Name: Author Spotlight: Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Uploaded: 2023-06-23T13:30:00
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Apreciamos enormemente el valioso asesoramiento proporcionado por el Prof. J.P. van Pijkeren (Universidad de Wisconsin-Madison), cuya orientación sobre el trabajo con L. reuteri ATCC PTA 6475 proporcionó una base para los métodos descritos aquí.

1. Preparación de células electrocompetentes de L. reuteri DSM20016
NOTA: Esto se basa en un protocolo de Berthier et al.17, con velocidades de centrifugación informadas por Rattanachaikunsopon et al.18.
<ol><li>En un tubo de centrífuga de 50 ml, inocular L. reuteri de la cal de glicerol en 6 ml de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora ...

Measurement of Reporter Proteins in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

<ol>
	<li>Makarova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+lactic+acid+bacteria.">Comparative genomics of the lactic acid bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxonomic+note+on+the+genus+Lactobacillus:+Description+of+23+novel+genera,+emended+description+of+the+genus+Lactobacillus+beijerinck+1901,+and+union+of+Lactobacillaceae+and+Leuconostocaceae.">A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).</li><li>Adams, M. 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J., Klaenhammer, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+mini-prep+isolation+of+high-quality+plasmid+DNA+from+Lactococcus+and+Lactobacillus+spp.">Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp.</a> Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).</li><li>Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+expression+vectors+in+Lactobacillus+reuteri+strains.">Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains.</a> FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).</li><li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REBASE-a+database+for+DNA+restriction+and+modification:+Enzymes,+genes+and+genomes.">REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D298-D299 (2015).</li><li>Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+reuteri+with+electroporation:+Studies+on+the+erythromycin+resistance+plasmid+pLUL631.">Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631.</a> Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).</li></ol>

El paso más crítico para la transformación de L. reuteri DSM20016 es la generación de condiciones de crecimiento anaeróbico después de que las transformaciones son plateadas; Las colonias obtenidas en condiciones aeróbicas son muy ocasionales y generalmente no crecen cuando se inoculan en caldo MRS. También se debe practicar el recubrimiento de todo el volumen de recuperación para maximizar la probabilidad de crecimiento de la colonia. Incluso con estos dos pasos críticos, la eficiencia de la transform...

El género Lactobacillus se clasificó históricamente como grampositivo, en forma de bastoncillos, no formadores de esporas, anaerobios facultativos o microaerófilos que descomponen los azúcares para producir principalmente ácido láctico1. Estos criterios sueltos llevaron a Lactobacillus a ser, fenotípica y genotípicamente, un género extremadamente diverso. Esta amplia categorización dio lugar a la reclasificación del género, introduciendo 23 nuevos géneros en 20202.
El género antiguo, más amplio, incluía las principales especies comensales y probióticas generalmente consideradas seguras (GRAS) para el consumo3. La familia Lactobacillaceae mantiene una percepción pública de ser "bacterias buenas" debido a muchos beneficios para la salud reportados otorgados a través del consumo de varias cepas 4,5,6,7. La facilidad con la que pueden navegar por el tracto gastrointestinal8 y su aceptación pública se combinan para posicionar a las cepas de Lactobacillaceae como candidatos fuertes como organismos de chasis para aplicaciones medicinales, terapéuticas o de diagnóstico ingeribles.
La amplia gama de características presentes dentro de la familia Lactobacillaceae ha llevado a una situación en la que no existe una cepa de organismo modelo de facto; Los grupos de investigación han tendido a seleccionar las especies con las propiedades más relevantes para sus objetivos particulares. (Por ejemplo, los laboratorios de fermentación láctea podrían elegir L. lactis; los estudios de fermentación vegetal podrían seleccionar L. plantarum; la investigación sobre probióticos podría centrarse en L. acidophilus; y así sucesivamente).
Esta misma amplia gama de características entre especies ha llevado a una acumulación de protocolos y procedimientos que pueden funcionar bien para un subconjunto de la familia Lactobacillaceae , pero requieren optimización para funcionar eficientemente (o tal vez para funcionar en absoluto) en otros9. Esta necesidad de optimización entre los miembros de la familia e incluso dentro de los miembros de la misma especie puede frustrar los esfuerzos de investigadores desconocidos. Los protocolos publicados en las secciones de métodos de los documentos también pueden incluir sus propias modificaciones10, lo que lleva a colecciones de protocolos fragmentadas y descentralizadas.
L. reuteri se considera un comensal ampliamente vertebrado, que se encuentra consistentemente en los tractos gastrointestinales (GI) de mamíferos, aves11 y peces12. Las subcepas de L. reuteri a menudo están genéticamente especializadas, a través de la adaptación de proteínas de adhesión al moco, para colonizar de forma más permanente huéspedes nativos específicos 8,11,13. Las especies de Limosilactobacillus del tracto gastrointestinal pueden aislarse en huéspedes fuera de su huésped nativo, pero tienden más hacia una naturaleza transitoria8.
Debido a la especialización humano-huésped, L. reuteri se DSM20016 posiciona muy bien como un chasis para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas en cualquier punto del tracto gastrointestinal humano, y la DSM20016 de la cepa podría proporcionar una ventana de efecto más duradera para las intervenciones en comparación con cepas más transitorias.
En este documento, describimos una serie de protocolos con efectividad demostrada en Limosilactobacillus reuteri (designación de cepa: F275; otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con información centralizada sobre la cepa de otras fuentes para ayudar en aplicaciones de biología molecular y de sistemas. Los procedimientos establecidos en este documento deben permitir a un investigador sin experiencia previa para cultivar L. reuteri, crear existencias electrocompetentes, seleccionar colonias transformadas, confirmar la transformación a través de la reacción en cadena de la polimerasa de colonias (PCR) y medir la respuesta del sistema diseñado a través de proteínas reporteras fluorescentes.
Observamos que los protocolos relacionados han cubierto la recombinación del genoma de ssDNA asistida por CRISPR-Cas9 en L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)14, y la edición del genoma asistida por nickasa CRSIPR-Cas9 en múltiples tinciones de la familia Lactobacillaceae no L. 15,16; sin embargo, estos no abordan la cepa de L. reuteri DSM20016 que es nuestro enfoque aquí.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3200L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1145J12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)</td>
			<td>Beckman Allegra&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>No longer in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnaeroGen 2.5 L Sachet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OXAN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX, ECM 399 electroporation system</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58017-984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel x6 loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7024S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E5389-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electroporation bath/dock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76314-748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>GLY001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Limosilactobacillus reuteri</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>DSM20016</td>
			<td>Strain designation F275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>LYS702.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>LMCT1.7B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit (Qiagen)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRS Broth (Dehydrated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CM0359B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutanolysin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M9901-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1064691000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2.5 Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>STF-A120S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal benchtop microcentrifuge</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>E200100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTC-150 Thermal Cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>N/A</td>
			<td>No longer in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRKH3_slpGFP (modified)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRONIC 200 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-281700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-222-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer 50x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td>No longer in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR 1500E incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>No longer in production</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for electroporation and transformation confirmation in limosilactobacillus reuteri dsm20016

Lactobacillus era un género increíblemente grande y diverso de bacterias que comprendía 261 especies, varias de las cuales eran cepas comensales con el potencial de su uso como chasis para esfuerzos biológicos sintéticos dentro del tracto gastrointestinal. La amplia variación fenotípica y genotípica observada dentro del género condujo a una reciente reclasificación y la introducción de 23 nuevos géneros.
Debido a la amplitud de las variaciones dentro de los géneros antiguos, los protocolos demostrados en un miembro pueden no funcionar como se anuncia con otros miembros. La falta de información centralizada sobre cómo manipular exactamente cepas específicas ha llevado a una serie de enfoques ad hoc , a menudo adaptados de otras familias bacterianas. Esto puede complicar las cosas para los investigadores que comienzan en el campo, que pueden no saber qué información se aplica o no a la cepa elegida.
En este documento, nuestro objetivo es centralizar un conjunto de protocolos con éxito demostrado, específicamente en la designación de cepa Limosilactobacillus reuteri F275 (otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con consejos de solución de problemas y problemas comunes que uno puede encontrar. Estos protocolos deberían permitir a un investigador con poca o ninguna experiencia trabajando con L. reuteri DSM20016 transformar un plásmido, confirmar la transformación y medir la retroalimentación del sistema en un lector de placas a través de una proteína reportera.

The genus Lactobacillus were historically classified as gram-positive, rod-shaped, non-spore-forming, either facultative anaerobes or microaerophiles that break sugars down to primarily produce lactic acid1. These loose criteria led to Lactobacillus being, phenotypically and genotypically, an extremely diverse genus. This broad categorization resulted in the genus being reclassified, introducing 23 novel genera in 20202.
The old, broader genus included major commensal and probiotic species generally regarded as safe (GRAS) for consumption3. The Lactobacillaceae family maintains a public perception of being &#39;good bacteria&#39; due to many reported health benefits bestowed via the consumption of various strains4,5,6,7. The ease with which they can navigate the gastrointestinal tract8 and their public acceptance combine to position Lactobacillaceae strains as strong candidates as chassis organisms for ingestible medicinal, therapeutic, or diagnostic applications.
The wide range of characteristics present within the Lactobacillaceae family has led to a situation in which there is no de facto model-organism strain; research groups have tended to select species with the properties most relevant to their particular aims. (For example, dairy fermentation labs could choose L. lactis; studies of vegetable fermentation might select L. plantarum; research on probiotics might focus on L. acidophilus; and so on.)
This same wide range of characteristics across species has led to an accumulation of protocols and procedures that may work well for one subset of the Lactobacillaceae family, but require optimization to work efficiently (or perhaps to function at all) in others9. This need for optimization between family members and even within members of the same species can frustrate the efforts of unfamiliar researchers. Protocols published in the methods sections of papers can also include their own modifications10, leading to fragmented, decentralized protocol collections.
L. reuteri is considered a widely vertebrate commensal, found consistently in mammalian, avian11 and fish12 gastrointestinal (GI) tracts. L. reuteri sub-strains are often genetically specialized, via mucus adhesion protein adaptation, to more permanently colonize specific native hosts8,11,13. GI tract Limosilactobacillus species can be isolated in hosts outside their native host, but tend more toward a transient nature8.
Due to human-host specialization, L. reuteri DSM20016 positions itself very well as a chassis for diagnostic or therapeutic applications at any point in the human GI tract, and the strain DSM20016 could provide a longer-lasting window of effect for interventions when compared to more transitory strains.
In this paper, we outline a series of protocols with demonstrated effectiveness in Limosilactobacillus reuteri (strain designation: F275; other collection numbers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), along with centralized information on the strain from other sources to aid in molecular and systems biology applications. Procedures laid out herein should enable a researcher with no prior experience to culture L. reuteri, create electrocompetent stocks, select transformed colonies, confirm transformation via colony polymerase chain reaction (PCR), and measure designed system response via fluorescent reporter proteins.
We note that related protocols have covered CRISPR-Cas9 assisted ssDNA genome recombineering in L. reuteri (strain: ATCC-PTA-6475)14, and CRSIPR-Cas9 nickase-assisted genome editing in multiple non-L. reuteri, Lactobacillaceae family stains15,16; these do not, however, address the L. reuteri DSM20016 strain that is our focus here.

Author Spotlight: Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016  

Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Eficiencias de transformación L. reuteri no requiere un plásmido no metilado dcm-/dam, como se observa para otras Lactobacillaceae19,20 (ver Figura 1). La electroporación de L. reuteri DSM20016 con 10 μL del plásmido de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (origen de replicación theta pAMβ1) debe dar eficiencias de transformación de aproximadamente 80 unidades formadoras ...

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Aquí, presentamos protocolos para trabajar con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detallando el crecimiento, la transformación de plásmidos, la PCR de colonias, la medición de proteínas reporteras fluorescentes y la mini-preparación limitada de plásmidos, así como problemas comunes y solución de problemas. Estos protocolos permiten la medición de proteínas reporteras en DSM20016, o la confirmación a través de PCR de colonias si no hay ningún informador involucrado.

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for ...

L.Reuteri, y específicamente la cepa, DSM20016 es un comensal intestinal humano robusto y natural, con una gran promesa para la administración terapéutica y la detección de enfermedades en todo el tracto gastrointestinal. Este trabajo ayudará a posicionar DSM20016 como un chasis de biología sintética para ese tipo de aplicaciones. Los lactobacilales no tienen un organismo modelo específico.Las especies preferidas existen, pero generalmente se eligen con un sesgo hacia objetivos de investigación particulares. La variación dentro de la familia bacteriana ha llevado a protocolos fragmentados, algunos con iteraciones de modificaciones que se remontan a través de publicaciones. Es muy difícil para las personas que comienzan filtrar exactamente lo que es y no es útil.Existe un documento para la transformación de DSM20016, pero no es moderno. Existen protocolos modernos para otros miembros de la familia Lactobacillales, pero no son DSM20016. Aquí nos esforzamos por proporcionar un conjunto de protocolos fácil de usar, centralizado, modernizado y completo para DSM20016 electroporación.Este conjunto de protocolos ofrece una modernización sustancial con respecto al protocolo de exploración DSM20016 anterior, y aclara algunos hilos colgantes, además de enfatizar partes que antes eran menos claras. El conjunto de protocolos también es completo, y específicamente para DSM20016, una cepa para la cual otros protocolos no DSM20016 no son totalmente compatibles. Uno de nuestros principales objetivos es utilizar microbios como sensores y sistemas de entrega de bajo costo.Estamos trabajando con expertos en enfermedades intestinales para usar DSM20016 para detectar las condiciones en el tracto gastrointestinal y administrar terapias según sea necesario.