldvorming
<ol><li>Twee maanden na transplantatie verdooft u de ontvangende Rd1 /NS-muizen (n=5) door intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazinehydrochloride (20 mg/kg lichaamsgewicht) voor beeldvorming.</li>
	<li>Verwijd de pupillen met 1% (gew./vol) tropicamide oogdruppels.</li>
	<li>Voer standaard 55° multimodale beeldvorming uit met behulp van het confocale scanning laser oftalmoscoop cSLO-systeem22.</li>
	<li>Verkrijg MR- en SD-OCT-afbeeldingen met behulp van 30 frames ART-gemiddelde.</li>
</ol>8. Histologische kleuring
<ol><li>Bereid bevroren objectglaasjes voor van getransplanteerde Rd1/ NS-muizenogen, zoals eerder gemeld 14.</li>
	<li>Blokkeer en penetreer de bevroren glaasjes van het getransplanteerde netvlies met een mengsel van 5% geitenserum en 1% Triton X100 in PBS.</li>
	<li>Incubeer monsters met primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 °C en spoel ze af in PBS (5 min, 3x). De primaire antilichamen zijn onder meer anti-GFP-FITC bij geiten (1:200), anti-recoverine bij konijnen (1:1000) en anti-S-opsine bij konijnen (1:500).</li>
	<li>Incubeer de monsters met secundair antilichaam (geit anti-konijn Cy3, 1:500) en gekleurd met DAPI. OPMERKING: De leveranciers van primaire en secundaire antilichamen staan vermeld in de materiaaltabel.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced,+dry+age-related+macular+degeneration.">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Sci Transl Med. 10 (435), (2018).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration.">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+rescues+retinal+degeneration+in+rodents+and+pigs.">Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs.</a> Sci Transl Med. 11 (475), (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation.">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).</li><li>Shirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+two+primate+models+of+retinal+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).</li><li>Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+full-thickness+retina+in+the+rhodopsin+transgenic+pig.">Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig.</a> Retina. 24 (1), 98-109 (2004).</li><li>Klassen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+from+the+porcine+neural+retina+express+photoreceptor+markers+after+transplantation+to+the+subretinal+space+of+allorecipients.">Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients.</a> Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transplantation+of+human+fetal+neuroretinal+cells+in+advanced+retinitis+pigmentosa+patients:+results+of+a+long-term+safety+study.">The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study.</a> Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+retinal+transplantation.">Human neural retinal transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+of+human+retinal+progenitor+cell+transplantation+in+retinitis+pigmentosa+patients.">Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+allogeneic+transplantation+of+a+novel+transgenic+cone-rich+donor+mouse+line.">Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line.</a> Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).</li><li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors.">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).</li><li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+nanotubes+mediate+the+in+vivo+exchange+of+intracellular+material.">Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material.</a> EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).</li><li>Zou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-derived+C-Kit(+)/SSEA4(-)+human+retinal+progenitor+cells+promote+a+protective+retinal+microenvironment+during+transplantation+in+rodents.">Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents.</a> Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+photoreceptor+precursors+transfer+proteins+to+host+photoreceptors+by+a+mechanism+of+cytoplasmic+fusion.">Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion.</a> Nat Commun. 7, 13537 (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Nickerson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+delivery+and+electroporation+in+pigmented+and+nonpigmented+adult+mouse+eyes.">Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes.</a> Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+subretinal+injection+of+trypan+blue+in+rats.">Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifiable+in+vivo+imaging+biomarkers+of+retinal+regeneration+by+photoreceptor+cell+transplantation.">Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+analysis+of+xenotransplanted+human+retinal+organoids+defines+two+migratory+cell+populations+of+nonretinal+origin.">Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin.</a> Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+corneal+endothelial+dysfunction+to+facilitate+development+of+novel+therapies.">Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies.</a> Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ocular+hypertension+disrupts+barrier+integrity+and+pump+function+in+rat+corneal+endothelial+cells.">Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).</li><li>Chao, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+cells+into+the+subretinal+space+of+a+non-human+primate.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate.</a> Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).</li><li>Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+the+subretinal+space+of+the+cat+eye.">transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye.</a> Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+refined+protocol+for+trans-scleral+subretinal+transplantation+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+into+rat+eyes.">Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes.</a> J Vis Exp. (126), e55220 (2017).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), e4286 (2012).</li><li>Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+external+and+internal+approaches+for+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium.">Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+surgical+procedure+for+rhesus+epiretinal+scaffold+implantation+with+HiPSC-derived+retinal+progenitors.">Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors.</a> Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+scaffolds+facilitate+epiretinal+transplantation+of+hiPSC-Derived+retinal+neurons+in+nonhuman+primates.">Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates.</a> Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).</li></ol>

MSS is/was een bezoldigd adviseur van Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W.L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals en Acucela. MSS ontvangt gesponsorde onderzoekssteun van Bayer. Deze regelingen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Johns Hopkins University in overeenstemming met haar beleid inzake belangenconflicten. KVL wordt genoemd als uitvinders van octrooiaanvragen aan de Universiteit van Colorado. MSS en YVL worden genoemd als uitvinders op octrooiaanvragen aan de Johns Hopkins University.

Subretinale transplantatie bij muizen is technisch uitdagend vanwege de kleine omvang van muizenogen. In deze studie ontwikkelden we een eenvoudig en reproduceerbaar platform voor subretinale transplantatie bij muizenontvangers. Het platform zorgt voor consistentie in de bescherming van de levensvatbaarheid van donoren, succesvolle subretinale toediening en zorgt voor een laag complicatiepercentage.
De hier afgebeelde subretinale transplantatietechniek is ontwikkeld op basis van de trans-sclerale route, waarbij de injectienaald de buitenste lagen (sclera-choroïde-RPE-complex) van de oogwand binnendringt. Vergeleken met de transcorneale19,20 en trans-vitreous21,26,27 benadering, komt de trans-sclerale benadering rechtstreeks de subretinale ruimte binnen zonder de structuren van het voorste segment en het neurale netvlies binnen te dringen, waardoor een onschadelijke transplantatie mogelijk wordt en het risico op reflux van donorcellen door het penetrerende gat wordt verminderd. Een uitdaging van de trans-sclerale benadering is ervoor te zorgen dat de punt van de naald zich voortplant langs de subretinale ruimte voordat hij aankomt op de plaats van de terminale toediening, terwijl mogelijke verstoring van de aangrenzende RPE- en choroïde lagen wordt vermeden. Het is een uitdaging om deze doelen te bereiken door middel van een traditionele trans-sclerale benadering28,29 zonder directe visuele begeleiding. In deze studie ontwikkelden we een transpupillair zichtgeleid platform met behulp van een chirurgische microscoop en externe verlichting van het netvlies om subretinale transplantatie in muismodellen te vergemakkelijken. Het platform stelt de operator in staat om het chirurgische proces en de toestand van het netvlies van de ontvanger te volgen door real-time visualisatie van de ontvangende fundus onder de chirurgische microscoop te bieden. Succesvolle penetratie van het sclera-choroïde-RPE-complex kan bijvoorbeeld eenvoudig worden gevalideerd door een relatief heldere reflectie van de naaldpunt via transpupillaire visualisatie. Belangrijk is dat de operator, geleid door transpupilvisualisatie, de hoek en de diepte van de injectie nauwkeurig kan moduleren op basis van de relatieve positie tussen de naald en anatomische structuren in het netvlies van de ontvanger (bijv. netvliesvaten en oogzenuwkop). Bovendien kan nauwkeurige toediening van materialen met behulp van deze techniek RPE, choroïde trauma en andere chirurgische complicaties minimaliseren. We ontdekten inderdaad dat bloedingen kunnen worden geminimaliseerd door manoeuvres in de nabijheid van retinale bloedvaten te vermijden met behulp van transpupillaire visualisatie.
Reflux van donorcellen is een belangrijke oorzaak van chirurgisch falen na injectie29,30. Er zijn meerdere factoren die een rol spelen bij het bevorderen van reflux van donorcellen. De hoge intraoculaire druk (IOD) van de ontvangende ogen veroorzaakt door de geïnjecteerde donorcelmengsels is een belangrijke factor die de terugvloeiing van cellen uit het oog bevordert. Ons protocol vermindert de IOP van de ontvanger door penetratie van de voorste oogkamer aan het begin van de operatie en stelt de IOP in staat om spontaan te dalen door waterige vloeistof uit te laten komen voordat de glasvochtnaald uit de glasvochtholte wordt getrokken. Een tweede factor is de niet-verzegelde injectietunnel in de ogen van de ontvangers. Om terugvloeiing van het transplantaat door de injectietunnel te voorkomen, gebruiken we een kleine micro-injectienaald (34G) om een zelfsluitende tunnel te creëren bij het binnendringen van de oogwand en een getande micropincet om de randen van de externe tunnelopening vast te houden bij het uittrekken van de naald. Bij conventionele transplantatie worden refluxgrafts nauwelijks gedetecteerd omdat ze snel kunnen optreden of snel kunnen verdwijnen. Het natriumhyaluronaat glijdt bij het aanbrengen van het dekglaasje bijna altijd van het hoornvlies af om het grootste deel van de limbus en sclera te bedekken, inclusief de plaats van de sclerotomie. Na celinjectie kan het natriumhyaluronaat op de plaats van de sclerotomie helpen om de bulkstroom van eventuele refluxinhoud te vertragen en deze visueel detecteerbaar te maken onder de chirurgische microscoop. Bovendien kan de afwezigheid van reflux ook worden geverifieerd door de constantheid van de subretinale bleb voor celsuspensies en de intraoculaire locatie van het netvliesblad te traceren met behulp van ons protocol, wat nuttig zou kunnen zijn voor laboratoria waar optische coherentietomografie (OCT) niet beschikbaar is.
Hoewel een aanzienlijk aantal fotoreceptorcellen overleefde in de getransplanteerde netvliesvellen, kon er geen waarneembare cellulaire oriëntatie of bladoriëntatie worden gedetecteerd. Hoewel de toediening van 3D-netvliesvellen aan grote dieren is vastgesteld 26,31,32, maakt de subretinale ruimte bij muizen, in combinatie met het ontbreken van intraoperatieve retinale beeldvormingsmogelijkheden, het zeer uitdagend om het behoud van de bladoriëntatie intraoperatief te garanderen, evenals in de onmiddellijke postoperatieve periode waarin de getransplanteerde cellen of vellen onstabiel kunnen worden naarmate de muis weer kan lopen.
We beschrijven een trans-scleraal chirurgisch platform met directe transpupillaire zichtgeleiding voor de subretinale transplantatie bij muizenontvangers. Dit platform maakt een hoge nauwkeurigheid van de injectie en een laag aantal chirurgische complicaties mogelijk. Dit platform maakt nauwkeurige toediening van bekende doses cellen mogelijk, is relatief eenvoudig te leren en vergemakkelijkt subretinale toediening naast intra-retinale of intravitreale injecties voor verschillende soorten therapeutische middelen, waaronder gentherapie.

Transplantatie van fotoreceptor- en retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) biedt potentiële therapie voor retinale degeneratieve ziekten zoals leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD), de ziekte van Stargardt en retinitis pigmentosa (RP)1,2,3,4,5,6,7 . Om de zieke fotoreceptoren en RPE-cellen in gedegenereerde netvliezen aan te vullen of te vervangen, is de subretinale ruimte bijzonder geschikt als transplantatiedoelwit, gezien de laminaire anatomie van gastheerfotoreceptoren en RPE-cellen. Hoewel chirurgische procedures voor subretinale transplantatie van RPE-cellen goed ingeburgerd zijn bij grote dieren 8,9,10 en klinische onderzoeken11,12,13, omvatten de uitdagingen waarmee onderzoek naar fotoreceptortransplantatie wordt geconfronteerd, onder meer de schaarste aan transgene grote diermodellen en het beperkte begrip van diepgaande synaptogenese mechanismen die betrokken zijn bij neuronale transplantatie, naast andere zorgen. Genetisch gemodificeerde muizenmodellen, met verschillende soorten retinale degeneratiemutanten, bieden nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van moleculaire mechanismen in de context van transplantatie en het sturen van de ontwikkeling van effectieve celvervangende therapieën in het preklinische stadium 14,15,16,17,18.
In tegenstelling tot het relatief grote oog en de kleine kristallijne lens bij grote dieren (bijv. varken, aap), maken het kleine formaat en de grote kristallijne lens van muizenogen ze tot moeilijke chirurgische doelen, vooral voor subretinale transplantatie waarbij fysieke ruimtebeperkingen en beperkte directe visualisatie de belangrijkste uitdagingen zijn.
De huidige benaderingen kunnen worden ingedeeld in drie hoofdtypen op basis van de injectieroute. Ten eerste, in het geval van de transcorneale benadering, wordt de naald door het hoornvlies in de glasvochtholte gebracht en vervolgens in de subretinale ruimte19,20. Met deze methode kan een succesvolle subretinale toediening worden bereikt, maar de schade aan de structuren van het voorste segment (d.w.z. hoornvlies, iris, lens) is een groot risico dat de stroomafwaartse in-vivo-analyse ernstig kan belemmeren. Ten tweede, in het geval van de trans-vitreeuze benadering, komt de naald de glasvochtholte binnen via de pars plana en vervolgens in de subretinale ruimte21. Deze aanpak wordt veel gebruikt bij mensen en grote dieren. Er is echter een potentieel risico op lensbeschadiging bij knaagdieren, aangezien de lens een groter relatief volume van de glasvochtholte inneemt. Met name vereisen zowel transcorneale als transvitreeuze protocollen penetratie van het neurale netvlies om in de subretinale ruimte aan te komen, wat schade aan het netvlies van de gastheer veroorzaakt en het risico op reflux van donorcellen door het penetratiegat verhoogt. Ten derde, in het geval van de trans-sclerale benadering22,23, dringt de naald door het sclerale-choroïde-RPE-complex en komt rechtstreeks de subretinale ruimte binnen. Deze aanpak vermindert het potentiële trauma van de structuren van het voorste segment en de glasvochtholte. Zonder directe visualisatie van de hostfundus worden echter vaak chirurgische mislukkingen gedetecteerd die worden veroorzaakt door transretinale puncties, RPE-loslating en choroïde bloedingen.
Hier ontwikkelden we een trans-scleraal chirurgisch platform met directe transpupillaire zichtgeleiding voor subretinale transplantatie bij muizenontvangers. Validatie van de levensvatbaarheid van netvliesvellen en celsuspensies van donoren voordat transplantatie werd uitgevoerd. Succesvolle afgifte van de donorcellen in de subretinale ruimte van een retina degeneratie muismodel werd bevestigd. Er werden slechts zeldzame chirurgische complicaties vastgesteld. Bovendien overleefden getransplanteerde fotoreceptoren in de retinale transplantaten en vertoonden ze tekenen van geavanceerde rijping tot "volwassen" staafjes en kegeltjes twee maanden na transplantatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears</td>
			<td>CareAll</td>
			<td>P31447-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (5mm in diameter)</td>
			<td>Deckglaser</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-GFP (FITC)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab6662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit Cy3&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>Easy Touch</td>
			<td>08496-3015-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone Zetamine</td>
			<td>AH2017J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead Viability Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissor</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro smooth forceps</td>
			<td>ASICO</td>
			<td>AE-4360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro toothed forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555041FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (26G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7804-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (34G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>207434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish (35 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine (10%)</td>
			<td>Betadine Solution</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride (0.5%)</td>
			<td>Keeler</td>
			<td>AX0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-recoverin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-S-opsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyaluronate</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Vision&#160;</td>
			<td>10-2400-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 2PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile needle (25G)</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical materials/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>112-7192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model

Transplantatie van fotoreceptorcellen en retinale pigmentepitheelcellen (RPE) bieden een potentiële therapie voor retinale degeneratieziekten. Subretinale transplantatie van therapeutische donorcellen in muizenontvangers is een uitdaging vanwege de beperkte chirurgische ruimte die wordt toegestaan door het kleine volume van het muizenoog. We ontwikkelden een trans-scleraal chirurgisch transplantatieplatform met directe transpupillaire zichtgeleiding om de subretinale toediening van exogene cellen bij muizenontvangers te vergemakkelijken. Het platform werd getest met behulp van retinale celsuspensies en driedimensionale retinale vellen verzameld van staafrijke Rho:: EGFP-muizen en kegelrijke OPN1LW-EGFP; NRL-/- muizen, respectievelijk. De test op levend/dood toonde een lage celsterfte voor beide vormen van donorcellen. Retinale transplantaten werden met succes afgeleverd in de subretinale ruimte van een muismodel van retinale degeneratie, Rd1/NS, met minimale chirurgische complicaties zoals gedetecteerd door multimodale confocale scanning laser oftalmoscoop (cSLO) beeldvorming. Twee maanden na de transplantatie toonde histologische kleuring bewijs van gevorderde rijping van de retinale transplantaten in 'volwassen' staafjes en kegeltjes (door robuuste Rho::EGFP-, S-opsine- en OPN1LW:EGFP-expressie, respectievelijk) in de subretinale ruimte. Hier bieden we een chirurgisch platform dat een zeer nauwkeurige subretinale toediening mogelijk maakt met een laag aantal complicaties bij muizenontvangers. Deze techniek biedt precisie en relatief gemak bij het verwerven van vaardigheden. Bovendien zou de techniek niet alleen kunnen worden gebruikt voor studies van subretinale celtransplantatie, maar ook voor andere intraoculaire therapeutische studies, waaronder gentherapieën.

Retinale transplantaten worden met succes in de subretinale ruimte afgeleverd en overleven in vivo. De prestaties van ons subretinale transplantatieplatform werden beoordeeld bij muizen die Rd1/NS ontvingen in de leeftijd van 6-8 weken toen hun resterende netvlies ernstig was uitgedund als gevolg van de bijna volledige degeneratie van de buitenste nucleaire laag (ONL). Gezien de kwetsbaarheid van het netvlies, de schaarste aan kegelfotoreceptoren en de relatief slechte levensvatbaarheid van cellen in suspensie in vergelijking met bladdonoren, kegelrijke muizen (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 werden gebruikt als bron van netvliesbladen van donoren en staafrijke muizen (Rho::EGFP) als donor voor celsuspensies. Kegelrijke retinale vellen en staafrijke celsuspensies werden met succes afgeleverd in de subretinale ruimte van alle ontvangende muizen met behulp van ons chirurgisch platform, zoals bevestigd door de subretinale bleb en het witte vel die onmiddellijk na injectie werden gezien met behulp van transpupillaire visualisatie. Twee maanden na de transplantatie werd multimodale cSLO-beeldvorming uitgevoerd om de toestand van retinale transplantaten in vivo te volgen. Cross-sectionele OCT-scanning toonde aan dat retinale transplantaten overleefden in de subretinale ruimte en de ONL reconstitueerden in alle ontvangende muizen (Figuur 3A). Infraroodbeeldvorming detecteerde geen duidelijke cataract in alle getransplanteerde ogen (Figuur 3B). Andere chirurgische complicaties, waaronder bloeding, werden zelden gedetecteerd in getransplanteerd netvlies (n = 1/10 ogen) door middel van meerkleurige reflectiebeeldvorming twee maanden na transplantatie (Figuur 3C). We voerden histologische kleuring uit om de overleving en mate van rijping van fotoreceptoren in retinale transplantaten verder te beoordelen. Overvloedige kegelfotoreceptoren die OPN1LW:EGFP en S-opsine tot expressie brengen in getransplanteerde netvliesvellen werden waargenomen. Evenzo vertoonden getransplanteerde suspensies van retinale cellen een groot deel van de Rec+-fotoreceptoren in vivo, waaronder talrijke Rho::EGFP+-staafjes (Figuur 3D). De niet-getransplanteerde controlemuizen vertoonden ernstige ONL-degeneratie met schaarse resterende kegelfotoreceptoren (Rec+). Er werd geen EGFP-signaal gedetecteerd in niet-getransplanteerd Rd1/NS-netvlies (Figuur 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van het verzamelen van netvliesfolie en celsuspensies van donoren. Schema's met de belangrijkste stappen van het verzamelen van retinale celsuspensies en -vellen van donormuizen Rho::EGFP. Helderveld- en fluorescerende beeldvorming toonde representatieve beelden van gedissocieerde cellen en een ontlede plaat geïsoleerd uit Rho::EGFP-muizen . Gele stippellijn: incisiemarge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg"> Figuur 2: Procedures voor subretinale transplantatie van netvliesvellen en celsuspensie bij Rd1/NS-muizen . (A) Schematische afbeeldingen van de bereiding van de ontvangende muizen. (B) Belangrijkste chirurgische ingrepen en bijbehorende diagrammen die subretinale transplantatie van retinale celsuspensies en -vellen laten zien. Chirurgische stappen omvatten: 1. penetreer de voorste oogkamer; 2. Laat het natriumhyaluronaat op het hoornvlies vallen en monteer vervolgens het dekglaasje bovenop het natriumhyaluronaat om de oogschaduw te vergemakkelijken; 3. doordringen in de buitenste lagen van de oogwand (sclera-choroïde-RPE-complex). De penetratiehoeken van de naald bevinden zich in de rechterbovenhoek van de afbeelding; 4. Injectienaald invoegen; 5. Injecteer grafts. Representatieve beelden tonen de succesvolle toediening van retinale celsuspensies en -vellen in respectievelijk twee individuele ontvangers. Sterretje: oogzenuwkop; Rode pijlpunten: retinaal bloedvat; Witte pijlpunt: gepenetreerde naaldpunt; Witte pijlen: geënte retinale suspensies of vel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg"> Figuur 3: Succesvolle toediening van retinale transplantaten in de subretinale ruimte en overleving in vivo. (A) Representatieve SD-OCT-beelden toonden de subretinale verdeling van getransplanteerde retinale vellen en celsuspensies in respectievelijk twee individuele Rd1/NS-muizen . Niet-getransplanteerde Rd1/NS-muizen werden verzameld als controle. Region of Interest (ROI) wordt aangegeven met geel gestippelde vakjes op infrarood (IR) fundusbeelden. Het binnenste netvlies wordt aangeduid als laminae van de retinale ganglioncellaag (RGC), de binnenste plexiforme laag (IPL) en de binnenste nucleaire laag (INL). (B) Representatief infrarood (IR) beeld van een getransplanteerde Rd1/NS-muis toonde geen cataract door de verwijde pupil. (C) Representatieve meerkleurige reflectiebeelden (MR) van getransplanteerde en niet-getransplanteerde Rd1/NS-ogen . De getransplanteerde ogen vertoonden geen duidelijke chirurgische complicaties, waaronder bloedingen. (D) Immunohistochemie (IHC) kleuring van getransplanteerde (vel en suspensie) en niet-getransplanteerde (controle) Rd1/NS muizen. De gegevens toonden twee maanden na transplantatie talrijke getransplanteerde fotoreceptoren die specifieke markers van fotoreceptoren (Rec), staafjes (Rho::EGFP), L/M-kegeltjes (OPN1LW:EGFP) en S-kegeltjes (S-opsin) tot expressie brachten. Retinale laminae van de ontvanger werden geïdentificeerd aan de hand van DAPI-kleuring (blauw). Netvliestransplantaten werden geïdentificeerd door EGFP-verslaggever (groen). Het niet-getransplanteerde netvlies van muizen vertoonde ernstige ONL-degeneratie met schaarse resterende kegelfotoreceptoren (Rec+). Er werd geen EGFP-signaal gedetecteerd in niet-getransplanteerd Rd1/NS-netvlies . Op de rechtertwee panelen werden uitvergrote afbeeldingen gepresenteerd. Afkortingen: RGC: retinale ganglioncellaag; INL: binnenste kernlaag. ONL: buitenste nucleaire laag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Het algemene doel van deze studie is het ontwikkelen van een trans-scleraal transplantatieplatform met directe transpupillaire geleiding om de subretinale afgifte van cellen bij muizenontvangers te vergemakkelijken. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de National Institute of Health Guide. Onze verklaring over het gebruik van dieren en goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee.Adopterende EGFP-muizen in de leeftijd van postnatale dag 3-6 werden gebruikt als donoren van retinale celsuspensies. OPN1LW-EGFP/NRL-muizen, leeftijd op postnatale dag 3 werden geadopteerd als netvliesbladdonoren. Volwassen retinale degeneratie Rd1/NS-muizen met immuundeficiëntie werden gebruikt als ontvangers.Euthanaseer donormuizen met een overdosis kooldioxide. Om de oogbollen van muizen te isoleren, opent u voorzichtig de oogleden van de pups met een microschaar en legt u de oogbol bloot. Wikkel de oogzenuw in en trek de oogbol met een gladde tang eruit.Zodra de oogbollen zijn geïsoleerd, snijdt u een gat in het midden van het hoornvlies met een naald van 25 gauge. Snijd het hoornvlies doormidden door het gaatje. En vergroot de incisie naar de sclera en RPE.Verwijder vervolgens de sclera en RPE. Gebruik vervolgens een microgetande pincet om de lens voorzichtig te verwijderen en glasvocht om het neurale netvlies te isoleren. Om de suspensie van het donornetvlies te verzamelen, incubeert u het neurale netvlies gedurende 20 tot 30 minuten in papaïne-oplossing bij 37 graden Celsius totdat er geen celklonters meer detecteerbaar zijn.Verzamel de afzonderlijke cellen volgens de instructies van de fabrikant van de Papaïne-kit. Om het netvliesblad voor te bereiden, plaatst u het geïsoleerde netvlies in een petrischaal met PBS. Snijd vervolgens het neurale netvlies voorzichtig in meerdere netvliesvellen met een microschaar.Verdoof ontvangende muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine. Zorg ervoor dat het bereikte anesthesievlak het chirurgische vlak is waar het dier knipper- en pijnreflexen verliest, maar ademhaling en ademhaling regelmatig blijven. Beoordeel de anesthesiediepte door de staart te knijpen of de reflexen voor het terugtrekken van het pedaal.Controleer de anesthesiediepte opnieuw tijdens de operatieve procedure. Houd de muizen op de voorverwarmde operatietafel om onderkoeling te voorkomen. Verwijd de pupillen van de ontvanger vijf minuten voor de operatie met tropicamide oogdruppels.Een goed verwijde pupil kan de visualisatie van de oogschaduw onder de operatiemicroscoop vergemakkelijken. Doe een druppel Proparacaïnehydrochloride op het oog van de muizen voor analgesie. Desinfecteer het oog van de werkende muis en de omliggende oogweefsels met jodium.Reinig vervolgens het oog met steriele PBS. Penetreer de perifere tunnel in de interne kamer om de intraoculaire druk te verminderen. Doe vervolgens een druppel natriumhyaluronaat en een glazen dekglaasje op het hoornvlies.Oogvisualisatie van de muisfundus is nu beschikbaar onder de chirurgische scoop. Leg de injectielocus bloot door de oogwand met een getande tang naar het midden van het oogbeeld te duwen. Penetreer vervolgens gedeeltelijk de sclera met een micro-injectienaald, 90 graden ten opzichte van de oogwand.De oppervlakkige retinale vaten kunnen dienen als anatomische referentie om de naald in de subretinale ruimte te lokaliseren. Injecteer vervolgens de retinale transplantaten. De voorgeladen kleine belletjes in de spuit kunnen de validatie van de subretinale locatie van donorcellen vergemakkelijken.Als het hoornvlies troebel wordt, houdt u de naald in de subretinale ruimte, totdat het hoornvlies transparant wordt om de intraoculaire druk te normaliseren. Pak de rand van het injectiegat vast en trek de naald er snel uit. Het criterium voor een succesvolle afgifte van celsuspensie is een constante bleb in de subretinale ruimte.Een succesvolle levering van netvliesfolie wordt overtuigd door een zichtbaar wit vel. Houd getransplanteerde muizen in een voorverwarmde, schone herstelkooi en controleer ze zorgvuldig op eventuele noodsignalen. Als dit gebeurt, breng dan twee, drie keer een druppel actueel proparacaïnehydrochloride aan op het operatieoog.Breng muizen terug naar de huiskooi nadat de muizen volledig alert en mobiel zijn. Plaats een klein aantal voedselkorrels in de gelbeker op de bodem van de kooi. Als de muizen moeite hebben om de voedseltrechter te bereiken.Twee maanden na de transplantatie werd multimodale confocale scanning laser oftalmoscopie uitgevoerd om de toestand van retinale transplantaten die vivo werden gezien, te controleren. Spectrale domein optische coherentietomografie toonde aan dat retinale transplantaten overleefden in de subretinale ruimte en de buitenste nucleaire laag van alle ontvangende muizen reconstrueerden. Infraroodbeeldvorming detecteerde geen duidelijke cataract bij alle getransplanteerde muizen.Andere chirurgische complicaties, waaronder bloedingen, werden slecht gedetecteerd bij getransplanteerde muizen door middel van meerkleurige reflectiebeeldvorming. Histologische kleuring toonde overvloedige kegelfotoreceptoren die OPN1LW:EGFP en S-opsine tot expressie brengen in getransplanteerde netvliesvellen. Evenzo toonde het transplanteren van retinale celsuspensies een groot deel van het herstellen van positieve fotoreceptoren in vivo, waaronder talrijke volwassen EGFP-positieve staafjes.De niet-getransplanteerde muizen vertoonden ernstige degeneratie van de buitenste nucleaire laag met schaarse resterende kegelfotoreceptoren die herstel uitdrukten. Er werd echter geen EGP-signaal gedetecteerd bij niet-getransplanteerde muizen. Deze studie biedt een trans-scleraal chirurgisch platform met directe transpupillaire zichtbegeleiding voor subretinale transplantatie bij muizenontvangers.Dit platform maakt nauwkeurige toediening van bekende doses cellen mogelijk. Het is relatief eenvoudig om subretinale toediening te leren en te vergemakkelijken naast intra-retinale of intravitreale injecties voor verschillende soorten therapeutische middelen, waaronder gentherapie.

Without Section

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsine Digest Protocol bij het netvlies Vasculature van een muismodel Analyseer

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

MÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Gedeeltelijke oogzenuw transect bij ratten: een Model tot stand gebracht met een nieuwe operationele aanpak om te beoordelen van secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...