Name: Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-01-19T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test at JoVE.com

Somos gratos ao Wadsworth Center do Departamento de Saúde do Estado de Nova York por apoiar este projeto.

O seguinte protocolo foi aprovado para o uso ético de amostras humanas pelo New York State Department of Health Wadsworth Center para desenvolvimento de ensaios, número de aprovação do protocolo #03-019.
1. Segurança
<ol><li>Use equipamentos de proteção individual (EPIs), no mínimo proteção ocular (óculos ou face shield), máscara cirúrgica e luvas sem látex.</li>
	<li>Certifique-se de que o pessoal está vacinado contra a raiva e que um título de ≥0,5 UI/mL ...

Quick and Early Detection of Rabies Antibodies to Evaluate the Immune Response in a Patient

<ol>
	<li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1.">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , 232-245 (2018).</li><li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+rabies+serology:+defining+context+of+interpretation.">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516 (2021).</li><li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA)+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera.">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li><li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis.">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li><li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies.">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li><li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).</li><li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+(IgA)+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+(MIF)+method:+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit.">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li><li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies:+current+state+and+perspectives.">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li><li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+rabies:+a+literature+review.">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li><li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabies-specific+antibodies:+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease.">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).</li></ol>

O teste de IFA aproveita um complexo antígeno-anticorpo, permitindo um local de marcação para visualizar anticorpos específicos da raiva. Células de neuroblastoma ou BHK são semeadas em lâminas de microscópio revestidas com PTFE multipoço e inoculadas com a cepa CVS-11 de laboratório do vírus da raiva. Uma vez confluente a monocamada e atingida a infectividade desejada de aproximadamente 50%, as lâminas são armazenadas até ficarem prontas para uso6.
O soro...

O teste de anticorpos fluorescentes indiretos (RIFI) antirrábicos é usado para detectar vários isotipos de anticorpos específicos da raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. É um dos muitos testes disponíveis para o acompanhamento de um paciente antirrábico antemortem. É especialmente útil para a detecção precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune de um paciente à infecção por raiva. Quando usado em conjunto com outros testes, história do caso e status de vacinação do paciente, o teste de IFA pode ajudar a determinar a exposição ao vírus da raiva ou a uma vacina1. Como o teste de RIFI mede IgM e/ou IgG, os valores do anticorpo específico podem indicar um período de tempo aproximado da exposição ao antígeno1. Esse teste pode ser útil nos aplicativos listados ou em outros ainda não explorados.
Existem vários ensaios sorológicos para raiva disponíveis. O teste rápido de inibição de foco fluorescente (RFFIT), o teste de neutralização do vírus de imunofluorescência (FAVN) ou modificações destes são os principais métodos para medir anticorpos neutralizantes contra o vírus da raiva (RNVR)1. No entanto, esses testes não diferenciam anticorpos IgM e IgG. Quando diferenciar o isotipo de anticorpos é importante no monitoramento da resposta imune da raiva, os testes de IFA antirrábica e ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) da raiva são usados, mas não medem RVNAs. Embora os testes de RIFI e ELISA possam ser usados para determinar a presença de anticorpos específicos contra a raiva em uma amostra, existem algumas diferenças na forma como são executados. O teste de IFA utiliza um vírus vivo cultivado em células como substrato antigênico, enquanto um ELISA típico para detecção de raiva utiliza uma ou mais proteínas virais. Em um ambiente de laboratório onde o vírus da raiva pode ser cultivado, o teste de IFA pode ser mais facilmente realizado em vez de comprar ou cultivar proteínas virais individuais para o ELISA. A finalidade do teste e as informações obtidas a partir dos resultados de qualquer ensaio sorológico antirrábico devem ser consideradas ao determinar qual escolher2.
A IgM é a primeira a responder, aumentando até que a mudança de classe seja observada por volta do 28º dia, quando a IgG se torna o anticorpo circulante predominante3. Assim, a IgM só seria esperada por um período limitado de tempo após a exposição ao vírus da raiva ou à vacinação. O teste do soro e do líquido cefalorraquidiano (LCR) pode indicar se a exposição foi por meio de vacinação, na qual os anticorpos seriam vistos apenas no soro, ou de uma infecção viral, que potencialmente mostraria anticorpos no LCR1.
Foi estabelecido que os anticorpos antirrábicos persistem por vários anos após a profilaxia pré-exposição (PrEP)4. O teste de IFA pode ser uma ferramenta útil para demonstrar isso em diferentes momentos após a vacinação ou exposição.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25x55mm glass cover slips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgG Labeled Conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human IgM Labeled Conjugate</td>
			<td>SeraCare</td>
			<td>5230-0286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipette tip</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK-21 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BION IFA Diluent</td>
			<td>MBL BION</td>
			<td>DIL-9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with FITC filter</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gullsorb IgM inactivation reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-043-158</td>
			<td>IgG Inactivation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7513</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Media Eagle &#8211; w/Earle&#8217;s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0643</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Neuroblastoma Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well Teflon coating glass slides</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.6&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3032</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5100, 5500 or 6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride crystals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dropper</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma pre-set crystals pH 9.0</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9693</td>
			<td>Mountant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>260300</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>EGM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rabies igg and igm antibodies using the rabies indirect fluorescent antibody test

O teste de imunofluorescência indireta (RIFI) antirrábica foi desenvolvido para detectar vários isotipos de anticorpos específicos contra a raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. Este teste fornece resultados rápidos e pode ser usado para detectar anticorpos antirrábicos em vários cenários diferentes. O teste de IFA antirrábica é especialmente útil para a detecção rápida e precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune em um paciente que desenvolveu raiva. Embora outros métodos para o diagnóstico antemortem da raiva tenham precedência, este teste pode ser utilizado para demonstrar a exposição recente ao vírus rábico através da detecção de anticorpos. O teste de IFA não fornece um título de anticorpos neutralizantes do vírus (VNA), mas a resposta de profilaxia pré-exposição (PrEP) pode ser avaliada através da presença de anticorpos positivos ou negativos. Este teste pode ser utilizado em várias situações e pode fornecer resultados para vários alvos diferentes. Neste estudo, usamos várias amostras de soro pareadas de indivíduos que receberam PrEP e demonstramos sua presença de anticorpos antirrábicos ao longo do tempo usando o teste de RIFI.

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Todas as amostras de soro foram coletadas dos pacientes aproximadamente nos mesmos períodos de tempo após a PrEP. As amostras foram testadas de cinco pacientes diferentes nos seguintes momentos: 2 semanas após a inoculação final da vacina antirrábica, 6 meses após a série de vacinas antirrábicas e 18 meses após a série de vacinas antirrábicas. Cada amostra de soro foi diluída em série e graduada para presença de IgM e IgG, conforme descrito nas etapas 5.2 e 5.3 do protocolo. O valor de anticorpos atribuíd...

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Rabies-Specific Antibody Isotypes Detection in Sera or Cerebral Spinal Fluid Using an IFA Test (Video) | JoVE

O objetivo deste artigo é examinar o uso do teste de imunofluorescência indireta da raiva para a detecção de anticorpos IgG e IgM específicos para raiva.

Detecção de anticorpos IgG e IgM antirrábicos pelo teste de imunofluorescência indireta da raiva

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

O teste de RIFI avalia a resposta de anticorpos durante a infecção por raiva ou avalia a resposta imune das vacinas. Ele pode ser usado para estabelecer a presença de anticorpos em uma amostra e distinguir quais isotipos de anticorpos estão presentes. Os ensaios de anticorpos neutralizantes são o padrão-ouro para a detecção de anticorpos antirrábicos para avaliar o título de anticorpos em uma pessoa que recebeu profilaxia pré ou pós-exposição.Embora um teste de IFA possa produzir resultados diferentes de um ensaio de anticorpos neutralizantes, ele ainda pode fornecer informações valiosas quando usado como alternativa. Normalmente, ensaios que medem anticorpos neutralizantes da raiva avaliam a resposta imune. No entanto, esses testes levam vários dias, exigindo cultura de vírus e células vivas.O teste de IFA permite a preparação avançada de lâminas de antígeno para teste com resultados em poucas horas em comparação com dias. O uso dos testes de IFA em casos de raiva humana pode levar a mais respostas sobre como o sistema imunológico de um indivíduo responde à infecção por raiva. Há grande variação entre os casos, e esse exame pode fornecer resultados em tempo real durante a doença.