Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

يشكر المؤلفون شيري دنبار دكتوراه ، ماجستير في إدارة الأعمال من شركة Luminex Corporation (أوستن ، تكساس) لدعم البحث وماثيو سيلفرمان دكتوراه في حلول النشر الطبي الحيوي (بنما سيتي ، فلوريدا ؛ mattsilver@yahoo.com) للمساعدة العلمية والكتابية. تم دعم هذا العمل بجوائز ل Pravin T. P. Kaumaya من المعاهد الوطنية للصحة (R21 CA13508 و R01 CA84356) و Imugene Ltd ، سيدني ، أستراليا (OSU 900600 و GR110567 و GR124326).

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

برافين تي بي كومايا هو مستشار لشركة إيموجين المحدودة.

الغرض من العلاج المناعي للسرطان المرتبط بنقاط التفتيش هو تعطيل التفاعل بين بروتينات نقاط التفتيش وروابطها المهمة في بقاء الورم وتطوره2. تعمل هذه المجموعة البحثية بنشاط على تطوير لقاحات جديدة PD-1 و PD-L1 تثير استجابة الأجسام المضادة التي تستهدف وتقطع نقطة تفتيش PD-1 / PD-L13،8،13،14. في السابق ، تم إجراء نوعين مختلفين من مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) لتقييم آثار الأجسام المضادة للببتيد المضاد ل PDL1 على تثبيط تفاعل PD1 / PD-L1 المؤتلف14. (1) في البديل الأول ، تم طلاء rhPD-L1 على صفيحة عيار ميكروي ، ثم تم تحضين الصفيحة بأجسام مضادة مخففة للقاح PDL1. ثم تم تقييم تثبيط تفاعل PD-1 / PD-L1 المؤتلف بواسطة الأجسام المضادة عن طريق إضافة rhPD-1 البيوتينيل وتحديد الارتباط ب rhPD-L1 المتجمد باستخدام اقتران البيروكسيديز الستربتافيدين والفجل والركيزة اللونية. عرفنا هذا على أنه فحص الحصار المباشر. (2) في البديل الثاني ، تم طلاء PD-1 على لوحة المعايرة الدقيقة. تم تحضين rhPD-L1 البيوتينيل مسبقا مع كل من الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي يسببها المرشح المضاد ل PLD1 في أنابيب تفاعل منفصلة. ثم تمت إضافة مخاليط rhPDL1 / anti-PDL1 إلى آبار الألواح التي تحتوي على rhPD-1 المتجمد وسمح لها بالتفاعل. تم الكشف عن أي rhPDL1 الذي تفاعل مع rhPD-1 المتجمد في وجود الأجسام المضادة التي يحتمل أن تكون حاصرة PDL1-Vaxx مع streptavidin-HRP اللاحق وحضانة الركيزة اللونية. عرفنا هذا على أنه مقايسة الحصار العكسي.
أظهر الحصار العكسي لتفاعل PD-1 / PD-L1 المؤتلف بواسطة الأجسام المضادة للببتيد PDL1 تثبيطا للإشارة (أي حصار PD-1 / PD-L1) بطريقة تعتمد على تركيز الأجسامالمضادة 14 ، في حين أن نهج الحصار المباشر لم يقدم نتائج متسقة (غير معروضة). تم تطوير مقايسة الحصار المزدوج القائم على الخرزة للتحقق من نتائج ELISA والتحقيق في حصار تفاعل PD-1 / PD-L1 في مرحلة السوائل ، مما يلغي مشاكل توفر العوائق / الارتباط المحتملة المرتبطة بشل حركة البروتينات المؤتلفة على قيعان الآبار. ارتبط تحليل الكرة المجهرية ارتباطا مباشرا بنتائج حجب ELISA باستخدام مقايسة الحصار العكسي (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر المقايسات المناعية القائمة على التألق حساسية محسنة للمقايسة ونطاقا ديناميكيا موسعا مقارنة ب ELISAs18 اللوني ، علاوة على ذلك ، يسمح الفحص القائم على الخرزة المتعددة بالأداء المتزامن لمقايستين مناعيتين مستقلتين ضمن تفاعل واحد. ربما أدى السلفو-NHS و EDC المستخدم في الاقتران التساهمي للكرات المجهرية إلى rhPD-1 إلى اختلافات الأداء التي لوحظت بين مقايسات الحصار المباشر والحصار العكسي والاختلافات الملحوظة في الحساسية بين مقايسات تفاعل PD-1 / PD-L1 المؤتلفة القائمة على حبة ELISA و Luminex. هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيقات على المستوى الكيميائي والجزيئي لدراسة الآليات المحتملة المسؤولة عن هذه الاختلافات.
يوضح كل من ELISA14 والمقايسات القائمة على الخرزة أن الأجسام المضادة المضادة ل PDL1 التي يسببها PDL1-Vaxx يمكن أن تمنع تكوين معقد نقطة تفتيش PD1 / PD-L1. يحفز PDL1-Vaxx القائم على الببتيد بنجاح الأجسام المضادة المضادة ل PDL1 التي يمكن أن تمنع تفاعل PD-1 / PD-L1. قد يكون هذا النهج بمثابة استراتيجية علاجية جديدة لعلاج السرطان ، كما تدعمها الدراسات الحيوانية قبل السريرية3،13،14. ستحدد التجارب السريرية المخطط لها فعالية PDL1-Vaxx للعلاج المناعي لنقاط التفتيش والسيطرة على الأمراض لدى مرضى السرطان.

في الخلايا التائية والخلايا البائية ونقاط التفتيش داخل الخلايا في الجهاز المناعي ، تنظم مسارات الإشارات أنشطة المناعة. تحمي بعض الخلايا السرطانية نفسها من الهجوم المناعي عن طريق تحفيز أهداف نقاط التفتيش ، والتي تمنع وظيفة المناعة وتعزز بقاء الأورام وتكاثرها. يستخدم العلاج المناعي للأورام عن طريق تثبيط نقاط التفتيش الأجسام المضادة لاستهداف نقاط التفتيش التي تشير ومنعها ، وبالتالي استعادة الوظائف المضادة للأورام في الجهاز المناعي1،2،3. تشمل العلاجات المضادة للسرطان عالية الفعالية حاليا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة نيفولوماب ، التي تستهدف بروتين الموت المبرمج 1 (PD-1) 4 ، وأتيزوليزوماب ، الذي يستهدف ليجند الموت المبرمج 1 (PD-L1) 5. وقد أظهر هذا النهج نجاحا سريريا كبيرا في علاج مرضى السرطان. ومع ذلك ، يتم تخفيف الفائدة السريرية لاستراتيجيات تثبيط نقاط التفتيش الحالية من خلال الأحداث الضائرة ومقاومة العلاج ، خاصة في العلاج أحادي العامل6. هناك حاجة ماسة إلى مزيج من العلاج المناعي والاستراتيجيات العلاجية الأكثر فعالية مع سمية أقل في علاج السرطان1،3،6.
على مدى السنوات ال 30 الماضية ، طور مختبر الدكتور كومايا لقاحات سرطان الببتيد والعوامل المرتبطة بتقليد الببتيد لعلاج السرطان ، وبعضها في التجارب السريرية الجارية1،2،7،8،9،10،11،12،13،14. على سبيل المثال ، أظهر B-Vaxx مع العلاج المناعي المركب HER-2 فوائد للمرضى ضد الأورام الصلبة النقيلية و / أو المتكررة في التجارب السريرية12. أحدث لقاحات السرطان في المختبر هي PD1-Vaxx 2,13 و PDL1-Vaxx14 ، والتي أظهرت مزايا كبيرة في الدراسات قبل السريرية ، وخاصة في العلاج المركب. أكمل PD1-Vaxx التجارب السريرية لتصعيد الجرعة في الولايات المتحدة وأستراليا. سيتم دمج PD1-Vaxx مع أتيزوليزوماب في تجربة المرحلة 1 ب التي ستبدأ في مايو 2023. يركز هذا التقرير على تقييم قدرة الأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx على منع تفاعل PD-1 / PD-L1.
لقاح السرطان PDL1-Vaxx هو لقاح جديد لببتيد الخلايا البائية مع الأحماض الأمينية PD-L1 130-147 المرتبطة بببتيد اندماج فيروس الحصبة في الخلايا التائية (MVF) عبر رابط الببتيد GPSL. أظهرت الدراسات قبل السريرية أن PDL1-Vaxx مناعي للغاية في تحفيز إنتاج الأجسام المضادة المضادة للسرطان في نماذج حيوانية مختلفة ، ويطيل البقاء على قيد الحياة ، ويقلل من عبء الورم14. يمكن لهذه الأجسام المضادة المتولدة ضد الببتيد PD-L1 أن تمنع بنجاح تفاعل PD1 / PD-L1 ، مما يؤدي إلى نشاط مضاد للأورام. يقدم هذا التقرير مقايسة تحلل الحصار المفروض على تكوين مركب PD1 / PD-L1 بواسطة الأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx باستخدام تنسيق قائم على حبة مغناطيسية مع قراءة مزدوجة المراسل على أداة قياس التدفق الخلوي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

أظهر تثبيط مستقبلات نقاط التفتيش (PD-1 و PD-L1 و CTLA-4) بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة فائدة كبيرة في التجارب السريرية لعلاج مرضى السرطان وأصبح نهجا أساسيا في العلاج المناعي الحديث للسرطان. ومع ذلك ، فإن مجموعة فرعية فقط من المرضى تستجيب للعلاج المناعي للأجسام المضادة وحيدة النسيلة عند نقطة التفتيش. لذلك ، من الملح تطوير استراتيجيات علاجية جديدة ضد السرطان. تم تطوير لقاح جديد للسرطان من ببتيد الخلايا البائية PDL1 (رابط الموت المبرمج 1) ، مع الأحماض الأمينية 130-147 المرتبطة بببتيد MVF ("بروتين اندماج فيروس الحصبة في الخلايا التائية المختلطة") عبر رابط GPSL. أشارت الاختبارات قبل السريرية إلى أن لقاح PDL1 (PDL1-Vaxx) يحفز بشكل فعال الأجسام المضادة عالية المناعة في. تظهر المحصنة ب PDL1-Vaxx انخفاضا في عبء الورم ومعدلات بقاء ممتدة في نماذج مختلفة من سرطان. تشير آليات العمل إلى أن الأجسام المضادة المستحثة باللقاحات تمنع تكاثر الخلايا السرطانية ، وتحفز موت الخلايا المبرمج ، وتمنع تفاعل PD-1 / PD-L1. تقدم هذه المخطوطة مقايسة قائمة على الخرزة المغناطيسية تستخدم نظام تحليل تدفق المراسل المزدوج لتقييم تفاعل PD-1 / PD-L1 وحصاره بواسطة الأجسام المضادة المضادة ل PDL1 المرفوعة ضد PDL1-Vaxx.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

كان الفحص قادرا على التحديد الكمي الدقيق لتثبيط تفاعل PD-1 / PD-L1 بواسطة أربعة أجسام مضادة متعددة النسيلة فريدة من نوعها ، تم إنشاؤها ضد ببتيدات لقاح rhPD-L1 ، والتي يتم استكشافها كعوامل علاجية محتملة للسرطان. يتم توفير مخطط لهذا الفحص في الشكل 1. تم قياس كمية البيوتينيل rhPD-L1 المرتبطة بالخرز المترافق rhPD-1 وتثبيط هذا الارتباط بواسطة الأجسام المضادة الأربعة المرشحة للأجسام المضادة التي يسببها PLD1-Vaxx في قناة Reporter 1 باستخدام كاشف الكشف عن streptavidin-PE الذي يربط مباشرة rhPD-L1 (الشكل 2).
منعت جميع الأجسام المضادة الأربعة متعددة النسيلة المضادة ل PDL1-peptide تفاعل rhPD-L1 مع PD-1 الذي تم تجميده على الكرات المجهرية بدرجات متفاوتة. تراوحت النسبة المئوية لتثبيط الأجسام المضادة المختلفة للببتيد المضاد ل PDL1 من 48٪ إلى 74٪ عند أقصى تركيز تم اختباره وهو 1000 ميكروغرام / مل. حقق الجسم المضاد أحادي النسيلة ذو التحكم الإيجابي أتيزوليزوماب حصارا بنسبة 92٪ لتفاعل PD-1 / PD-L1 عند أقصى تركيز تم اختباره14 من 4 ميكروغرام / مل (الشكل 2). أظهرت جميع الأجسام المضادة التجريبية PDL1-Vaxx تثبيطا يعتمد على التركيز لارتباط rhPD-L1 بالخرز المترافق rhPD-1 مقارنة مع تراستوزوماب ، الجسم المضاد للتحكم السلبي الذي لم يكن من المتوقع أن يتفاعل مع نظام PD-1 / PD-L1.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> الشكل 2: حصار تفاعل rhPD-L1 مع rhPD-1 مقترنا بالخرز المغناطيسي بواسطة الأجسام المضادة للببتيد PDL1 ، كما هو موضح في اختبار مناعي جديد قائم على حبة الفلورسنت. اقترن PD-1 البشري المؤتلف بالكريات المجهرية المغناطيسية ، ثم تم تحضين الخرزات ب rhPD-L1 البيوتينيل الذي تم تحضينه مسبقا بأجسام مضادة مختلفة مضادة للببتيد PDL1. تم استخدام كاشف الكشف عن الستربتافيدين - فيكوريثرين لربط البيوتين ، وبالتالي تقييم الكمية النسبية من rhPD-L1 التي كانت متاحة للارتباط ب PD-1. تم اختبار الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي أثيرت في الأرانب ضد لقاحات الببتيد PDL1 (مضاد PDL1 [36] ، مضاد PDL1 [50] ، مضاد PDL1 [95] ، ومضاد PDL1 [130]) للنشاط المثبط وأظهر حصارا بنسبة 48٪ -74٪ لتفاعلات PD-1 / PD-L1 المؤتلفة عند أعلى تركيز تم اختباره. تم استخدام Atezolizumab (جسم مضاد أحادي النسيلة مختلف مضاد ل PDL1) كعنصر تحكم إيجابي. تم استخدام تراستوزوماب الأجسام المضادة أحادية النسيلة التجارية غير ذات الصلة (anti-HER2) كعنصر تحكم سلبي. هذا الرقم مقتبس من Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> الشكل 3: الارتباط المقارن لمختلف الأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx إلى rhPD-L1 المعقدة إلى الخرز المغناطيسي المغلف ب rhPD1. تم استخدام الجسم المضاد للكشف الثانوي البنفسجي اللامع 421 مترافقا لمقارنة ارتباط الأجسام المضادة المختلفة متعددة النسيلة المضادة للببتيد PDL1 ب rhPD-L1 عبر حبات rhPD-1 المغلفة. تم تسجيل إشارة التألق الأزرق BV421 في قناة المراسل 2 لأداة المراسل المزدوج. ترتبط هذه الإشارة بكفاءة الربط النسبية للأجسام المضادة التجريبية المضادة للببتيد PDL1. تم استخدام Trastezumab (مضاد HER2) ، وهو جسم مضاد وحيد النسيلة يستهدف نقطة تفتيش مختلفة عن PD-1 / PD-L1 ، كعنصر تحكم سلبي. يمثل MFI متوسط شدة مضان الخرز المتوسط ، والذي تم قياسه في آبار التفاعل المكررة لكل حالة. هذا الرقم مقتبس من Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تمت مقارنة القدرات النسبية للأجسام المضادة المرشحة التجريبية الأربعة التي يسببها PDL1-Vaxx لربط rhPD-L1 باستخدام نظام كشف منفصل (BV421-conjugated anti-rabbit IgG) الذي تم تقييمه على قناة المراسل الثانية للأداة. أشارت هذه النتائج إلى أن جميع الأجسام المضادة الأربعة متعددة النسيلة المضادة لببتيد PDL1 مرتبطة ب rhPD-L1 بطريقة تعتمد على التركيز14 (الشكل 3). أظهر الجسم المضاد ل PDL1 (130) أعلى إشارة ربط rhPDL1 من أربعة مرشحين للأجسام المضادة التي يسببها PDL1-Vaxx.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

مثبطات نقاط التفتيش هي أهداف مهمة في تطوير علاجات للمعركة ضد السرطان. يقدم هذا التقرير لقاحا جديدا للسرطان قائم على الببتيد PDL1 ، PDL1-Vaxx ، والذي يحفز على تحييد إنتاج الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي تمنع تكوين مركب PD-1 / PDL1. يوضح هذا العمل أيضا تطوير واختبار مقايسة قائمة على حبة الفلورسنت لتحليل هذا النشاط.

تحليل تدفق المراسل المزدوج القائم على حبة الفلورسنت المغناطيسية لحصار الأجسام المضادة الناجم عن لقاح الببتيد PDL1-Vaxx لتفاعل PD-1 / PD-L1

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

يركز مشروعنا بقيادة البروفيسور برافين كاومايا على تطوير لقاحات الببتيد الببتيد للخلايا البائية التي يمكن استخدامها لتعزيز جهاز المناعة لمكافحة السرطان بشكل أفضل. نعتقد أن لقاحات الببتيد التي تستهدف أهداف نقاط التفتيش المناعية يمكن دمجها مع علاجات أخرى لتحسين نتائج المرضى. أردنا اختبار قدرة حجب الأجسام المضادة ل PD-L1 في مقايسة الميكروبيدات التقليدية حيث كان بروتين PD-L1 البشري المؤتلف مرتبطا بخرز MagPlex.وجدنا أنه بمجرد ربط PD-L1 بالخرز ، كان لديهم قدرة ربط منخفضة ل PD-1 ligand. هذا منعنا من استخدام هذا الطريق لاختبار الحجب. عندما يمنع ربط البروتين بالخرز الارتباط بالليجند أو الأجسام المضادة ، فإن المعالجة المسبقة بالأجسام المضادة الاختبارية في المحلول هي خيار ، ثم تضيف لاحقا حبات مغلفة بالليجند إلى خليط مانع الهدف.يمكن فحص تفاعلهم. قد يكون هذا مسارا مختلفا لدراسة نفس التفاعل المرتبط بالهدف لقد طورنا لقاحات السرطان B-Vaxx و PD1-Vaxx و PDL1-Vaxx و CTLA4-Vaxx. تستهدف هذه اللقاحات HER2 وتشارك العديد من علامات نقاط التفتيش المناعية في أشكال مختلفة من السرطان.B-Vaxx و PD1-Vaxx في التجارب السريرية الجارية في أستراليا والولايات المتحدة. نأمل أن تفيد لقاحات نقاط التفتيش المناعية لدينا المزيد من المرضى. في تجارب المجهرية السابقة ، وجدنا أن PD-1 تفاعل بشكل جيد مع ليجند PD-L1. لذلك ، قمنا بإعادة هندسة البروتوكول ، وربط الأجسام المضادة للببتيد المضادة ل PD-L1 مسبقا ببروتين PD-L1 البيوتينيل قبل إضافة حبات MagPlex الموسومة ب PD-1.سمح لنا ذلك باختبار أجسامنا المضادة لقدرتها على منع تفاعل PD-1 / PD-L1. سنواصل التركيز على العلاجات المناعية المركبة التي تتغلب على مقاومة العلاج. نريد أيضا استكشاف علاجات مركبة أكثر فعالية تمنع نمو الورم بشكل أفضل ، وتمنع ورم خبيث ، وتطيل معدلات بقاء المريض.