Name: transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Bu çalışma aşağıdaki fonlarla finanse edilmiştir: NEI R01EY033103 (MSS), Körlükle Mücadele Vakfı (MSS), Shulsky Vakfı (MSS), Joseph Albert Hekimian Fonu (MSS), Juliette RP Vizyon Vakfı (YVL), Körlüğü Önleme Araştırmaları (Johns Hopkins Üniversitesi'ndeki Wilmer Göz Enstitüsü'ne ve Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Cullen Göz Enstitüsü'ne sınırsız hibe). Dr. Malia Edwards'a (Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi) mikroskop konusunda eğitim verdiği için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi (NIH Yayınları No. 8023, 1978'de revize edilmiştir) ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin ARVO Beyanı'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedürler Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay M021M459).
1. Hayvanlar
<ol><li>Rho::EGFP farelerini (P3-P6 yaşlı) retina hücresi süspansiyonlarının donörleri olarak kullanın. NOT: Bu tür, Baylor Tıp Fakültesi'nden Dr. T. Wensel'in nazik bir hediyesiydi.</li>
	<li>OPN1LW-EGFP/NRL-/- fareleri14 (P3 yaşlı) retina yapraklarının donörü olarak kullanın.</li>
	<li>Alıcı olarak immün yetmezliği (her iki cinsiyet) olan yetişkin retina dejenerasyonu Rd1 / NS farelerini kullanın.</li>
	<li>Tüm fareleri, gerektiğinde suya ve yiyeceğe erişimi olan 12:12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü altında kafeslerde barındırın.</li>
</ol>2. Nöral retinayı toplayın (Şekil 1)
NOT: Aşağıdaki tüm adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Araştırma araçları ve ürünlerinin tedarikçi bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.
<ol><li>Donör farelerin hazırlanması: Donör farelere aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın ve servikal çıkık ile ötenaziyi doğrulayın.</li>
	<li>Farelerin gözbebeklerini izole edin. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.<ol><li>Göz küresini ortaya çıkarmak için mikro makas kullanarak yavruların göz kapaklarını dikkatlice açın.</li>
		<li>Optik siniri tutmak için yumuşak forseps kullanın ve göz küresini bir çift forseps ile dışarı çekin.</li>
	</ol></li>
	<li>Nöral retinayı izole edin NOT: Bu adım diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.<ol><li>25 G steril iğne kullanarak korneanın ortasında bir delik açın.</li>
		<li>Korneayı delikten ikiye bölün ve kesiyi sklera ve RPE'ye doğru genişletin, ardından sklera ve RPE'yi çıkarın.</li>
		<li>Nöral retinayı izole etmek için lensi ve vitreusu nazikçe çıkarmak için mikro dişli forseps kullanın.</li>
		<li>Gerektiğinde donör retina süspansiyonunu hazırlamak için bölüm 3 veya donör retina tabakasını hazırlamak için bölüm 4 ile devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Donör retina süspansiyonunu hazırlayın (Şekil 1)
<ol><li>Nöral retinayı Papain solüsyonunda 37 ° C'de 20-30 dakika boyunca hücre kümeleri tespit edilmeyene kadar inkübe edin. NOT: Hücre karışımını her 10 dakikada bir 15 kez nazikçe pipetleyin.</li>
	<li>Tek hücreleri toplamak için üreticinin Papain Ayrışma Kiti talimatlarını izleyin.</li>
</ol>4. Donör retina tabakalarını hazırlayın (Şekil 1)
NOT: Bu adım bölüm 2'yi takip eder ve diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.
<ol><li>İzole edilmiş nöral retina kabını, önceden soğutulmuş steril PBS ile 35 mm'lik bir Petri kabına koyun.</li>
	<li>Nöral retina kabını birden fazla retina tabakasına (yaklaşık 1 mm x 2 mm) kesmek için mikro makas kullanın.</li>
</ol>5. Alıcı fareleri hazırlayın
<ol><li>Alıcı fareleri intraperitoneal ketamin (100 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (20 mg/kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile uyuşturun.</li>
	<li>Göz kırpma ve ağrı reflekslerinin kaybını, düzenli nefes almayı ve solunumu sağlayarak cerrahi anestezi düzlemini onaylayın.</li>
	<li>Anestezi derinliğini, kuyruk sıkışması veya pedal reflekslerinin geri çekilmesine yanıt vermeyerek değerlendirin.</li>
	<li>Ameliyat prosedürü sırasında her zaman anestezik derinliği tekrar kontrol edin ve hayvan ağrıya yanıt veriyorsa anestezik derinliği ayarlayın. Hipotermiyi önlemek için fareleri önceden ısıtılmış ameliyat masasında tutun.</li>
	<li>Ameliyattan 5 dakika önce alıcı göz bebeklerini %1 (ağırlıkça/hacim) tropikamid göz damlası ile genişletin. İyi genişlemiş bir göz bebeği, ameliyat mikroskobu altında transpupiller görselleştirmeyi kolaylaştırabilir.</li>
	<li>Çalışan fare gözünü ve çevresindeki oküler dokuları povidon-iyot ile dezenfekte edin, sterilize edilmiş PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Analjezi için fare gözüne% 0.5 Proparakain hidroklorür uygulayın.</li>
</ol>6. Retina greftlerinin subretinal transplantasyonu (Şekil 2)
NOT: Aşağıdaki adımların tümü aseptik koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Cerrahi aletler otoklavlandı (alet uçlarını korumak için alet tepsileri kullanın ve lümene sıkışmalarını önlemek için pistonu mikro şırıngalardan çıkarın). Araştırma araçları ve ürünlerinin tedarikçi bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.
<ol><li>Ön kamara parasentezi: Nakil sırasında göz içi basıncının (GİB) yükselmesini önlemek için sulu hümörün pasif olarak dışarı çıkmasına izin vermek için periferik korneaya bir insülin iğnesi ile ön kamaraya nüfuz edin. NOT: Başarılı bir parasentez, kornea deliğinden sulu hümörün dışarı akması ile gösterilir.</li>
	<li>Cerrahi kapsam altında fundusun transpupiller görselleştirmesini sağlamak için korneanın üzerine bir damla sodyum hyaluronat ve bir cam lamel (5 mm çapında) koyun.</li>
	<li>Deneyin gerektirdiği şekilde üst veya alt göz duvarına transpupiller görme merkezine doğru bastırarak enjeksiyon lokusunu (1 mm kornea sonrası limbus) ortaya çıkarmak için dişli forseps kullanın.</li>
	<li>Skleraya dik olarak nüfuz etmek için bir mikroenjeksiyon iğnesi kullanın.</li>
	<li>Sklera-koroid-RPE kompleksinin subretinal boşluğa tam penetrasyonuna izin vermek için iğne yönünü teğetsel olarak dikkatlice döndürün.</li>
	<li>Terminal enjeksiyon lokusuna erişmek için iğneyi teğet olarak sokun. NOT: Transpupiller görme rehberliği ile iğne eğiminin tam konumunu doğrulayın. Subretinal boşlukta doğru iğne konumlandırması için yüzeysel retina damarlarını anatomik bir referans olarak kullanın.</li>
	<li>Retina greftleri enjekte edin NOT: Şırıngaya önceden yüklenmiş küçük kabarcıkların varlığı, donör hücrelerin doğru subretinal konumunun doğrulanmasını kolaylaştırabilir. Subretinal enjeksiyondan kaynaklanan yüksek GİB, donör hücre reflü riskini artırır.<ol><li>Kornea bulanıklaşırsa24,25, yüksek GİB'nin bir göstergesi, kornea temizlenene kadar iğneyi en az 3 dakika subretinal boşlukta tutun, bu da GİB'nin yeterince azaldığının bir göstergesidir. NOT: Nadir durumlarda, GİB'nin normale dönmesi daha uzun sürebilir ve 8-10 dakika sürse bile korneanın netliği geri gelene kadar iğnenin yerinde tutulması önerilir. Retina yapılarına zarar vermemek için cerrahi mikroskop altında gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjeksiyon deliği kenarını mikro dişli forseps ile kavrayın ve iğneyi hızla geri çekin. NOT: Bir retina hücresi süspansiyonunun ve tabakasının başarılı bir şekilde subretinal iletimi için kriterler, sırasıyla subretinal boşlukta sabit bir bleb ve görünür bir beyaz tabakadır.</li>
	<li>Gözün ameliyat bölgesini suni gözyaşı ile temizleyin ve gerekirse merhem sürün.</li>
	<li>Ameliyat sonrası uygulama<ol><li>Nakledilen fareleri önceden ısıtılmış (37 °C) temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin ve sıkıntı olup olmadığını dikkatlice izleyin.</li>
		<li>Sıkıntı meydana gelirse cerrahi göze 2-3 kez topikal %0.5 Proparakain Hidroklorür damlatın.</li>
		<li>Fareler tamamen uyanık ve hareketli hale geldikten sonra fareleri ev kafesine geri koyun. Fareler yiyecek haznesine ulaşmakta sorun yaşıyorsa, kafese az sayıda yiyecek peleti ve bir jel kabı yerleştirin. NOT: Katarakt oluşumunu önlemek için anestezinin etkisi geçene kadar göz yüzeyini nemli tutun.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Multimodal konfokal taramalı lazer oftalmoskopi (cSLO) görüntüleme
<ol><li>Transplantasyondan iki ay sonra, görüntüleme için intraperitoneal ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (20 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile alıcı Rd1 / NS farelerini (n = 5) uyuşturun.</li>
	<li>Öğrencileri %1 (ağırlıkça/hacimce) tropikamid göz damlası ile genişletin.</li>
	<li>Konfokal taramalı lazer oftalmoskop cSLO sistemini kullanarak standart 55° multimodal görüntüleme gerçekleştirin22.</li>
	<li>30 kare ART ortalaması kullanarak MR ve SD-OCT görüntüleri elde edin.</li>
</ol>8. Histolojik boyama
<ol><li>Daha önce bildirildiği gibi nakledilen Rd1 / NS fare gözlerinin donmuş slaytlarını hazırlayın 14.</li>
	<li>PBS'de %5 keçi serumu ve %1 Triton X100 karışımı kullanarak nakledilen retinanın donmuş slaytlarını bloke edin ve nüfuz edin.</li>
	<li>Numuneleri gece boyunca 4 ° C'de primer antikorlarla inkübe edin ve PBS'de durulayın (5 dakika, 3x). Birincil antikorlar arasında keçi anti-GFP-FITC (1:200), tavşan anti-recoverin (1:1000) ve tavşan anti-S-opsin (1:500) bulunur.</li>
	<li>Numuneleri ikincil antikor (keçi anti-tavşanı Cy3, 1:500) ile inkübe edin ve DAPI ile karşı boyandı. NOT: Primer ve sekonder antikor tedarikçileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced,+dry+age-related+macular+degeneration.">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Sci Transl Med. 10 (435), (2018).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration.">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+rescues+retinal+degeneration+in+rodents+and+pigs.">Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs.</a> Sci Transl Med. 11 (475), (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation.">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).</li><li>Shirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+two+primate+models+of+retinal+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).</li><li>Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+full-thickness+retina+in+the+rhodopsin+transgenic+pig.">Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig.</a> Retina. 24 (1), 98-109 (2004).</li><li>Klassen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+from+the+porcine+neural+retina+express+photoreceptor+markers+after+transplantation+to+the+subretinal+space+of+allorecipients.">Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients.</a> Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transplantation+of+human+fetal+neuroretinal+cells+in+advanced+retinitis+pigmentosa+patients:+results+of+a+long-term+safety+study.">The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study.</a> Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+retinal+transplantation.">Human neural retinal transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+of+human+retinal+progenitor+cell+transplantation+in+retinitis+pigmentosa+patients.">Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209 (2017).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+allogeneic+transplantation+of+a+novel+transgenic+cone-rich+donor+mouse+line.">Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line.</a> Exp Eye Res. 210, 108715 (2021).</li><li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors.">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).</li><li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+nanotubes+mediate+the+in+vivo+exchange+of+intracellular+material.">Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material.</a> EMBO J. 40 (22), 107264 (2021).</li><li>Zou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-derived+C-Kit(+)/SSEA4(-)+human+retinal+progenitor+cells+promote+a+protective+retinal+microenvironment+during+transplantation+in+rodents.">Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents.</a> Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).</li><li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+photoreceptor+precursors+transfer+proteins+to+host+photoreceptors+by+a+mechanism+of+cytoplasmic+fusion.">Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion.</a> Nat Commun. 7, 13537 (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Nickerson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+delivery+and+electroporation+in+pigmented+and+nonpigmented+adult+mouse+eyes.">Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes.</a> Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+evaluation+of+subretinal+injection+of+trypan+blue+in+rats.">Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifiable+in+vivo+imaging+biomarkers+of+retinal+regeneration+by+photoreceptor+cell+transplantation.">Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5 (2020).</li><li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+analysis+of+xenotransplanted+human+retinal+organoids+defines+two+migratory+cell+populations+of+nonretinal+origin.">Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin.</a> Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).</li><li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+corneal+endothelial+dysfunction+to+facilitate+development+of+novel+therapies.">Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies.</a> Ann Transl Med. 9 (15), 1271 (2021).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ocular+hypertension+disrupts+barrier+integrity+and+pump+function+in+rat+corneal+endothelial+cells.">Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 6951 (2017).</li><li>Chao, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+cells+into+the+subretinal+space+of+a+non-human+primate.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate.</a> Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4 (2017).</li><li>Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+the+subretinal+space+of+the+cat+eye.">transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye.</a> Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+refined+protocol+for+trans-scleral+subretinal+transplantation+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+into+rat+eyes.">Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes.</a> J Vis Exp. (126), e55220 (2017).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), e4286 (2012).</li><li>Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+external+and+internal+approaches+for+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium.">Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+surgical+procedure+for+rhesus+epiretinal+scaffold+implantation+with+HiPSC-derived+retinal+progenitors.">Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors.</a> Stem Cells Int. 2018, 9437041 (2018).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+scaffolds+facilitate+epiretinal+transplantation+of+hiPSC-Derived+retinal+neurons+in+nonhuman+primates.">Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates.</a> Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).</li></ol>

MSS, Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals ve Acucela'ya ücretli danışmanlık yapmıştır. MSS, Bayer'den sponsorlu araştırma desteği almaktadır. Bu düzenlemeler, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından çıkar çatışması politikalarına uygun olarak gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. KVL, Colorado Üniversitesi'ndeki patent başvurularında mucit olarak adlandırılmıştır. MSS ve YVL, Johns Hopkins Üniversitesi'ndeki patent başvurularında mucit olarak adlandırılmıştır.

Farelerde subretinal transplantasyon, fare gözlerinin küçük boyutu nedeniyle teknik olarak zordur. Bu çalışmada, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için basit ve tekrarlanabilir bir platform geliştirdik. Platform, donör canlılığı korumasında tutarlılık, başarılı subretinal doğum sağlar ve düşük komplikasyon oranı sağlar.
Burada tasvir edilen subretinal transplantasyon tekniği, enjeksiyon iğnesinin göz duvarının dış katmanlarına (sklera-koroid-RPE kompleksi) nüfuz ettiği trans-skleral yola dayalı olarak geliştirilmiştir. Trans-korneal19,20 ve trans-vitreus21,26,27 yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, trans-skleral yaklaşım, ön segment yapılarına ve nöral retinaya nüfuz etmeden doğrudan subretinal boşluğa girer, böylece zararsız bir nakil sağlar ve delici delikten donör hücre reflüsü riskini azaltır. Transskleral yaklaşımın bir zorluğu, iğne ucunun terminal doğum bölgesine gelmeden önce subretinal boşluk boyunca yayılmasını sağlarken, bitişik RPE ve koroid katmanlarının potansiyel rahatsızlığını önlemektir. Doğrudan görsel rehberlik olmadan geleneksel bir transskleral yaklaşımla28,29 bu hedeflere ulaşmak zordur. Bu çalışmada, fare modellerinde subretinal transplantasyonu kolaylaştırmak için cerrahi mikroskop ve retinanın dış aydınlatmasını kullanarak transpupiller görme kılavuzluğunda bir platform geliştirdik. Platform, alıcı fundusun cerrahi mikroskop altında gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayarak operatörün cerrahi süreci ve alıcıların retina durumunu izlemesine olanak tanır. Örneğin, sklera-koroid-RPE kompleksinin başarılı bir şekilde penetrasyonu, transpupiller görselleştirme yoluyla iğne ucunun nispeten parlak bir yansıması ile basitçe doğrulanabilir. Daha da önemlisi, transpupiller görselleştirme ile yönlendirildiğinde, operatör, iğne ile alıcı retinadaki anatomik yapılar (örneğin, retina damarları ve optik sinir başı) arasındaki göreceli konuma göre enjeksiyon açısını ve derinliğini doğru bir şekilde modüle edebilir. Ayrıca, bu tekniği kullanarak materyallerin doğru bir şekilde uygulanması, RPE, koroid travması ve diğer cerrahi komplikasyonları en aza indirebilir. Gerçekten de, transpupiller görselleştirme yardımıyla retina kan damarlarına yakın manevralardan kaçınarak kanamaların en aza indirilebileceğini bulduk.
Donör hücrelerin reflüsü, enjeksiyon sonrası cerrahi başarısızlığın önemli bir nedenidir29,30. Donör hücre reflüsünü teşvik etmede rol oynayan birçok faktör vardır. Enjekte edilen donör hücre karışımlarının neden olduğu alıcı gözlerin yüksek göz içi basıncı (GİB), hücrelerin göz dışına geri akışını destekleyen önemli bir faktördür. Protokolümüz, ameliyatın başlangıcında ön kamara penetrasyonu ile alıcıların GİB'sini azaltır ve vitreus iğnesini vitreus boşluğundan çekmeden önce GİB'nin sulu sıvı çıkışı ile kendiliğinden düşmesini sağlar. İkinci bir faktör, alıcıların gözlerindeki kapatılmamış enjeksiyon tünelidir. Greft reflüsünün enjeksiyon tünelinden geri dönmesini önlemek için, göz duvarına nüfuz ederken kendinden sızdırmaz bir tünel oluşturmak için küçük boyutlu bir mikro enjeksiyon iğnesi (34G) ve iğneyi çekerken dış tünel açıklığının kenarlarını tutmak için dişli mikro forseps kullanıyoruz. Konvansiyonel transplantasyonda, reflü greftler hızlı bir şekilde oluşabildikleri veya hızla dağılabildikleri için zor tespit edilirler. Sodyum hyaluronat, lamel uygulandığında, sklerotomi bölgesi de dahil olmak üzere limbus ve skleranın çoğunu kaplamak için neredeyse her zaman korneadan kayar. Hücre enjeksiyonunu takiben, sklerotomi bölgesindeki sodyum hiyalüronat, varsa geri akışlı içeriklerin toplu akışını yavaşlatmaya ve cerrahi mikroskop altında görsel olarak tespit edilebilir hale getirmeye yardımcı olabilir. Ayrıca, reflü yokluğu, optik koherens tomografinin (OCT) mevcut olmadığı laboratuvarlar için yararlı olabilecek protokolümüzü kullanarak hücre süspansiyonları için subretinal blebin sabitliğini ve retina tabakasının göz içi konumunu izleyerek de doğrulanabilir.
Nakledilen retina tabakalarında önemli sayıda fotoreseptör hücresi hayatta kalırken, fark edilebilir bir hücresel oryantasyon veya tabaka oryantasyonu tespit edilemedi. 3D retina tabakalarının büyük hayvanlara verilmesi 26,31,32 olarak tespit edilmiş olmasına rağmen, farelerde subretinal boşluk, intraoperatif retinal görüntüleme yeteneğinin eksikliği ile birleştiğinde, intraoperatif olarak ve hemen postoperatif dönemde tabaka oryantasyonunun korunmasını sağlamayı çok zorlaştırır.
Fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliğine sahip bir transskleral cerrahi platform tanımladık. Bu platform, yüksek enjeksiyon doğruluğu ve düşük cerrahi komplikasyon oranı sağlar. Bu platform, bilinen hücre dozlarının kesin olarak verilmesini sağlar, öğrenmesi nispeten kolaydır ve gen terapisi de dahil olmak üzere farklı terapötik ajan türleri için intra-retinal veya intravitreal enjeksiyonlara ek olarak subretinal iletimi kolaylaştırır.

Fotoreseptör ve retina pigmentli epitelyal (RPE) hücrelerin transplantasyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), Stargardt hastalığı ve retinitis pigmentosa (RP) gibi retinal dejeneratif hastalıklar için potansiyel tedavi sağlar1,2,3,4,5,6,7. Dejenere retinadaki hastalıklı fotoreseptörleri ve RPE hücrelerini yenilemek veya değiştirmek için, konakçı fotoreseptörlerin ve RPE hücrelerinin laminer anatomisi göz önüne alındığında, subretinal boşluk özellikle bir transplantasyon hedefi olarak çok uygundur. RPE hücrelerinin retina altı transplantasyonunun cerrahi prosedürleri büyük hayvanlarda 8,9,10 ve klinik çalışmalarda11,12,13 iyi kurulmuş olsa da, fotoreseptör transplantasyonu araştırmalarının karşılaştığı zorluklar arasında transgenik büyük hayvan modellerinin azlığı ve diğer endişelerin yanı sıra nöronal transplantasyonda yer alan derinlemesine sinaptogenez mekanizmalarının sınırlı anlaşılması yer almaktadır. Çeşitli retinal dejenerasyon mutantlarına sahip genetiği değiştirilmiş fare modelleri, transplantasyon bağlamında moleküler mekanizmaları incelemek ve klinik öncesi aşamadaetkili hücre replasman tedavilerinin geliştirilmesini yönlendirmek için yararlı araçlar sağlar 14,15,16,17,18.
Büyük hayvanlarda (örneğin, domuz, maymun) nispeten büyük göz ve küçük kristal merceğin aksine, fare gözlerinin küçük boyutlu ve büyük kristal merceği, özellikle fiziksel alan kısıtlamalarının ve sınırlı doğrudan görselleştirmenin temel zorluklar olduğu subretinal transplantasyon için onları zor cerrahi hedefler haline getirir.
Mevcut yaklaşımlar, enjeksiyon yoluna göre üç ana tipte sınıflandırılabilir. İlk olarak, trans-korneal yaklaşım durumunda, iğne korneadan vitreus boşluğuna ve daha sonra subretinal boşluğageçirilir 19,20. Bu yöntem kullanılarak başarılı subretinal doğum sağlanabilir, ancak ön segment yapılarındaki (yani kornea, iris, lens) hasar, aşağı akışı ciddi şekilde engelleyebilecek büyük bir risktir in vivo analiz. İkincisi, trans-vitreus yaklaşımı durumunda, iğne vitreus boşluğuna pars plana ve daha sonra subretinal boşluğagirer 21. Bu yaklaşım insanlarda ve büyük hayvanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, lens vitreus boşluğunun daha büyük bir nispi hacmini kapladığı için kemirgenlerde potansiyel lens hasarı riski vardır. Özellikle, hem trans-korneal hem de trans-vitreus protokolleri, subretinal boşluğa ulaşmak için nöral retinanın penetrasyonunu gerektirir, bu da konakçı retinaya zarar verir ve penetrasyon deliğinden donör hücre reflü riskini artırır. Üçüncüsü, trans-skleral yaklaşım22,23 durumunda, iğne skleral-koroid-RPE kompleksinden geçer ve doğrudan subretinal boşluğa girer. Bu yaklaşım, ön segment yapılarının ve vitreus boşluğunun potansiyel travmasını azaltır. Bununla birlikte, konakçı fundusun doğrudan görüntülenmesi olmadan, trans-retinal ponksiyonlar, RPE dekolmanı ve koroid kanamasının neden olduğu cerrahi başarısızlıklar yaygın olarak tespit edilir.
Burada, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliğine sahip bir trans-skleral cerrahi platform geliştirdik. Transplantasyondan önce donör retina tabakalarının ve hücre süspansiyonlarının canlılığının doğrulanması yapıldı. Donör hücrelerin bir retina dejenerasyonu fare modelinin subretinal boşluğuna başarılı bir şekilde verildiği doğrulandı. Sadece nadir görülen cerrahi komplikasyonlar tespit edildi. Ek olarak, retina greftlerinde nakledilen fotoreseptörler hayatta kaldı ve transplantasyondan iki ay sonra "yetişkin" çubuklara ve konilere ileri olgunlaşma kanıtı gösterdi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial tears</td>
			<td>CareAll</td>
			<td>P31447-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (5mm in diameter)</td>
			<td>Deckglaser</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-GFP (FITC)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab6662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-rabbit Cy3&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>Easy Touch</td>
			<td>08496-3015-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone Zetamine</td>
			<td>AH2017J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead Viability Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissor</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro smooth forceps</td>
			<td>ASICO</td>
			<td>AE-4360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro toothed forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>555041FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (26G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7804-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection needle (34G)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>207434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain dissociation kit</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish (35 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB012920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine (10%)</td>
			<td>Betadine Solution</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride (0.5%)</td>
			<td>Keeler</td>
			<td>AX0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-recoverin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-S-opsin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab5407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hyaluronate</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Vision&#160;</td>
			<td>10-2400-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25-806 2PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile needle (25G)</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical materials/reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide ophthalmic solution</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>112-7192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transpupillary-guided trans-scleral transplantation of subretinal grafts in a retinal degeneration mouse model

Fotoreseptör hücrelerin ve retina pigment epitelyal (RPE) hücrelerinin transplantasyonu, retina dejenerasyonu hastalıkları için potansiyel bir tedavi sağlar. Terapötik donör hücrelerin fare alıcılarına subretinal transplantasyonu, fare gözünün küçük hacminin izin verdiği sınırlı cerrahi alan nedeniyle zordur. Fare alıcılarında ekzojen hücrelerin subretinal iletimini kolaylaştırmak için doğrudan transpupiller görme kılavuzluğuna sahip bir transskleral cerrahi transplantasyon platformu geliştirdik. Platform, çubuk açısından zengin Rho::EGFP farelerinden ve koni açısından zengin OPN1LW-EGFP'den toplanan retina hücre süspansiyonları ve üç boyutlu retina tabakaları kullanılarak test edildi ; NRL-/- fareler, sırasıyla. Canlı/ölü testi, her iki donör hücre formu için düşük hücre mortalitesi gösterdi. Retina greftleri, multimodal konfokal taramalı lazer oftalmoskop (cSLO) görüntüleme ile tespit edilen minimum cerrahi komplikasyonla, bir fare retina dejenerasyonu modeli olan Rd1/NS'nin subretinal boşluğuna başarıyla verildi. Transplantasyondan iki ay sonra, histolojik boyama, retinal greftlerin subretinal boşlukta 'yetişkin' çubuklara ve konilere (sırasıyla sağlam Rho::EGFP, S-opsin ve OPN1LW:EGFP ekspresyonu ile) ileri olgunlaştığına dair kanıtlar gösterdi. Burada, fare alıcılarında düşük komplikasyon oranıyla son derece hassas subretinal doğumu mümkün kılabilen cerrahi bir platform sunuyoruz. Bu teknik, beceri edinmede hassasiyet ve göreceli kolaylık sunar. Ayrıca, teknik sadece subretinal hücre nakli çalışmaları için değil, aynı zamanda gen terapileri de dahil olmak üzere diğer göz içi terapötik çalışmalar için de kullanılabilir.

Retina greftleri başarılı bir şekilde subretinal boşluğa verilir ve in vivo olarak hayatta kalır. Subretinal transplantasyon platformumuzun performansı, neredeyse tam dış nükleer tabaka (ONL) dejenerasyonu nedeniyle rezidüel retinaları ciddi şekilde inceldiğinde 6-8 haftalık Rd1/NS alıcı farelerde değerlendirildi. Retinanın kırılganlığı, koni fotoreseptörlerinin azlığı ve tabaka donörlerine kıyasla süspansiyondaki hücrelerin nispeten zayıf canlılığı göz önüne alındığında, koni açısından zengin fareler (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14, donör retina tabakalarının kaynağı olarak ve hücre süspansiyonları için donör olarak çubuktan zengin fareler (Rho::EGFP) kullanıldı. Koniden zengin retina tabakası ve çubuktan zengin hücre süspansiyonları, enjeksiyondan hemen sonra transpupiller görselleştirme kullanılarak görülen subretinal bleb ve beyaz tabaka ile doğrulandığı gibi, cerrahi platformumuz kullanılarak tüm alıcı farelerin subretinal boşluğuna başarıyla iletildi. Transplantasyondan iki ay sonra, retinal greftlerin durumlarını in vivo olarak izlemek için multimodal cSLO görüntüleme yapıldı. Kesitsel OCT taraması, retina greftlerinin subretinal boşlukta hayatta kaldığını ve tüm alıcı farelerde ONL'yi yeniden oluşturduğunu gösterdi (Şekil 3A). Kızılötesi görüntüleme, nakledilen tüm gözlerde belirgin katarakt tespit etmedi (Şekil 3B). Transplantasyondan iki ay sonra çok renkli reflektans görüntüleme ile transplante edilen retinada (n = 1/10 göz) kanama dahil diğer cerrahi komplikasyonlar nadiren tespit edildi (Şekil 3C). Retina greftlerinde fotoreseptörlerin sağkalımını ve olgunlaşma derecesini daha fazla değerlendirmek için histolojik boyama yaptık. Nakledilen retina tabakalarında OPN1LW:EGFP ve S-opsin eksprese eden bol miktarda koni fotoreseptörleri gözlendi. Benzer şekilde, nakledilen retina hücresi süspansiyonları, çok sayıda Rho::EGFP+ çubuğu dahil olmak üzere in vivo olarak büyük oranda Rec+ fotoreseptörleri gösterdi (Şekil 3D). Nakledilmeyen kontrol fareleri, seyrek rezidüel koni fotoreseptörleri (Rec +) ile ciddi ONL dejenerasyonu gösterdi. Transplante edilmeyen Rd1/NS retinada EGFP sinyali saptanmadı (Şekil 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg"> Şekil 1: Toplayıcı donör retina tabakası ve hücre süspansiyonlarının şeması. Donör Rho::EGFP farelerinden retina hücresi süspansiyonlarının ve tabakalarının toplanmasının temel adımlarını gösteren şemalar. Parlak alan ve floresan görüntüleme, ayrışmış hücrelerin temsili görüntülerini ve Rho::EGFP farelerinden izole edilmiş disseke bir tabakayı gösterdi. Sarı noktalı çizgi: insizyonel kenar boşluğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg"> Şekil 2: Rd1/NS farelerinde retina tabakalarının subretinal transplantasyonu ve hücre süspansiyonu prosedürleri. (A) Alıcı farelerin hazırlanmasının şematik görüntüleri. (B) Retina hücresi süspansiyonlarının ve tabakalarının subretinal transplantasyonunu gösteren temel cerrahi prosedürler ve ilgili diyagramlar. Cerrahi adımlar şunları içerir: 1. ön kamaraya nüfuz edin; 2. Sodyum hiyalüronatı kornea üzerine bırakın, ardından transpupiller görselleştirmeyi kolaylaştırmak için lamel sodyum hiyalüronatın üzerine monte edin; 3. göz duvarının dış katmanlarına nüfuz edin (sklera-koroid-RPE kompleksi). İğnenin penetrasyon açıları resmin sağ üst panelindedir; 4. enjeksiyon iğnesini yerleştirin; 5. Greftleri enjekte edin. Temsili görüntüler, sırasıyla iki ayrı alıcıda retina hücresi süspansiyonlarının ve tabakasının başarılı bir şekilde verildiğini göstermektedir. Yıldız: optik sinir başı; Kırmızı ok uçları: retina kan damarı; Beyaz ok ucu: delinmiş iğne ucu; Beyaz oklar: aşılı retina süspansiyonları veya tabaka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg"> Şekil 3: Retina greftlerinin subretinal boşluğa başarılı bir şekilde verilmesi ve in vivo olarak hayatta kalması. (A) Temsili SD-OCT görüntüleri, sırasıyla iki ayrı Rd1 / NS faresinde nakledilen retina tabakalarının ve hücre süspansiyonlarının subretinal dağılımını gösterdi. Transplante edilmeyen Rd1/NS fareler kontrol olarak toplandı. İlgi Bölgesi (ROI), kızılötesi (IR) fundus görüntülerinde sarı noktalı kutularla gösterilir. İç retina, retina ganglion hücre tabakası (RGC), iç pleksiform tabaka (IPL) ve iç nükleer tabaka (INL) laminaları olarak adlandırılır. (B) Nakledilen bir Rd1 / NS faresinin temsili kızılötesi (IR) görüntüsü, genişlemiş göz bebeğinden katarakt göstermedi. (C) Nakledilen ve nakledilmeyen Rd1 / NS gözlerinin temsili çok renkli yansıtma (MR) görüntüleri. Nakledilen gözlerde kanama da dahil olmak üzere belirgin bir cerrahi komplikasyon görülmedi. (D) Nakledilen (tabaka ve süspansiyon) ve nakledilmeyen (kontrol) Rd1 / NS farelerinin immünohistokimya (IHC) boyama. Veriler, transplantasyondan iki ay sonra fotoreseptörlerin (Rec), çubukların (Rho::EGFP), L/M konilerinin (OPN1LW:EGFP) ve S-konilerin (S-opsin) spesifik belirteçlerini eksprese eden çok sayıda aşılanmış fotoreseptör gösterdi. Alıcı retinal laminalar DAPI boyaması (mavi) ile tanımlandı. Retina greftleri EGFP raportörü (yeşil) tarafından tanımlandı. Nakledilmeyen farelerin retinası, seyrek rezidüel koni fotoreseptörleri (Rec+) ile şiddetli ONL dejenerasyonu gösterdi. Transplante edilmeyen Rd1/NS retinada EGFP sinyali saptanmadı. Sağdaki iki panelde büyütülmüş görüntüler sunuldu. Kısaltmalar: RGC: retinal ganglion hücre tabakası; INL: iç nükleer tabaka. ONL: dış nükleer katman. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model at JoVE.com

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Bu protokol, retina dejenerasyonu olan veya olmayan fare alıcılarında düşük cerrahi komplikasyon oranıyla subretinal hücresel greftleri güvenli ve hassas bir şekilde vermek için transpupiller görme kılavuzluğunda trans-skleral bir yaklaşım sunar.

Retinal Dejenerasyon Fare Modelinde Subretinal Greftlerin Transpupiller Kılavuzluğunda Transskleral Transplantasyonu

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Bu çalışmanın genel amacı, fare alıcılarında hücrelerin subretinal iletimini kolaylaştırmak için doğrudan transpupiller kılavuzlu bir trans-skleral transplantasyon platformu geliştirmektir. Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitüsü Rehberi'ne göre yapılmıştır. Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan ve hayvanların kullanımına ilişkin beyanımız.Doğum sonrası 3-6. günde EGFP yaşını benimseyen fareler, retina hücresi süspansiyonlarının donörleri olarak kullanıldı. OPN1LW-EGFP/NRL fareleri, doğum sonrası 3. günde retina tabakası donörü olarak kabul edildi. İmmün yetmezliği olan yetişkin retina dejenerasyonu Rd1 / NS fareleri alıcı olarak kullanıldı.Donör fareleri aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın. Farelerin gözbebeklerini izole etmek için, mikro bir makas kullanarak yavruların göz kapaklarını dikkatlice açın ve göz küresini ortaya çıkarın. Optik siniri sarın ve göz küresini düz forseps ile dışarı çekin.Gözbebekleri izole edildikten sonra, 25 gauge iğne kullanarak korneanın ortasında bir delik açın. Korneayı delikten ikiye bölün. Ve kesiyi sklera ve RPE'ye genişletin.Ardından sklera ve RPE'yi çıkarın. Ardından, nöral retinayı izole etmek için lensi ve vitreusu nazikçe çıkarmak için mikro dişli forseps kullanın. Donör retinal süspansiyonu toplamak için, nöral retinayı Papain solüsyonunda 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika boyunca hiçbir hücre kümesi tespit edilemene kadar inkübe edin.Papain kitinin üreticisinin talimatlarını izleyerek tek hücreleri toplayın. Retina tabakası hazırlamak için, izole retinayı PBS'li bir Petri kabına koyun. Daha sonra nöral retinayı bir mikro makasla nazikçe birden fazla retina tabakasına kesin.Alıcı fareleri intraperitoneal ketamin ve ksilazin enjeksiyonu ile uyuşturun. Anestezi düzleminin, hayvanın göz kırpma ve ağrı reflekslerini kaybettiği, ancak nefes alma ve solunumun düzenli kaldığı cerrahi düzlem olduğundan emin olun. Anestezi derinliğini kuyruk sıkışması veya pedal çekme refleksleri ile değerlendirin.Ameliyat prosedürü sırasında anestezi derinliğini tekrar kontrol edin. Hipotermiyi önlemek için fareleri önceden ısıtılmış ameliyat masasında tutun. Ameliyattan beş dakika önce alıcı göz bebeklerini tropikamid göz damlası ile genişletin.İyi genişlemiş bir göz bebeği, ameliyat mikroskobu altında transpupiller görselleştirmeyi kolaylaştırabilir. Analjezi için farelerin gözüne bir damla Proparakain hidroklorür koyun. Çalışan fare gözünü ve çevresindeki oküler dokuları iyot ile dezenfekte edin.Ardından gözü steril PBS ile temizleyin. Göz içi basıncını azaltmak için periferik tüneli iç odaya girin. Daha sonra, korneanın üzerine bir damla sodyum hyaluronat ve bir cam lamel koyun.Fare fundusunun transpupiller görselleştirmesi artık cerrahi kapsam altında mevcuttur. Dişli forseps ile göz duvarını transpupiller görüntünün merkezine doğru iterek enjeksiyon lokusunu ortaya çıkarın. Daha sonra skleraya bir mikroenjeksiyon iğnesi ile göz duvarına 90 derece bakacak şekilde kısmen nüfuz edin.Yüzeysel retina damarları, iğneyi subretinal boşlukta bulmak için anatomik bir referans görevi görebilir. Ardından retina greftlerini enjekte edin. Şırıngadaki önceden yüklenmiş küçük kabarcıklar, donör hücrelerin subretinal konumunun doğrulanmasını kolaylaştırabilir.Kornea bulanıklaşırsa, göz içi basıncını normalleştirmek için kornea saydam hale gelene kadar iğneyi subretinal boşlukta tutun. Enjeksiyon deliğinin kenarını kavrayın ve iğneyi hızla dışarı çekin. Hücre süspansiyonunun başarılı bir şekilde verilmesinin kriteri, subretinal boşlukta sabit bir kabarcıktır.Retina tabakasının başarılı bir şekilde teslim edilmesi, görünür bir beyaz tabaka ile ikna edilir. Nakledilen fareleri önceden ısıtılmış temiz bir kurtarma kafesinde tutun ve herhangi bir tehlike belirtisi olup olmadığını dikkatlice izleyin. Bu meydana gelirse, cerrahi göze iki, üç kez bir damla topikal proparakain hidroklorür koyun.Fareler tamamen uyanık ve hareketli hale geldikten sonra fareleri ev kafesine geri götürün. Kafesin zeminindeki jel kabına az sayıda yiyecek peleti yerleştirin. Fareler yiyecek haznesine ulaşmakta zorlanıyorsa.Nakilden iki ay sonra, in vivo görülen retina greftlerinin durumlarını kontrol etmek için multimodal konfokal taramalı lazer oftalmoskopi yapıldı. Spektral alan optik koherens tomografi, retina greftlerinin subretinal boşlukta hayatta kaldığını ve tüm alıcı farelerin dış nükleer tabakasını yeniden oluşturduğunu gösterdi. Kızılötesi görüntüleme, nakledilen tüm farelerde belirgin bir katarakt tespit etmedi.Kanama da dahil olmak üzere diğer cerrahi komplikasyonlar, nakledilen farelerde çok renkli yansıma görüntüleme ile kötü bir şekilde tespit edildi. Histolojik boyama, nakledilen retina tabakalarında OPN1LW:EGFP ve S-opsin eksprese eden bol miktarda koni fotoreseptörü gösterdi. Benzer şekilde, retina hücresi süspansiyonlarının nakli, çok sayıda olgun EGFP pozitif çubuk da dahil olmak üzere, in vivo olarak pozitif fotoreseptörlerin büyük bir kısmının geri kazanıldığını gösterdi.Nakledilmeyen fareler, iyileşmeyi ifade eden seyrek kalıntı koni fotoreseptörleri ile dış nükleer tabakanın ciddi dejenerasyonunu gösterdi. Bununla birlikte, nakli yapılmayan farelerde EGP sinyali tespit edilmedi. Bu çalışma, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliği ile trans-skleral cerrahi bir platform sağlar.Bu platform, bilinen hücre dozlarının hassas bir şekilde verilmesini sağlar. Gen terapisi de dahil olmak üzere farklı terapötik ajan türleri için intra-retinal veya intravitreal enjeksiyonlara ek olarak subretinal doğumu öğrenmek ve kolaylaştırmak nispeten kolaydır.

Without Section

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Tripsin Digest Protokolü Fare Modeli Retina damarları Analiz

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

MÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Kısmi optik sinir transeksiyon Sıçanlarda: ikincil dejenerasyonu retina Ganglion hücrelerinin değerlendirmek için yeni bir operatif yaklaşım ile kurulan bir Model

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...