Name: transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Detta arbete finansierades av följande medel: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), Shulsky Foundation (MSS), Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (obegränsat bidrag till Wilmer Eye Institute vid Johns Hopkins University och Cullen Eye Institute vid Baylor College of Medicine). Vi tackar Dr. Malia Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) för att hon vänligen gav utbildning i mikroskopet.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, reviderad 1978) och ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Alla procedurer godkändes av Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (godkännande M021M459).
1. Djur
<ol><li>Använd Rho::EGFP-möss (i åldern P3-P6) som donatorer av retinala cellsuspensioner. OBS: Denna stam var en vänlig gåva från Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine.</li>
	<li>Använd OPN1LW-EGFP/NRL-/- möss14 (i åldern P3) som donatorer av näthinneark.</li>
	<li>Använd vuxna retinal degeneration Rd1/NS-möss med immunbrist (båda könen) som mottagare.</li>
	<li>Håll alla möss i burar under en ljus-mörkercykel på 12:12 med tillgång till vatten och mat efter behov.</li>
</ol>2. Samla in neural näthinna (Figur 1)
OBS: Alla följande steg utfördes under sterila förhållanden. Leverantörsinformation om forskningsverktygen och produkterna finns i materialförteckningen.
<ol><li>Förberedelse av donatormöss: Avliva donatormöss med en överdos av koldioxid och bekräfta eutanasi med cervikal dislokation.</li>
	<li>Isolera mössens ögonglober. För att göra det, följ stegen nedan.<ol><li>Öppna försiktigt valparnas ögonlock med en mikrosax för att exponera ögongloben.</li>
		<li>Använd en slät pincett för att ta tag i synnerven och dra ut ögongloben med en pincett.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolera neural näthinna OBS: Detta steg utförs under ett dissektionsmikroskop.<ol><li>Skär ett hål i mitten av hornhinnan med en 25 G steril nål.</li>
		<li>Skär hornhinnan, genom hålet, på mitten och förstora snittet till sclera och RPE, ta sedan bort sclera och RPE.</li>
		<li>Använd en mikrotandad pincett för att försiktigt ta bort linsen och glaskroppen för att isolera den neurala näthinnan.</li>
		<li>Fortsätt med avsnitt 3 för att förbereda donatorns näthinnesuspension eller avsnitt 4 för att förbereda donatorns näthinneark, efter behov.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Förbered donatorns näthinnesuspension (figur 1)
<ol><li>Inkubera nervnäthinnan i Papain-lösning vid 37 °C i 20-30 minuter tills inga cellklumpar upptäcks. OBS: Pipettera försiktigt cellblandningen 15 gånger var 10:e minut.</li>
	<li>Följ tillverkarens instruktioner för Papain Dissociation Kit för att samla in enstaka celler.</li>
</ol>4. Förbered donatorns näthinneark (Figur 1)
OBS: Detta steg följer avsnitt 2 och utförs under ett dissektionsmikroskop.
<ol><li>Lägg den isolerade näthinnekoppen i en 35 mm petriskål med förkyld steril PBS.</li>
	<li>Använd en mikrosax för att klippa den neurala näthinnekoppen i flera näthinneark (cirka 1 mm x 2 mm).</li>
</ol>5. Förbered mottagarmöss
<ol><li>Bedöva mottagarmöss med intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg/kg kroppsvikt) och xylazinhydroklorid (20 mg/kg kroppsvikt).</li>
	<li>Bekräfta det kirurgiska anestesiplanet genom att säkerställa förlust av blink- och smärtreflexer, regelbunden andning och andning.</li>
	<li>Bedöm anestesidjupet genom att inte reagera på svansklämning eller pedalreflexer.</li>
	<li>Kontrollera alltid anestesidjupet igen under det operativa ingreppet och justera bedövningsdjupet om djuret svarar på smärta. Förvara mössen på det förvärmda operationsbordet för att förhindra hypotermi.</li>
	<li>Vidga mottagande pupiller med 1 % (vikt/vol) tropicamid ögondroppar 5 min före operationen. En väl vidgad pupill kan underlätta transpupillvisualisering under operationsmikroskopet.</li>
	<li>Desinficera det opererande musögat och omgivande ögonvävnader med povidonjod, tvätta med steriliserad PBS.</li>
	<li>Applicera 0,5 % propparakainhydroklorid på musögat för smärtlindring.</li>
</ol>6. Subretinal transplantation av näthinnetransplantat (figur 2)
OBS: Alla följande steg utfördes under aseptiska förhållanden. Kirurgiska verktyg autoklaverades (använd instrumentbrickor för att skydda verktygsspetsarna och ta ut kolven ur mikrosprutorna för att förhindra att de fastnar i lumen). Leverantörsinformation om forskningsverktygen och produkterna finns i materialförteckningen.
<ol><li>Paracentes i främre kammaren: Penetrera perifer hornhinna i den främre kammaren med en insulinnål för att tillåta kammarvatten att passivt ta sig ut, för att förhindra att det intraokulära trycket (IOP) ökar under transplantationen. OBS: En lyckad paracentes indikeras av utflödet av kammarvatten genom hornhinnehålet.</li>
	<li>Lägg en droppe natriumhyaluronat och ett täckglas (5 mm diameter) ovanpå hornhinnan för att möjliggöra transpupillvisualisering av fundus under det kirurgiska skopet.</li>
	<li>Använd en tandad pincett för att exponera injektionsstället (1 mm efter hornhinnans limbus) genom att trycka antingen den övre eller nedre ögonväggen, enligt experimentets krav, mot centrum för det transpupillala seendet.</li>
	<li>Använd en mikroinjektionsnål för att vinkelrätt tränga in i sklera.</li>
	<li>Vrid försiktigt nålens riktning tangentiellt för att möjliggöra fullständig penetration av sklera-koroid-RPE-komplexet i det subretinala utrymmet.</li>
	<li>Stick in nålen tangentiellt för att komma åt terminalinjektionsplatsen. OBS: Verifiera den fullständiga placeringen av nålens avfasning med hjälp av transpupillseende. Använd de ytliga näthinnekärlen som en anatomisk referens för exakt nålpositionering i det subretinala utrymmet.</li>
	<li>Injicera näthinnetransplantat OBS: Närvaron av små bubblor förladdade i sprutan kan underlätta validering av den korrekta subretinala positioneringen av donatorceller. Förhöjt IOP till följd av subretinal injektion ökar risken för reflux från donatorceller.<ol><li>Om hornhinnan blir grumlig24,25, en indikator på högt IOP, håll nålen i det subretinala utrymmet i minst 3 minuter tills hornhinnan rensas, en indikator på att IOP har minskat tillräckligt. OBS: I sällsynta fall kan IOP ta längre tid att normalisera, och det rekommenderas att hålla nålen på plats tills hornhinnans klarhet är återställd även om det skulle ta 8-10 minuter. Observera under ett kirurgiskt mikroskop för att förhindra skador på näthinnans strukturer.</li>
	</ol></li>
	<li>Ta tag i injektionshålets kant med en mikrotandad pincett och dra snabbt ut nålen. OBS: Kriterierna för framgångsrik subretinal leverans av en retinal cellsuspension och ett ark är en konstant bleb respektive ett synligt vitt ark i det subretinala utrymmet.</li>
	<li>Rengör det kirurgiska området i ögat med konstgjorda tårar och applicera salva vid behov.</li>
	<li>Administrering efter operationen<ol><li>Placera transplanterade möss i en förvärmd (37 °C) ren uppvakningsbur och övervaka noggrant för att se om de är ansträngda.</li>
		<li>Applicera en droppe topikal 0,5 % propakainhydroklorid på det kirurgiska ögat 2-3 gånger om besvär uppstår.</li>
		<li>Sätt tillbaka mössen i buren när mössen är helt pigga och rörliga. Placera ett litet antal matpellets och en gelkopp i buren om mössen har svårt att nå matbehållaren. OBS: Håll ögonytan fuktig tills bedövningen avtar för att förhindra att grå starr bildas.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Multimodal konfokal skanning laseroftalmoskopi (cSLO) avbildning
<ol><li>Två månader efter transplantationen bedövas mottagarens Rd1/NS-möss (n=5) genom intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg/kg kroppsvikt) och xylazinhydroklorid (20 mg/kg kroppsvikt) för avbildning.</li>
	<li>Vidga pupillerna med 1 % (vikt/volym) tropicamid ögondroppar.</li>
	<li>Utför standard 55° multimodal avbildning med hjälp av det konfokala skanningslaseroftalmoskopet cSLO-system22.</li>
	<li>Få MR- och SD-OCT-bilder med 30 bildrutor med ART-medelvärde.</li>
</ol>8. Histologisk färgning
<ol><li>Förbered frysta objektglas av transplanterade Rd1/NS-mössögon som tidigare rapporterats 14.</li>
	<li>Blockera och penetrera de frysta objektglasen av transplanterade näthinnor med en blandning av 5 % getserum och 1 % Triton X100 i PBS.</li>
	<li>Inkubera prover med primära antikroppar över natten vid 4 °C och skölj i PBS (5 min, 3x). De primära antikropparna inkluderar get anti-GFP-FITC (1:200), kanin anti-recoverin (1:1000) och kanin anti-S-opsin (1:500).</li>
	<li>Inkubera proverna med sekundär antikropp (getantikanin Cy3, 1:500) och motfärga med DAPI. OBS: Leverantörerna av primära och sekundära antikroppar listas i materialförteckningen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced,+dry+age-related+macular+degeneration.">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Sci Transl Med. 10 (435), (2018).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration.">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+rescues+retinal+degeneration+in+rodents+and+pigs.">Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs.</a> Sci Transl Med. 11 (475), (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation.">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).</li><li>Shirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+two+primate+models+of+retinal+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).</li><li>Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+full-thickness+retina+in+the+rhodopsin+transgenic+pig.">Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig.</a> Retina. 24 (1), 98-109 (2004).</li><li>Klassen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+from+the+porcine+neural+retina+express+photoreceptor+markers+after+transplantation+to+the+subretinal+space+of+allorecipients.">Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients.</a> Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transplantation+of+human+fetal+neuroretinal+cells+in+advanced+retinitis+pigmentosa+patients:+results+of+a+long-term+safety+study.">The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study.</a> Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+retinal+transplantation.">Human neural retinal transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+of+human+retinal+progenitor+cell+transplantation+in+retinitis+pigmentosa+patients.">Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+allogeneic+transplantation+of+a+novel+transgenic+cone-rich+donor+mouse+line.">Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line.</a> Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).</li><li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors.">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).</li><li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+nanotubes+mediate+the+in+vivo+exchange+of+intracellular+material.">Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material.</a> EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).</li><li>Zou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-derived+C-Kit(+)/SSEA4(-)+human+retinal+progenitor+cells+promote+a+protective+retinal+microenvironment+during+transplantation+in+rodents.">Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents.</a> Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+photoreceptor+precursors+transfer+proteins+to+host+photoreceptors+by+a+mechanism+of+cytoplasmic+fusion.">Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion.</a> Nat Commun. 7, 13537 (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Nickerson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+delivery+and+electroporation+in+pigmented+and+nonpigmented+adult+mouse+eyes.">Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes.</a> Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+subretinal+injection+of+trypan+blue+in+rats.">Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifiable+in+vivo+imaging+biomarkers+of+retinal+regeneration+by+photoreceptor+cell+transplantation.">Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+analysis+of+xenotransplanted+human+retinal+organoids+defines+two+migratory+cell+populations+of+nonretinal+origin.">Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin.</a> Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+corneal+endothelial+dysfunction+to+facilitate+development+of+novel+therapies.">Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies.</a> Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ocular+hypertension+disrupts+barrier+integrity+and+pump+function+in+rat+corneal+endothelial+cells.">Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).</li><li>Chao, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+cells+into+the+subretinal+space+of+a+non-human+primate.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate.</a> Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).</li><li>Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+the+subretinal+space+of+the+cat+eye.">transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye.</a> Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+refined+protocol+for+trans-scleral+subretinal+transplantation+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+into+rat+eyes.">Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes.</a> J Vis Exp. (126), e55220 (2017).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), e4286 (2012).</li><li>Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+external+and+internal+approaches+for+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium.">Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+surgical+procedure+for+rhesus+epiretinal+scaffold+implantation+with+HiPSC-derived+retinal+progenitors.">Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors.</a> Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+scaffolds+facilitate+epiretinal+transplantation+of+hiPSC-Derived+retinal+neurons+in+nonhuman+primates.">Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates.</a> Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).</li></ol>

MSS är/har varit betald rådgivare till Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals och Acucela. MSS får sponsrat forskningsstöd från Bayer. Dessa arrangemang har granskats och godkänts av Johns Hopkins University i enlighet med dess riktlinjer för intressekonflikter. KVL namnges som uppfinnare på patentansökningar vid University of Colorado. MSS och YVL namnges som uppfinnare på patentansökningar vid Johns Hopkins University.

Subretinal transplantation på möss är tekniskt utmanande på grund av musögonens ringa storlek. I denna studie utvecklade vi en enkel och reproducerbar plattform för subretinal transplantation i musmottagare. Plattformen möjliggör konsekvens i donatorns viabilitetsskydd, framgångsrik subretinal tillförsel och säkerställer en låg komplikationsfrekvens.
Den subretinala transplantationstekniken som avbildas här utvecklades baserat på den transsklerala vägen, där injektionsnålen penetrerar de yttre lagren (sclera-choroid-RPE-komplexet) i ögonväggen. Jämfört med transhornhinnan19,20 och transglaskroppen21,26,27 går den transsklerala metoden direkt in i det subretinala utrymmet utan att penetrera de främre segmentstrukturerna och den neurala näthinnan, vilket möjliggör en ofarlig transplantation och minskar risken för reflux av donatorceller genom det penetrerande hålet. En utmaning med det transsklerala tillvägagångssättet är att säkerställa att nålspetsen fortplantar sig längs det subretinala utrymmet innan den anländer till terminalleveransplatsen, samtidigt som man undviker potentiell störning av de intilliggande RPE- och åderhinnelagren. Det är en utmaning att uppnå dessa mål genom ett traditionellt transskleralt tillvägagångssätt28,29 utan direkt visuell vägledning. I denna studie utvecklade vi en transpupillär synstyrd plattform med hjälp av ett kirurgiskt mikroskop och extern belysning av näthinnan för att underlätta subretinal transplantation i musmodeller. Plattformen gör det möjligt för operatören att spåra den kirurgiska processen och mottagarnas näthinnetillstånd genom att tillhandahålla realtidsvisualisering av mottagarens ögonbotten under det kirurgiska mikroskopet. Till exempel kan framgångsrik penetration av sklera-choroid-RPE-komplexet enkelt valideras genom en relativt ljus reflektion av nålspetsen via transpupillvisualisering. Det är viktigt att operatören, när han eller hon styrs av transpupillvisualisering, exakt kan modulera vinkeln och injektionsdjupet i enlighet med den relativa positionen mellan nålen och anatomiska strukturer i mottagarens näthinna (t.ex. näthinnekärl och synnervshuvud). Dessutom kan korrekt administrering av material med denna teknik minimera RPE, åderhinnetrauma och andra kirurgiska komplikationer. Vi fann att blödningar kan minimeras genom att undvika manövrar i närheten av näthinnans blodkärl med hjälp av transpupillvisualisering.
Reflux av donatorceller är en viktig orsak till kirurgisk svikt efter injektion29,30. Det finns flera faktorer som är involverade i att främja reflux från donatorceller. Det höga intraokulära trycket (IOP) i mottagarögonen som orsakas av de injicerade donatorcellblandningarna är en viktig faktor som främjar återflödet av celler ut ur ögat. Vårt protokoll minskar mottagarnas IOP genom penetration av främre kammaren i början av operationen och gör det möjligt för IOP att sänkas spontant genom vattenhaltig vätskeutträngning innan glaskroppen dras ut från glaskroppen. En andra faktor är den oförseglade injektionstunneln i mottagarnas ögon. För att förhindra transplantatåterflöde tillbaka genom injektionstunneln använder vi en liten mikroinjektionsnål (34G) för att skapa en självtätande tunnel när vi penetrerar ögonväggen och en tandad mikropincett för att hålla kanterna på den yttre tunnelöppningen när vi drar ut nålen. Vid konventionell transplantation upptäcks knappt refluxtransplantat eftersom de kan uppstå snabbt eller försvinna snabbt. Natriumhyaluronatet, vid applicering av täckglaset, glider nästan alltid av hornhinnan för att täcka det mesta av limbus och sclera inklusive sklerotomistället. Efter cellinjektion kan natriumhyaluronatet vid sklerotomistället hjälpa till att bromsa bulkflödet av refluxat innehåll, om något, och hjälpa till att göra dem visuellt detekterbara under det kirurgiska mikroskopet. Dessutom kan frånvaron av reflux också verifieras genom att spåra konstansen hos den subretinala bleben för cellsuspensioner och den intraokulära placeringen av näthinnearket med hjälp av vårt protokoll, vilket kan vara användbart för laboratorier där optisk koherenstomografi (OCT) inte är tillgänglig.
Även om ett stort antal fotoreceptorceller överlevde i de transplanterade näthinnearken, kunde ingen urskiljbar cellulär orientering eller arkorientering detekteras. Även om leverans av 3D-näthinneark till stora djur har etablerats 26,31,32, gör det subretinala utrymmet hos möss, tillsammans med bristen på intraoperativ näthinneavbildningsförmåga, det mycket utmanande att säkerställa upprätthållandet av arkorientering intraoperativt såväl som under den omedelbara postoperativa perioden under vilken de transplanterade cellerna eller arken kan bli instabila när musen återfår rörlighet.
Vi beskriver en transskleral kirurgisk plattform med direkt transpupillär synvägledning för subretinal transplantation hos musmottagare. Denna plattform möjliggör hög injektionsnoggrannhet och en låg frekvens av kirurgiska komplikationer. Denna plattform möjliggör exakt leverans av kända doser av celler, är relativt lätt att lära sig och underlättar subretinal tillförsel utöver intraretinala eller intravitreala injektioner för olika typer av terapeutiska medel inklusive genterapi.

Transplantation av fotoreceptorer och retinala pigmenterade epitelceller (RPE) ger potentiell behandling för retinala degenerativa sjukdomar som åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), Stargardts sjukdom och retinitis pigmentosa (RP)1,2,3,4,5,6,7 . För att fylla på eller ersätta de sjuka fotoreceptorerna och RPE-cellerna i degenererade näthinnor är det subretinala utrymmet särskilt väl lämpat som transplantationsmål med tanke på den laminära anatomin hos värdfotoreceptorer och RPE-celler. Även om kirurgiska ingrepp för subretinal transplantation av RPE-celler är väletablerade i stora djur 8,9,10 och kliniska prövningar 11,12,13, är utmaningarna för forskning om fotoreceptortransplantation bland annat bristen på transgena stordjursmodeller och den begränsade förståelsen av djupgående synaptogenesmekanismer som är involverade i neuronal transplantation. Genetiskt modifierade murina modeller, med olika typer av retinala degenerationsmutanter, ger användbara verktyg för att studera molekylära mekanismer i samband med transplantation och styra utvecklingen av effektiva cellersättningsterapier i det prekliniska stadiet 14,15,16,17,18.
Till skillnad från det relativt stora ögat och den lilla kristallina linsen hos stora djur (t.ex. gris, apa), gör den lilla storleken och stora kristallina linsen i musögon dem till svåra kirurgiska mål, särskilt för subretinal transplantation där fysiska utrymmesbegränsningar och begränsad direkt visualisering är de centrala utmaningarna.
Nuvarande tillvägagångssätt kan klassificeras i tre huvudtyper baserat på injektionsvägen. Först, när det gäller transhornhinnan, förs nålen genom hornhinnan in i glaskroppen och sedan in i det subretinala utrymmet19,20. Framgångsrik subretinal tillförsel kan uppnås med denna metod, men skador på främre segmentstrukturer (dvs. hornhinna, iris, lins) är en stor risk som allvarligt kan hindra nedströms in vivo-analys. För det andra, i fallet med det transglasartade tillvägagångssättet, går nålen in i glaskroppen genom pars plana och sedan in i det subretinala utrymmet21. Detta tillvägagångssätt används ofta hos människor och stora djur. Det finns dock en potentiell risk för linsskador hos gnagare eftersom linsen upptar en större relativ volym av glaskroppen. Noterbart är att både transhornhinne- och transglaskroppsprotokoll kräver penetration av den neurala näthinnan för att komma fram till det subretinala utrymmet, vilket orsakar skador på värdnäthinnan och ökar risken för donatorcellsreflux genom penetrationshålet. För det tredje, i fallet med det transsklerala tillvägagångssättet22,23, tränger nålen igenom det skleral-koroid-RPE-komplexet och går direkt in i det subretinala utrymmet. Detta tillvägagångssätt minskar det potentiella traumat av främre segmentstrukturer och glaskroppshålan. Men utan direkt visualisering av värdfundus upptäcks ofta kirurgiska fel orsakade av transretinala punkteringar, RPE-avlossning och koroidblödning.
Här utvecklade vi en transskleral kirurgisk plattform med direkt transpupillär synvägledning för subretinal transplantation hos musmottagare. Validering av livsdugligheten hos donatorns näthinneark och cellsuspensioner före transplantation utfördes. Framgångsrik leverans av donatorcellerna till det subretinala utrymmet i en modell av en modell av näthinnedegeneration bekräftades. Endast sällsynta kirurgiska komplikationer upptäcktes. Dessutom överlevde transplanterade fotoreceptorer i näthinnetransplantaten och visade tecken på avancerad mognad till "vuxna" stavar och tappar två månader efter transplantationen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears</td>
			<td>CareAll</td>
			<td>P31447-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (5mm in diameter)</td>
			<td>Deckglaser</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-GFP (FITC)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab6662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit Cy3&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>Easy Touch</td>
			<td>08496-3015-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone Zetamine</td>
			<td>AH2017J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead Viability Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissor</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro smooth forceps</td>
			<td>ASICO</td>
			<td>AE-4360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro toothed forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555041FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (26G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7804-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (34G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>207434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish (35 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine (10%)</td>
			<td>Betadine Solution</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride (0.5%)</td>
			<td>Keeler</td>
			<td>AX0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-recoverin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-S-opsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyaluronate</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Vision&#160;</td>
			<td>10-2400-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 2PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile needle (25G)</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical materials/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>112-7192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model

Transplantation av fotoreceptorceller och retinala pigmentepitelceller (RPE) ger en potentiell behandling för näthinnedegenerationssjukdomar. Subretinal transplantation av terapeutiska donatorceller till musmottagare är utmanande på grund av det begränsade kirurgiska utrymme som tillåts av musögats lilla volym. Vi utvecklade en transskleral kirurgisk transplantationsplattform med direkt transpupillär synvägledning för att underlätta subretinal leverans av exogena celler i musmottagare. Plattformen testades med hjälp av retinala cellsuspensioner och tredimensionella näthinneark insamlade från stavrika Rho:: EGFP-möss och konrika OPN1LW-EGFP; NRL-/- möss, respektive. Levande/död analys visade låg cellmortalitet för båda formerna av donatorceller. Retinala transplantat levererades framgångsrikt till det subretinala utrymmet i en musmodell av retinal degeneration, Rd1/NS, med minimala kirurgiska komplikationer som upptäcktes med multimodalt konfokalt skanningslaseroftalmoskop (cSLO) avbildning. Två månader efter transplantationen visade histologisk färgning tecken på avancerad mognad av näthinnetransplantaten till "vuxna" stavar och tappar (genom robust Rho::EGFP-, S-opsin- respektive OPN1LW:EGFP-uttryck) i det subretinala utrymmet. Här tillhandahåller vi en kirurgisk plattform som kan möjliggöra mycket exakt subretinal förlossning med en låg frekvens av komplikationer hos musmottagare. Denna teknik erbjuder precision och relativt enkel färdighetsinlärning. Dessutom skulle tekniken kunna användas inte bara för studier av subretinal celltransplantation utan även för andra intraokulära terapeutiska studier inklusive genterapier.

Retinala transplantat levereras framgångsrikt in i det subretinala utrymmet och överlevs in vivo. Prestandan hos vår subretinala transplantationsplattform utvärderades i Rd1/NS-mottagande möss i åldern 6-8 veckor när deras kvarvarande näthinna var kraftigt förtunnad på grund av den nästan fullständiga degenerationen av det yttre kärnlagret (ONL). Med tanke på näthinnans bräcklighet, bristen på tappfotoreceptorer och den relativt dåliga livskraften hos celler i suspension jämfört med arkdonatorer, var konrika möss (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 användes som källor till donatornäthinneark och stavrika möss (Rho::EGFP) som donator för cellsuspensioner. Konrika näthinnedukar och stavrika cellsuspensioner levererades framgångsrikt till det subretinala utrymmet hos alla mottagande möss med hjälp av vår kirurgiska plattform, vilket bekräftades av det subretinala bleb och vita arket som sågs med transpupillvisualisering omedelbart efter injektionen. Två månader efter transplantationen utfördes multimodal cSLO-avbildning för att spåra tillstånden hos näthinnetransplantat in vivo. Tvärsnitts-OCT-skanning visade att näthinnetransplantat överlevde i det subretinala utrymmet och rekonstituerade ONL hos alla mottagande möss (Figur 3A). Infraröd avbildning påvisade ingen uppenbar grå starr i alla transplanterade ögon (Figur 3B). Andra kirurgiska komplikationer, inklusive blödning, upptäcktes sällan i transplanterad näthinna (n = 1/10 ögon) med flerfärgsreflektansavbildning två månader efter transplantationen (Figur 3C). Vi utförde histologisk färgning för att ytterligare bedöma överlevnad och mognadsgrad av fotoreceptorer i näthinnetransplantat. Rikligt med tappfotoreceptorer som uttrycker OPN1LW:EGFP och S-opsin i transplanterade näthinneark observerades. På samma sätt uppvisade transplanterade retinala cellsuspensioner en stor andel Rec+-fotoreceptorer in vivo, inklusive ett stort antal Rho::EGFP+-stavar (Figur 3D). De icke-transplanterade kontrollmössen uppvisade allvarlig ONL-degeneration med glesa kvarvarande tappfotoreceptorer (Rec+). Ingen EGFP-signal detekterades i icke-transplanterad Rd1/NS-näthinna (figur 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk bild av insamling av donatorns näthinneark och cellsuspensioner. Scheman som visar de viktigaste stegen för att samla in retinala cellsuspensioner och ark från donatorn Rho::EGFP-möss . Ljusfälts- och fluorescerande avbildning visade representativa bilder av dissocierade celler och ett dissekerat ark isolerat från Rho::EGFP-möss . Gul streckad linje: snittmarginal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg"> Figur 2: Procedurer för subretinal transplantation av näthinneark och cellsuspension hos Rd1/NS-möss. (A) Schematiska bilder av förberedelse av mottagande möss. B) Viktiga kirurgiska ingrepp och motsvarande diagram som visar subretinal transplantation av näthinnecellsuspensioner och näthinneceller. Kirurgiska steg inkluderar: 1. penetrera den främre kammaren; 2. Släpp natriumhyaluronatet på hornhinnan och montera sedan täckglaset ovanpå natriumhyaluronatet för att underlätta den transpulära visualiseringen; 3. penetrera de yttre lagren av ögonväggen (sclera-choroid-RPE-komplex). Nålens penetrationsvinklar finns på den övre högra panelen på illustrationen; 4. Sätt i injektionsnålen; 5. Injicera transplantat. Representativa bilder visar framgångsrik leverans av retinala cellsuspensioner och ark i två individuella mottagare. Asterisk: synnervshuvud; Röda pilspetsar: näthinnans blodkärl; Vit pilspets: penetrerad nålspets; Vita pilar: transplanterade näthinnesuspensioner eller ark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg"> Figur 3: Framgångsrik leverans av näthinnetransplantat till det subretinala utrymmet och överlevnad in vivo. (A) Representativa SD-OCT-bilder visade den subretinala fördelningen av transplanterade näthinneark och cellsuspensioner i två individuella Rd1/NS-möss . Icke-transplanterade Rd1/NS-möss samlades in som kontroll. Region of Interest (ROI) indikeras av gulprickade rutor på infraröda (IR) fundusbilder. Inre näthinnan betecknas som lameller i retinalt gangliecellskikt (RGC), inre plexiformskikt (IPL) och inre kärnskikt (INL). (B) Representativ infraröd (IR) bild av en transplanterad Rd1/NS-mus visade ingen grå starr genom den vidgade pupillen. (C) Representativa flerfärgade reflektansbilder (MR) av transplanterade och icke-transplanterade Rd1/NS-ögon . De transplanterade ögonen uppvisade inga uppenbara kirurgiska komplikationer inklusive blödning. (D) Immunhistokemisk (IHC) färgning av transplanterade (ark och suspension) och icke-transplanterade (kontroll) Rd1/NS-möss . Data visade ett stort antal transplanterade fotoreceptorer som uttryckte specifika markörer för fotoreceptorer (Rec), stavar (Rho::EGFP), L/M-tappar (OPN1LW:EGFP) och S-tappar (S-opsin) två månader efter transplantationen. Mottagarens näthinnelameller identifierades genom DAPI-färgning (blå). Näthinnetransplantat identifierades av EGFP-reporter (grön). Den icke-transplanterade näthinnan hos möss uppvisade allvarlig ONL-degeneration med glesa kvarvarande tappfotoreceptorer (Rec+). Ingen EGFP-signal detekterades i icke-transplanterade Rd1/ NS-näthinnor. Förstorade bilder presenterades på de två högra panelerna. Förkortningar: RGC: retinalt gangliecellager; INL: inre kärnskikt. ONL: yttre kärnskiktet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Detta protokoll presenterar ett transpupillär synstyrt transskleralt tillvägagångssätt för att säkert och exakt leverera subretinala cellulära transplantat, med en låg frekvens av kirurgiska komplikationer, i musmottagare med eller utan retinal degeneration.

Transpupillstyrd transskleral transplantation av subretinala transplantat i en musmodell för näthinnedegeneration

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Det övergripande målet med denna studie är att utveckla en transskleral transplantationsplattform med direkt transpupillär vägledning för att underlätta subretinal leverans av celler i musmottagare. Alla djurförsök utfördes enligt National Institute of Health Guide. Vårt uttalande om användning av djur och godkänt av Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee.Adoptivt EGFP-möss ålder vid postnatal dag 3-6 användes som donatorer av retinala cellsuspensioner. OPN1LW-EGFP/NRL-möss, ålder vid postnatal dag 3 antogs som näthinnearkdonatorer. Vuxna retinal degeneration Rd1/NS-möss med immunbrist användes som mottagare.Avliva donatormöss med överdosering av koldioxid. För att isolera mössens ögonglober, öppna försiktigt valparnas ögonlock med en mikrosax och exponera ögongloben. Linda in synnerven och dra ut ögongloben med en slät pincett.När ögongloberna är isolerade, skär ett hål i mitten av hornhinnan med en 25-gauge nål. Skär hornhinnan på mitten genom hålet. Och förstora snittet till sclera och RPE.Ta sedan bort sclera och RPE. Använd sedan en mikrotandad pincett för att försiktigt ta bort linsen och glaskroppen för att isolera den neurala näthinnan. För att samla upp donatorns näthinnesuspension, inkubera den neurala näthinnan i Papain-lösning vid 37 grader Celsius i 20 till 30 minuter tills inga cellklumpar kan detekteras.Samla in de enskilda cellerna enligt tillverkarens instruktioner för Papair-satsen. För att förbereda näthinnearket, lägg den isolerade näthinnan i en petriskål med PBS. Klipp sedan försiktigt den neurala näthinnan i flera näthinneark med en mikrosax.Bedöva mottagarmöss med en intraperitoneal injektion av ketamin och xylazin. Se till att det anestesiplan som uppnås är det kirurgiska planet där djuret förlorar blink- och smärtreflexer, men andning och andning förblir regelbunden. Bedöm anestesidjupet genom att nypa ihop svansen eller dra tillbaka pedalen.Kontrollera anestesidjupet igen under det operativa ingreppet. Förvara mössen på det förvärmda operationsbordet för att undvika hypotermi. Vidga de mottagna pupillerna med ögondroppar med tropicamid fem minuter före operationen.En väl vidgad pupill kan underlätta transpupillvisualisering under operationsmikroskopet. Applicera en droppe Proparacainehydroklorid på mössens öga för smärtlindring. Desinficera musögat och omgivande ögonvävnader med jod.Rengör sedan ögat med steril PBS. Penetrera den perifera tunneln in i den inre kammaren för att minska det intraokulära trycket. Lägg sedan en droppe natriumhyaluronat och ett glasglas ovanpå hornhinnan.Transpupillvisualisering av musfundus finns nu tillgänglig under det kirurgiska omfånget. Exponera injektionsplatsen genom att trycka ögonväggen mot mitten av den transpupilliska synen med tandad pincett. Penetrera sedan delvis sclera med en mikroinjektionsnål, vänd 90 grader mot ögonväggen.De ytliga näthinnekärlen kan fungera som en anatomisk referens för att lokalisera nålen i det subretinala utrymmet. Injicera sedan näthinnetransplantaten. De förladdade små bubblorna i sprutan kan underlätta validering av donatorcellernas subretinala placering.Om hornhinnan blir grumlig, håll nålen i det subretinala utrymmet tills hornhinnan blir genomskinlig för att normalisera det intraokulära trycket. Ta tag i kanten på injektionshålet och dra snabbt ut nålen. Kriteriet för framgångsrik leverans av cellsuspension är en konstant bleb i det subretinala utrymmet.En framgångsrik leverans av näthinneark, övertygas av ett synligt vitt ark. Håll transplanterade möss på en förvärmd ren återhämtningsbur och övervaka dem noggrant för eventuella nödtecken. Om detta inträffar, lägg en droppe topikal proparakainhydroklorid på det kirurgiska ögat i två, tre gånger.Ta tillbaka mössen till buren när mössen är helt pigga och rörliga. Placera ett litet antal matpellets i gelkoppen på golvet i buren. Om mössen har svårt att nå matbehållaren.Två månader efter transplantationen utfördes multimodal konfokal skanningslaseroftalmoskopi för att kontrollera tillståndet hos näthinnetransplantat sett vivo. Optisk koherenstomografi med spektraldomän visade att näthinnetransplantat överlevde i det subretinala utrymmet och rekonstituerar det yttre kärnskiktet hos alla mottagarmöss. Infraröd avbildning påvisade ingen uppenbar grå starr hos alla transplanterade möss.Andra kirurgiska komplikationer, inklusive blödningar, upptäcktes dåligt hos transplanterade möss med flerfärgad reflektansavbildning. Histologisk färgning visade rikligt med tappfotoreceptorer som uttryckte OPN1LW:EGFP och S-opsin i transplanterade näthinneark. På samma sätt visade transplantation av retinala cellsuspensioner en stor andel återhämtade positiva fotoreceptorer in vivo, inklusive många mogna EGFP-positiva stavar.De icke-transplanterade mössen uppvisade allvarlig degeneration av det yttre kärnskiktet med glesa kvarvarande tappfotoreceptorer som uttryckte återhämtning. Ingen EGP-signal detekterades dock hos icke-transplanterade möss. Denna studie ger en transskleral kirurgisk plattform med direkt transpupillär synvägledning för subretinal transplantation hos musmottagare.Denna plattform möjliggör exakt leverans av kända doser av celler. Det är relativt lätt att lära sig och underlätta subretinal tillförsel utöver intraretinala eller intravitreala injektioner för olika typer av terapeutiska medel, inklusive genterapi.

Without Section

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementera Dynamic Clamp med Synaptic och artificiella konduktanser i Mus Retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin Digest protokollet för att analysera den Retinal kärlsystemet av en musmodell

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Limbal Approach-subretinal Injektion av virala vektorer för genterapi hos möss retinal pigmentepitel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Utveckling av ett raffinerat protokoll för Trans-skleral Subretinal Transplantation av mänskliga Retinal Pigment epitelceller i råtta ögon

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

MÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Müller Glia cellaktivering i en Laser-inducerad Retinal Degeneration och Regeneration modell i zebrafiskar

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Partiell synnerven Transection råttor: en förebild som upprättats med en ny operativ metod att bedöma sekundära Degeneration av retinala ganglionceller

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...