Name: transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av følgende finansiering: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), Shulsky Foundation (MSS), Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (ubegrenset tilskudd til Wilmer Eye Institute ved Johns Hopkins University og Cullen Eye Institute ved Baylor College of Medicine). Vi takker Dr. Malia Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) for vennlig opplæring på mikroskopet.

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NIH publikasjoner nr. 8023, revidert 1978) og ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. Alle prosedyrer ble godkjent av Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (godkjenning M021M459).
1. Dyr
<ol><li>Bruk Rho::EGFP mus (alderen P3-P6) som donorer av retinal celle suspensjoner. MERK: Denne stammen var en snill gave fra Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine.</li>
	<li>Bruk OPN1LW-EGFP/NRL-/- mus14 (i alderen P3) som donorer av netthinneplater.</li>
	<li>Bruk voksne retinal degenerasjon Rd1 / NS-mus med immunsvikt (begge kjønn) som mottakere.</li>
	<li>Hus alle mus i bur under en 12:12 h lys-mørk syklus med tilgang til vann og mat etter behov.</li>
</ol>2. Samle nevrale netthinnen (figur 1)
MERK: Alle følgende trinn ble utført under sterile forhold. Leverandørinformasjon om forskningsverktøy og produkter er gitt i materialfortegnelsen.
<ol><li>Donormuspreparat: Avlive donormus med en overdose karbondioksid og bekreft eutanasi med livmorhalsforstyrrelse.</li>
	<li>Isoler mus øyeboller. For å gjøre det, følg trinnene nedenfor.<ol><li>Åpne forsiktig valpens øyelokk med mikrosaks for å eksponere øyeeplet.</li>
		<li>Bruk glatt tang for å ta tak i optisk nerve og trekk ut øyebollet med et par tang.</li>
	</ol></li>
	<li>Isoler nevrale netthinnen MERK: Dette trinnet utføres under et disseksjonsmikroskop.<ol><li>Snitt et hull i midten av hornhinnen ved hjelp av en 25 G steril nål.</li>
		<li>Klipp hornhinnen, gjennom hullet, i halv og forstørre snittet til sclera og RPE, fjern deretter sclera og RPE.</li>
		<li>Bruk mikrotannede tang for å forsiktig fjerne linsen og glasslegemet for å isolere den nevrale netthinnen.</li>
		<li>Fortsett med avsnitt 3 for å forberede donor retinal suspensjon eller seksjon 4 for å forberede donor retinal ark, etter behov.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Forbered netthinnemikstur fra donor (figur 1)
<ol><li>Inkuber den nevrale netthinnen i Papain-oppløsning ved 37 °C i 20-30 minutter til det ikke oppdages celleklumper. MERK: Pipetter celleblandingen forsiktig 15x hvert 10. minutt.</li>
	<li>Følg produsentens instruksjoner fra Papain Dissociation Kit for å samle enkeltceller.</li>
</ol>4. Klargjør netthinneark fra donor (figur 1)
MERK: Dette trinnet følger avsnitt 2 og utføres under et disseksjonsmikroskop.
<ol><li>Sett den isolerte nevrale retinakoppen i en 35 mm petriskål med forkjølt steril PBS.</li>
	<li>Bruk mikrosaks til å klippe den nevrale netthinnekoppen i flere netthinneplater (rundt 1 mm x 2 mm).</li>
</ol>5. Forbered mottakermus
<ol><li>Bedøve mottakermus med intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg/kg kroppsvekt) og xylazinhydroklorid (20 mg/kg kroppsvekt).</li>
	<li>Bekreft det kirurgiske planet av anestesi ved å sikre tap av blink og smertereflekser, regelmessig pust og respirasjon.</li>
	<li>Vurder bedøvelsesdybden ved manglende respons på tilbaketrekking av haleklype eller pedalreflekser.</li>
	<li>Kontroller alltid bedøvelsesdybden under operasjonsprosedyren og juster bedøvelsesdybden hvis dyret reagerer på smerte. Hold musene på det forvarmede operasjonsbordet for å forhindre hypotermi.</li>
	<li>Utvide mottakerpupiller med 1 % (vekt/vol) tropikamid øyedråper 5 minutter før operasjonen. En godt utvidet pupill kan lette transpupillvisualisering under operasjonsmikroskopet.</li>
	<li>Desinfiser operasjonsmusøyet og omkringliggende okulært vev med povidon-jod, vask med sterilisert PBS.</li>
	<li>Påfør 0,5% proparakainhydroklorid på museøyet for analgesi.</li>
</ol>6. Subretinal transplantasjon av retinale transplantater (figur 2)
MERK: Alle følgende trinn ble utført under aseptiske forhold. Kirurgiske verktøy ble autoklavert (bruk instrumentbrett for å beskytte verktøytuppene og ta stempelet ut av mikrosprøytene for å forhindre at de setter seg fast i lumen). Leverandørinformasjon om forskningsverktøy og produkter er gitt i materialfortegnelsen.
<ol><li>Parasentese i fremre kammer: Penetrer perifer hornhinne inn i fremre kammer med en insulinnål for å tillate vandig humor å passivt komme ut, for å forhindre intraokulært trykk (IOP) pigger under transplantasjon. MERK: En vellykket parasentese indikeres av utstrømningen av vandig humor gjennom hornhinnen.</li>
	<li>Sett en dråpe natriumhyaluronat og et glassdeksel (5 mm diameter) på toppen av hornhinnen for å muliggjøre transpupillvisualisering av fundus under kirurgisk omfang.</li>
	<li>Bruk tanntang for å eksponere injeksjonsstedet (1 mm post-hornhinne limbus) ved å trykke enten øvre eller nedre øyevegg, som kreves av forsøket, mot sentrum av transpupillsyn.</li>
	<li>Bruk en mikroinjeksjonsnål for å trenge vinkelrett inn i sclera.</li>
	<li>Roter forsiktig nåleretningen tangentielt for å tillate fullstendig penetrering av sclera-choroid-RPE-komplekset inn i subretinalrommet.</li>
	<li>Stikk kanylen tangentielt inn for å få tilgang til terminalinjeksjonsstedet. MERK: Kontroller fullstendig plassering av nålens skråkant ved hjelp av transpupillær synsveiledning. Bruk de overfladiske retinalkarene som en anatomisk referanse for nøyaktig nåleposisjonering i det subretinale rommet.</li>
	<li>Injiser retinal transplantater MERK: Tilstedeværelsen av små bobler forhåndslastet i sprøyten kan lette valideringen av nøyaktig subretinal posisjonering av donorceller. Forhøyet IOP som følge av subretinal injeksjon øker risikoen for refluks fra donorceller.<ol><li>Hvis hornhinnen blir overskyet24,25, en indikator på høy IOP, hold nålen i subretinalrommet i minst 3 minutter til hornhinnen rydder, en indikator på at IOP har redusert tilstrekkelig. MERK: I sjeldne tilfeller kan IOP ta lengre tid å normalisere, og det anbefales å holde nålen på plass til klarheten i hornhinnen er gjenopprettet, selv om dette vil ta 8-10 minutter. Observer under et kirurgisk mikroskop for å forhindre skade på retinale strukturer.</li>
	</ol></li>
	<li>Ta tak i kanten av injeksjonshullet med mikrotannede tanger og trekk raskt ut nålen. MERK: Kriteriene for vellykket subretinal levering av en retinal cellesuspensjon og ark er henholdsvis en konstant bleb og et synlig hvitt ark i subretinalrommet.</li>
	<li>Rengjør det kirurgiske området i øyet med kunstige tårer og bruk salve om nødvendig.</li>
	<li>Administrasjon etter operasjonen<ol><li>Plasser transplanterte mus i et forvarmet (37 °C) rent restitusjonsbur og følg nøye for nød.</li>
		<li>Påfør en dråpe aktuell 0,5% proparakainhydroklorid på det kirurgiske øyet 2-3 ganger hvis nød oppstår.</li>
		<li>Returner mus til husburet etter at musene er helt våken og mobil. Legg et lite antall matpellets og en gelkopp i buret hvis musene har problemer med å nå matbeholderen. MERK: Hold øyeoverflaten fuktig til anestesi slites av for å forhindre kataraktdannelse.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Multimodal konfokal skanning laser oftalmoskopi (cSLO) bildebehandling
<ol><li>To måneder etter transplantasjonen, anestesi mottaker Rd1/NS mus (n = 5) ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg kroppsvekt) og xylazinhydroklorid (20 mg / kg kroppsvekt) for avbildning.</li>
	<li>Utvid elevene med 1% (vekt/vol) tropikamid øyedråper.</li>
	<li>Utfør standard 55° multimodal avbildning ved bruk av konfokal skanning laser oftalmoskop cSLO system22.</li>
	<li>Få MR- og SD-OCT-bilder ved hjelp av 30 gjennomsnittsbilder med ART.</li>
</ol>8. Histologisk farging
<ol><li>Forbered frosne lysbilder av transplanterte Rd1/NS-musøyne som tidligere rapportert 14.</li>
	<li>Blokker og penetrer de frosne lysbildene av transplantert retinae ved hjelp av en blanding av 5% geitserum og 1% Triton X100 i PBS.</li>
	<li>Inkuber prøver med primære antistoffer over natten ved 4 °C og skyll i PBS (5 min, 3x). De primære antistoffene inkluderer geit anti-GFP-FITC (1:200), kanin anti-recoverin (1:1000), og kanin anti-S-opsin (1:500).</li>
	<li>Inkuber prøvene med sekundært antistoff (geitekanin Cy3, 1:500) og motfarget med DAPI. MERK: Leverandørene av primære og sekundære antistoffer er oppført i materialfortegnelsen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced,+dry+age-related+macular+degeneration.">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Sci Transl Med. 10 (435), (2018).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration.">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+rescues+retinal+degeneration+in+rodents+and+pigs.">Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs.</a> Sci Transl Med. 11 (475), (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation.">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).</li><li>Shirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+two+primate+models+of+retinal+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).</li><li>Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+full-thickness+retina+in+the+rhodopsin+transgenic+pig.">Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig.</a> Retina. 24 (1), 98-109 (2004).</li><li>Klassen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+from+the+porcine+neural+retina+express+photoreceptor+markers+after+transplantation+to+the+subretinal+space+of+allorecipients.">Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients.</a> Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transplantation+of+human+fetal+neuroretinal+cells+in+advanced+retinitis+pigmentosa+patients:+results+of+a+long-term+safety+study.">The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study.</a> Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+retinal+transplantation.">Human neural retinal transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+of+human+retinal+progenitor+cell+transplantation+in+retinitis+pigmentosa+patients.">Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+allogeneic+transplantation+of+a+novel+transgenic+cone-rich+donor+mouse+line.">Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line.</a> Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).</li><li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors.">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).</li><li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+nanotubes+mediate+the+in+vivo+exchange+of+intracellular+material.">Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material.</a> EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).</li><li>Zou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-derived+C-Kit(+)/SSEA4(-)+human+retinal+progenitor+cells+promote+a+protective+retinal+microenvironment+during+transplantation+in+rodents.">Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents.</a> Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+photoreceptor+precursors+transfer+proteins+to+host+photoreceptors+by+a+mechanism+of+cytoplasmic+fusion.">Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion.</a> Nat Commun. 7, 13537 (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Nickerson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+delivery+and+electroporation+in+pigmented+and+nonpigmented+adult+mouse+eyes.">Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes.</a> Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+subretinal+injection+of+trypan+blue+in+rats.">Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifiable+in+vivo+imaging+biomarkers+of+retinal+regeneration+by+photoreceptor+cell+transplantation.">Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+analysis+of+xenotransplanted+human+retinal+organoids+defines+two+migratory+cell+populations+of+nonretinal+origin.">Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin.</a> Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+corneal+endothelial+dysfunction+to+facilitate+development+of+novel+therapies.">Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies.</a> Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ocular+hypertension+disrupts+barrier+integrity+and+pump+function+in+rat+corneal+endothelial+cells.">Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).</li><li>Chao, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+cells+into+the+subretinal+space+of+a+non-human+primate.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate.</a> Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).</li><li>Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+the+subretinal+space+of+the+cat+eye.">transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye.</a> Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+refined+protocol+for+trans-scleral+subretinal+transplantation+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+into+rat+eyes.">Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes.</a> J Vis Exp. (126), e55220 (2017).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), e4286 (2012).</li><li>Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+external+and+internal+approaches+for+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium.">Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+surgical+procedure+for+rhesus+epiretinal+scaffold+implantation+with+HiPSC-derived+retinal+progenitors.">Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors.</a> Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+scaffolds+facilitate+epiretinal+transplantation+of+hiPSC-Derived+retinal+neurons+in+nonhuman+primates.">Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates.</a> Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).</li></ol>

MSS er / var en betalt rådgiver for Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, WL Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals og Acucela. MSS mottar sponset forskningsstøtte fra Bayer. Disse ordningene har blitt gjennomgått og godkjent av Johns Hopkins University i samsvar med sin interessekonfliktpolitikk. KVL er navngitt som oppfinnere på patentsøknader ved University of Colorado. MSS og YVL er navngitt som oppfinnere på patentsøknader ved Johns Hopkins University.

Subretinal transplantasjon hos mus er teknisk utfordrende på grunn av den lille størrelsen på museøynene. I denne studien utviklet vi en enkel og reproduserbar plattform for subretinal transplantasjon hos mottakere av mus. Plattformen tillater konsistens i donorens levedyktighetsbeskyttelse, vellykket subretinal levering og sikrer en lav komplikasjonsrate.
Den subretinale transplantasjonsteknikken som er avbildet her, ble utviklet basert på transskleralruten, hvor injeksjonsnålen trenger inn i de ytre lagene (sclera-choroid-RPE-kompleks) i øyeveggen. Sammenlignet med transkorneal19,20 og transvitreous21,26,27-tilnærmingen, går den transsklerale tilnærmingen direkte inn i subretinalrommet uten å trenge inn i de fremre segmentstrukturer og nevrale netthinnen, og muliggjør dermed en ufarlig transplantasjon og reduserer risikoen for refluks fra donorceller gjennom det gjennomtrengende hullet. En utfordring med den transsklerale tilnærmingen er å sikre at nålespissen forplanter seg langs det subretinale rommet før den ankommer terminalleveringsstedet, samtidig som man unngår potensiell forstyrrelse av de tilstøtende RPE- og koroidlagene. Det er utfordrende å nå disse målene gjennom en tradisjonell transskleral tilnærming28,29 uten direkte visuell veiledning. I denne studien utviklet vi en transpupillær visjonsstyrt plattform ved hjelp av et kirurgisk mikroskop og ekstern belysning av netthinnen for å lette subretinal transplantasjon i musemodeller. Plattformen gjør det mulig for operatøren å spore den kirurgiske prosessen og mottakernes retinale tilstand ved å gi sanntidsvisualisering av mottakerfundus under kirurgisk mikroskop. For eksempel kan vellykket penetrasjon av sclera-choroid-RPE-komplekset enkelt valideres ved en relativt lys refleksjon av nålespissen via transpupillvisualisering. Det er viktig at operatøren, når den styres av transpupillvisualisering, nøyaktig kan modulere vinkelen og injeksjonsdybden i henhold til den relative posisjonen mellom nålen og anatomiske strukturer i mottakerens netthinne (f.eks. Retinalkar og optisk nervehode). Videre kan nøyaktig administrasjon av materialer ved hjelp av denne teknikken minimere RPE, choroid traumer og andre kirurgiske komplikasjoner. Faktisk fant vi blødninger kan minimeres ved å unngå manøvrer i nærheten av retinale blodkar ved hjelp av transpupillvisualisering.
Refluks av donorceller er en viktig årsak til kirurgisk svikt etter injeksjon29,30. Det er flere faktorer involvert i å fremme refluks fra donorceller. Det høye intraokulære trykket (IOP) i mottakerens øyne forårsaket av de injiserte donorcelleblandingene er en viktig faktor som fremmer tilbakestrømningen av celler ut av øyet. Vår protokoll reduserer mottakerens IOP ved fremre kammerpenetrasjon i begynnelsen av operasjonen og gjør det mulig for IOP å senke spontant ved vandig væskeutgang før glassnålen trekkes ut fra glasslegemet. En annen faktor er den uforseglede injeksjonstunnelen i mottakerens øyne. For å forhindre tilbakestrømning av transplantat gjennom injeksjonstunnelen, bruker vi en mikroinjeksjonsnål av liten størrelse (34G) for å lage en selvforseglende tunnel når den trenger inn i øyeveggen og tannmikrotang for å holde kantene på den eksterne tunnelåpningen når vi trekker ut nålen. Ved konvensjonell transplantasjon oppdages reflukstransplantater knapt fordi de kan oppstå raskt eller forsvinne raskt. Natriumhyaluronatet, ved påføring av dekselet, glir nesten alltid av hornhinnen for å dekke det meste av limbus og sclera, inkludert sklerotomistedet. Etter celleinjeksjon kan natriumhyaluronatet på sklerotomistedet bidra til å redusere bulkstrømmen av tilbakeløpsinnhold, hvis noen, og bidra til å gjøre dem visuelt detekterbare under kirurgisk mikroskop. Videre kan fraværet av refluks også verifiseres ved å spore konstantiteten til subretinal bleb for cellesuspensjoner og den intraokulære plasseringen av retinalarket ved hjelp av vår protokoll, noe som kan være nyttig for laboratorier der optisk koherenstomografi (OCT) ikke er tilgjengelig.
Mens et betydelig antall fotoreseptorceller overlevde i de transplanterte retinale arkene, kunne ingen merkbar cellulær orientering eller arkorientering detekteres. Selv om levering av 3D retinalark til store dyr er etablert 26,31,32, gjør det subretinale rommet i mus, kombinert med mangelen på intraoperativ retinal imaging evne, det svært utfordrende å sikre vedlikehold av arkorientering intraoperativt, så vel som i den umiddelbare postoperative perioden hvor de transplanterte cellene eller arkene kan bli ustabile når musen gjenvinner ambulering.
Vi beskriver en transskleral kirurgisk plattform med direkte transpupillær synsveiledning for subretinal transplantasjon hos mottakere av mus. Denne plattformen muliggjør høy nøyaktighet av injeksjon og en lav frekvens av kirurgiske komplikasjoner. Denne plattformen muliggjør presis levering av kjente doser celler, er relativt lett å lære, og letter subretinal levering i tillegg til intra-retinale eller intravitreale injeksjoner for ulike typer terapeutiske midler, inkludert genterapi.

Transplantasjon av fotoreceptor og retinalpigmenterte epitelceller (RPE) gir potensiell terapi for retinal degenerative sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), Stargardt sykdom og retinitis pigmentosa (RP) 1,2,3,4,5,6,7 . For å fylle opp eller erstatte de syke fotoreceptorene og RPE-cellene i degenerert retinae, er det subretinale rommet spesielt godt egnet som et transplantasjonsmål gitt den laminære anatomien til vertsfotoreceptorer og RPE-celler. Mens kirurgiske prosedyrer for subretinal transplantasjon av RPE-celler er veletablerte hos store dyr 8,9,10 og kliniske studier11,12,13, inkluderer utfordringer for fotoreceptortransplantasjonsforskning mangelen på transgene store dyremodeller og den begrensede forståelsen av dyptgående synaptogenesemekanismer involvert i nevrontransplantasjon, blant andre bekymringer. Genmodifiserte murinmodeller, med ulike typer retinal degenerasjonsmutanter, gir nyttige verktøy for å studere molekylære mekanismer i sammenheng med transplantasjon og styre utviklingen av effektive celleerstatningsterapier på preklinisk stadium 14,15,16,17,18.
I motsetning til det relativt store øyet og den lille krystallinske linsen hos store dyr (f.eks. gris, ape), gjør den lille størrelsen og den store krystallinske linsen til museøyne dem vanskelige kirurgiske mål, spesielt for subretinal transplantasjon der fysiske plassbegrensninger og begrenset direkte visualisering er kjerneutfordringene.
Nåværende tilnærminger kan klassifiseres i tre hovedtyper basert på injeksjonsveien. For det første, når det gjelder trans-hornhinne-tilnærmingen, føres nålen gjennom hornhinnen inn i glasshulen og deretter inn i det subretinale rommet19,20. Vellykket subretinal levering kan oppnås ved hjelp av denne metoden, men skaden på fremre segmentstrukturer (dvs. hornhinnen, iris, linse) er en stor risiko som kan hindre nedstrøms in vivo-analyse. For det andre, når det gjelder transglasslegemet, kommer nålen inn i glasshulen gjennom pars plana og deretter inn i subretinalrommet21. Denne tilnærmingen er mye brukt hos mennesker og store dyr. Imidlertid er det en potensiell risiko for linseskade hos gnagere, da linsen opptar et større relativt volum av glasshulen. Spesielt krever både trans-hornhinde og trans-vitreous protokoller penetrasjon av nevrale retina for å komme til subretinalrommet, noe som forårsaker skade på vertsnetthinnen og øker risikoen for donorcelle refluks gjennom penetrasjonshullet. For det tredje, i tilfelle av transskleral tilnærming22,23, trenger nålen gjennom skleral-choroid-RPE-komplekset og går direkte inn i subretinalrommet. Denne tilnærmingen reduserer potensielle traumer av fremre segmentstrukturer og glasshulen. Imidlertid, uten direkte visualisering av verten fundus, oppdages ofte kirurgiske feil forårsaket av transretinale punkteringer, RPE-løsrivelse og choroidblødning.
Her utviklet vi en transskleral kirurgisk plattform med direkte transpupillær synsveiledning for subretinal transplantasjon hos musemottakere. Validering av levedyktigheten til donor retinal ark og cellesuspensjoner før transplantasjon ble utført. Vellykket levering av donorceller inn i det subretinale rommet til en retina degenerasjonsmusemodell ble bekreftet. Det ble kun påvist sjeldne kirurgiske komplikasjoner. I tillegg overlevde transplanterte fotoreseptorer i retinale transplantater og viste tegn på avansert modning til "voksne" staver og tapper to måneder etter transplantasjonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears</td>
			<td>CareAll</td>
			<td>P31447-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (5mm in diameter)</td>
			<td>Deckglaser</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-GFP (FITC)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab6662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit Cy3&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>Easy Touch</td>
			<td>08496-3015-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone Zetamine</td>
			<td>AH2017J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead Viability Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissor</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro smooth forceps</td>
			<td>ASICO</td>
			<td>AE-4360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro toothed forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555041FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (26G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7804-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (34G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>207434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish (35 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine (10%)</td>
			<td>Betadine Solution</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride (0.5%)</td>
			<td>Keeler</td>
			<td>AX0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-recoverin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-S-opsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyaluronate</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Vision&#160;</td>
			<td>10-2400-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 2PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile needle (25G)</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical materials/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>112-7192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model

Transplantasjon av fotoreceptorceller og retinal pigmentepitelceller (RPE) gir en potensiell terapi for retinal degenerasjonssykdommer. Subretinal transplantasjon av terapeutiske donorceller til musemottakere er utfordrende på grunn av den begrensede kirurgiske plassen som tillates av det lille volumet av museøyet. Vi utviklet en transskleral kirurgisk transplantasjonsplattform med direkte transpupillær synsveiledning for å lette subretinal levering av eksogene celler hos musemottakere. Plattformen ble testet ved hjelp av retinale cellesuspensjoner og tredimensjonale retinalark samlet fra stavrike Rho:: EGFP-mus og kjeglerike OPN1LW-EGFP; NRL-/- mus, henholdsvis. Levende/døde analyser viste lav celledødelighet for begge former for donorceller. Retinale transplantater ble vellykket levert inn i det subretinale rommet til en musemodell av retinal degenerasjon, Rd1 / NS, med minimale kirurgiske komplikasjoner som detektert ved multimodal konfokal skanning laser oftalmoskop (cSLO) avbildning. To måneder etter transplantasjonen viste histologisk farging tegn på avansert modning av retinale transplantater til "voksne" staver og tapper (ved robust henholdsvis Rho:: EGFP, S-opsin og OPN1LW: EGFP-uttrykk) i subretinalrommet. Her tilbyr vi en kirurgisk plattform som kan muliggjøre svært nøyaktig subretinal levering med lav komplikasjonsgrad hos musemottakere. Denne teknikken gir presisjon og relativ enkel ferdighetsoppkjøp. Videre kan teknikken brukes ikke bare for studier av subretinal celletransplantasjon, men også for andre intraokulære terapeutiske studier, inkludert genterapier.

Netthinnetransplantater leveres vellykket inn i subretinalrommet og overlevde in vivo. Ytelsen til vår subretinale transplantasjonsplattform ble vurdert hos Rd1/NS-mottakermus i alderen 6-8 uker da deres gjenværende retinae ble alvorlig tynnet på grunn av den nesten fullstendige degenerasjonen av ytre nukleært lag (ONL). Gitt netthinnens skjørhet, mangelen på keglefotoreseptorer og den relativt dårlige levedyktigheten til celler i suspensjon sammenlignet med arkdonorer, keglerike mus (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 ble brukt som kilder til donor retinal ark og stavrike mus (Rho::EGFP) som donor for cellesuspensjoner. Keglerike retinalark- og stavrike cellesuspensjoner ble vellykket levert inn i subretinalrommet til alle mottakermus ved hjelp av vår kirurgiske plattform, som bekreftet av subretinal bleb og hvitt ark sett ved bruk av transpupillvisualisering umiddelbart etter injeksjon. To måneder etter transplantasjonen ble det utført multimodal cSLO avbildning for å spore tilstandene av retinale transplantater in vivo. Tverrsnitts-OCT-skanning viste at retinale transplantater overlevde i subretinalrommet og rekonstituerte ONL hos alle mottakermus (figur 3A). Infrarød bildediagnostikk påviste ingen åpenbar grå stær i alle transplanterte øyne (figur 3B). Andre kirurgiske komplikasjoner, inkludert blødning, ble sjelden påvist hos transplanterte retinae (n = 1/10 øyne) ved flerfarget refleksjonsavbildning to måneder etter transplantasjonen (figur 3C). Vi utførte histologisk farging for å vurdere overlevelse og grad av modning av fotoreseptorer i retinale transplantater ytterligere. Rikelig med kjeglefotoreseptorer som uttrykker OPN1LW: EGFP og S-opsin i transplanterte retinale ark ble observert. På samme måte viste transplanterte retinalcellesuspensjoner en stor andel Rec + fotoreceptorer in vivo, inkludert mange Rho:: EGFP + staver (figur 3D). De ikke-transplanterte kontrollmusene viste alvorlig ONL-degenerasjon med sparsomme gjenværende kjeglefotoreseptorer (Rec+). Det ble ikke påvist EGFP-signal i ikke-transplantert Rd1/NS retina (figur 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk innsamling av donor retinal ark og celle suspensjoner. Skjemaer som viser de viktigste trinnene for å samle retinal celle suspensjoner og ark fra donor Rho:: EGFP mus. Lysfelt og fluorescerende avbildning viste representative bilder av dissosierte celler og et dissekert ark isolert fra Rho::EGFP-mus . Gul stiplet linje: snittmarg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg"> Figur 2 Prosedyrer for subretinal transplantasjon av retinale ark og cellesuspensjon i Rd1/NS-mus. (A) Skjematiske bilder av resipientmusforberedelse. (B) Viktige kirurgiske prosedyrer og tilhørende diagrammer som viser subretinal transplantasjon av retinale cellesuspensjoner og ark. Kirurgiske trinn inkluderer: 1. trenge inn i det fremre kammeret; 2. Slipp natriumhyaluronatet på hornhinnen, og monter deretter dekselet på toppen av natriumhyaluronatet for å lette transpupillvisualiseringen; 3. Penetrer ytre lag av øyeveggen (sclera-choroid-RPE-kompleks). Nålens gjennomtrengningsvinkler er øverst til høyre på illustrasjonen; 4. Sett inn injeksjonsnålen; 5. Injiser transplantater. Representative bilder viser vellykket levering av retinal celle suspensjoner og ark i to individuelle mottakere, henholdsvis. Stjerne: optisk nervehode; Røde pilspisser: retinal blodkar; Hvit pilspiss: penetrert nålespiss; Hvite piler: podet retinal suspensjoner eller ark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg"> Figur 3: Vellykket tilførsel av retinale transplantater i det subretinale rommet og overlevelse in vivo. (A) Representative SD-OCT-bilder viste subretinal fordeling av transplanterte retinale ark og cellesuspensjoner i henholdsvis to individuelle Rd1/NS-mus . Ikke-transplanterte Rd1/NS-mus ble samlet inn som kontroll. Interesseregion (ROI) angis med gulprikkede bokser på infrarøde (IR) fundusbilder. Indre retina er betegnet som laminae av retinal ganglioncellelag (RGC), indre plexiform lag (IPL) og indre kjernelag (INL). (B) Representativt infrarødt (IR) bilde av en transplantert Rd1/NS-mus viste ingen grå stær gjennom den utvidede pupillen. (C) Representative flerfarget refleksjon (MR) bilder av transplanterte og ikke-transplanterte Rd1 / NS øyne. De transplanterte øynene presenterte ingen åpenbare kirurgiske komplikasjoner, inkludert blødning. (D) Immunhistokjemi (IHC) farging av transplanterte- (ark og suspensjon) og ikke-transplanterte (kontroll) Rd1/NS-mus . Dataene viste mange podede fotoreseptorer som uttrykker spesifikke markører for fotoreseptorer (Rec), staver (Rho:: EGFP), L / M-tapper (OPN1LW: EGFP) og S-tapper (S-opsin) ved to måneder etter transplantasjon. Mottaker retinal laminae ble identifisert ved DAPI-farging (blå). Netthinnetransplantater ble identifisert av EGFP-reporter (grønn). De ikke-transplanterte musene i netthinnen viste alvorlig ONL-degenerasjon med sparsomme gjenværende kjeglefotoreseptorer (Rec+). Det ble ikke påvist EGFP-signal i ikke-transplantert Rd1/NS retinae. Forstørrede bilder ble presentert på de to høyre panelene. Forkortelser: RGC: retinal ganglion cellelag; INL: indre kjernelag. ONL: ytre kjernefysisk lag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Denne protokollen presenterer en transpupillær visjonsstyrt transskleral tilnærming for å trygt og presist levere subretinale cellulære transplantater, med lav frekvens av kirurgiske komplikasjoner, hos musemottakere med eller uten retinal degenerasjon.

Transpupillærveiledet transskleral transplantasjon av subretinale transplantater i en musemodell for retinal degenerasjon

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Det overordnede målet med denne studien er å utvikle en transskleral transplantasjonsplattform med direkte transpupillærveiledning for å lette subretinal levering av celler hos musemottakere. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til National Institute of Health Guide. Vår erklæring om bruk av dyr og godkjent av Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee.Ved å ta i bruk EGFP-mus alder på postnatal dag 3-6 ble brukt som donorer av retinal celle suspensjoner. OPN1LW-EGFP/NRL-mus, alder ved postnatal dag 3 ble adoptert som retinale arkgivere. Voksne retinal degenerasjon Rd1/NS-mus med immunsvikt ble brukt som mottakere.Avlive donormus med overdose karbondioksid. For å isolere musens øyeepler, åpne forsiktig valpens øyelokk med en mikrosaks og utsett øyeeplet. Pakk optisk nerve, og trekk ut øyebollet med glatte tang.Når øyebollene er isolert, snitt et hull i midten av hornhinnen ved hjelp av en 25-gauge nål. Klipp hornhinnen i to gjennom hullet. Og forstørre snittet til sclera og RPE.Fjern deretter sclera og RPE. Bruk deretter mikrotannede tang for å forsiktig fjerne linsen og glasslegemet for å isolere nevrale netthinnen. For å samle donor retinal suspensjon, inkuber nevrale retina i Papain-oppløsning ved 37 celsius i 20 til 30 minutter til ingen celleklumper kan påvises.Samle enkeltcellene etter produsentens instruksjoner fra Papain-settet. For å forberede retinalark, legg den isolerte netthinnen i en petriskål med PBS. Klipp deretter forsiktig nevrale netthinnen i flere retinale ark med en mikrosaks.Bedøv mottakermus med en intraperitoneal injeksjon av ketamin og xylazin. Sørg for at anestesiplanet oppnås, det vil si det kirurgiske planet der dyret mister blink og smertereflekser, men pust og respirasjon forblir regelmessig. Vurder bedøvelsesdybden ved haleklype eller pedaluttaksrefleksene.Kontroller bedøvelsesdybden under den operative prosedyren. Hold musene på det forvarmede operasjonsbordet for å unngå hypotermi. Utvid mottakeren elever med tropicamide øyedråper fem minutter før operasjonen.En godt utvidet pupill kan lette transpupillvisualisering under operasjonsmikroskopet. Sett en dråpe proparakainhydroklorid på musøyet for analgesi. Desinfiser operasjonsmuseøyet og omkringliggende okulært vev med jod.Rengjør deretter øyet med steril PBS. Penetrer den perifere tunnelen inn i det indre kammeret for å redusere det intraokulære trykket. Deretter legger du en dråpe natriumhyaluronat og et glassdeksel på toppen av hornhinnen.Transpupillær visualisering av mus fundus er nå tilgjengelig under kirurgisk omfang. Eksponer injeksjonsstedet ved å skyve øyeveggen mot midten av det transpupillære visuelle med tannede tang. Deretter trenger du delvis inn i sclera med en mikroinjeksjonsnål, vendt 90 grader mot øyeveggen.De overfladiske retinalkarene kan tjene som en anatomisk referanse for å lokalisere nålen i det subretinale rommet. Deretter injiserer retinal grafts. De forhåndslastede små boblene i sprøyten kan gjøre det lettere å validere den subretinale plasseringen av donorceller.Hvis hornhinnen blir overskyet, hold nålen i subretinalrommet, til hornhinnen blir gjennomsiktig for å normalisere det intraokulære trykket. Ta tak i kanten av injeksjonshullet og trekk raskt ut kanylen. Kriteriet for vellykket levering av cellesuspensjon er en konstant bleb i subretinalrommet.En vellykket levering av retinal ark, er overbevist av et synlig hvitt ark. Hold transplanterte mus på et forvarmet rent gjenopprettingsbur, og overvåk dem nøye for eventuelle nødtegn. Hvis dette skjer, legg en dråpe aktuell proparakainhydroklorid på det kirurgiske øyet i to, tre ganger.Fjern musene tilbake til husburet etter at musene er helt våkne og mobile. Legg et lite antall matpellets i gelkoppen på gulvet i buret. Hvis musene har problemer med å nå matbeholderen.To måneder etter transplantasjonen ble multimodal konfokal skanning laser oftalmoskopi utført for å sjekke tilstandene av retinale transplantater sett vivo. Spektraldomenets optiske koherenstomografi viste at retinale transplantater overlevde i subretinalrommet og rekonstituerer det ytre nukleære laget av alle mottakermus. Infrarød avbildning påviste ingen åpenbar grå stær hos alle transplanterte mus.Andre kirurgiske komplikasjoner, inkludert blødning, ble dårlig oppdaget hos transplanterte mus ved flerfarget refleksjonsavbildning. Histologisk farging viste rikelig med kjeglefotoreseptorer som uttrykker OPN1LW:EGFP og S-opsin i transplanterte retinale ark. På samme måte viste transplantasjon av retinalcellesuspensjoner en stor andel gjenoppretting av positive fotoreceptorer in vivo, inkludert mange modne EGFP-positive staver.De ikke-transplanterte musene viste alvorlig degenerasjon av ytre kjernefysisk lag med sparsomme gjenværende kjeglefotoreceptorer som uttrykker utvinning. Imidlertid ble det ikke påvist noe EGP-signal hos ikke-transplanterte mus. Denne studien gir en transskleral kirurgisk plattform med direkte transpupillær synsveiledning for subretinal transplantasjon hos musemottakere.Denne plattformen muliggjør presis levering av kjente doser celler. Det er relativt enkelt å lære og legge til rette for subretinal levering i tillegg til intraretinale eller intravitreale injeksjoner for forskjellige typer terapeutiske midler, inkludert genterapi.

Without Section

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementering Dynamic Clamp med Synaptic og kunstig conductances i mus retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin Digest protokollen til Analyser Retinal blodkar av en mus modell

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbale Approach-subretinal Injeksjon av virale vektorer for genterapi i Mus retinal pigment epitelet

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Utvikling av en raffinert protokoll for Trans-Innbukking Subretinal transplantasjon av menneskelig netthinnens Pigment epitelceller i rotte øyne

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

MÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Müller Glia celle aktivering i en Laser-indusert Retinal degenerasjon og Regeneration modell i sebrafisk

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Delvis synsnerven Transection i rotter: modell etablert med en ny Operative tilnærming til vurdere sekundære degenerasjon av netthinnen ganglieceller

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...