Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Forfatterne takker Sherry Dunbar PhD, MBA of Luminex Corporation (Austin, TX) for forskningsstøtte og Matthew Silverman PhD of Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for videnskabelig og skriftlig bistand. Dette arbejde blev støttet af priser til Pravin T. P. Kaumaya fra National Institutes of Health (R21 CA13508 og R01 CA84356) og Imugene Ltd, Sydney, Australien (OSU 900600, GR110567 og GR124326).

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

Pravin T.P. Kaumaya er konsulent for Imugene, Ltd.

Formålet med checkpoint-relateret cancerimmunterapi er at forstyrre interaktionen mellem checkpoint-proteiner og deres vigtige ligander i tumoroverlevelse og progression2. Denne forskergruppe udvikler aktivt nye PD-1- og PD-L1-vacciner, der fremkalder et antistofrespons, der er målrettet mod og afbryder PD-1 / PD-L1-kontrolpunktet 3,8,13,14. Tidligere blev to variationer af enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er) udført for at evaluere virkningerne af anti-PDL1-peptidantistoffer på hæmningen af den rekombinante PD1/PD-L1-interaktion14. (1) I den første variant blev rhPD-L1 overtrukket på en mikrotiterplade, og derefter blev pladen inkuberet med fortyndede anti-PDL1-vaccinekandidatinducerede antistoffer. Inhiberingen af antistoffernes rekombinante PD-1/PD-L1-interaktion blev derefter evalueret ved tilsætning af biotinyleret rhPD-1 og kvantificering af bindingen til det immobiliserede rhPD-L1 under anvendelse af et streptavidin-peberrodsperoxidasekonjugat og et kolorimetrisk substrat. Vi definerede dette som den direkte blokadeanalyse. (2) I den anden variant blev PD-1 belagt på mikrotiterpladen. Biotinyleret rhPD-L1 blev præinkuberet med hvert af de anti-PLD1 kandidatinducerede polyklonale antistoffer i separate reaktionsrør. RhPDL1/anti-PDL1-blandingerne blev derefter tilsat pladebrøndene indeholdende immobiliseret rhPD-1 og fik lov til at reagere. Enhver rhPDL1, der reagerede med den immobiliserede rhPD-1 i nærvær af de potentielt blokerende PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer, blev påvist med efterfølgende streptavidin-HRP og kolorimetrisk substratinkubation. Vi definerede dette som omvendt blokadeanalyse.
Den omvendte blokade af den rekombinante PD-1/PD-L1-interaktion med anti-PDL1-peptidantistoffer viste hæmning af signalet (dvs. PD-1/PD-L1-blokade) på en antistofkoncentrationsafhængig måde14, mens den direkte blokadetilgang ikke gav konsistente resultater (ikke vist). Det perlebaserede dual-reporter-blokadeassay blev udviklet for at verificere ELISA-resultaterne og undersøge blokaden af PD-1/PD-L1-interaktionen i en væskefase, hvilket eliminerer de potentielle problemer med sterisk hindring/bindingsepitoptilgængelighed forbundet med immobilisering af rekombinante proteiner på brøndbunden. Mikrosfæreanalysen var direkte korreleret med ELISA-blokeringsresultaterne ved anvendelse af omvendt blokadeanalyse (figur 2). Derudover kan fluorescensbaserede immunoassays give forbedret analysefølsomhed og et udvidet dynamisk område sammenlignet med kolorimetriske ELISA'er18, og yderligere tillader det multipleksede perlebaserede assay samtidig udførelse af to uafhængige immunoassays inden for en enkelt reaktion. Sulfo-NHS og EDC, der anvendes til kovalent kobling af mikrosfærerne til rhPD-1, kan have ført til de præstationsforskelle, der ses mellem de direkte blokade- og omvendte blokadeassays og de observerede forskelle i følsomhed mellem ELISA- og Luminex-perlebaserede rekombinante PD-1/PD-L1-interaktionsassays. Yderligere undersøgelse på kemisk og molekylært niveau er berettiget for at undersøge de mulige mekanismer, der er ansvarlige for disse forskelle.
Både ELISA14 og de perlebaserede assays viser, at PDL1-Vaxx-inducerede anti-PDL1-antistoffer kan hæmme PD1/PD-L1 checkpoint-kompleksdannelse. Den peptidbaserede PDL1-Vaxx inducerer med succes anti-PDL1-antistoffer, der kan blokere PD-1 / PD-L1-interaktionen. Denne tilgang kan tjene som en ny terapeutisk strategi til behandling af kræft, som understøttet af prækliniske dyreforsøg 3,13,14. Planlagte kliniske forsøg vil bestemme effekten af PDL1-Vaxx til checkpoint immunterapi og sygdomskontrol hos kræftpatienter.

I immunsystemets T-celler, B-celler og intracellulære kontrolpunkter regulerer signalveje immunaktiviteter. Nogle kræftceller beskytter sig mod immunangreb ved at stimulere checkpoint-mål, som hæmmer immunfunktionen og fremmer neoplastisk overlevelse og spredning. Onkologisk immunterapi ved checkpoint-hæmning bruger antistoffer til at målrette og blokere signalkontrolpunkterne og dermed genoprette immunsystemets anti-neoplastiske funktioner 1,2,3. Meget effektive anticancerbehandlinger omfatter i øjeblikket de monoklonale antistoffer nivolumab, som er rettet mod programmeret dødsprotein 1 (PD-1)4, og atezolizumab, som er målrettet mod programmeret dødsligand 1 (PD-L1)5. Denne tilgang har vist stor klinisk succes i behandlingen af kræftpatienter. Den kliniske anvendelighed af de nuværende checkpoint-hæmningsstrategier afbødes imidlertid af bivirkninger og behandlingsresistens, især i enkeltstofbehandling6. En kombination af immunterapi og mere effektive terapeutiske strategier med lavere toksicitet er presserende nødvendig i kræftbehandling 1,3,6.
I løbet af de sidste 30 år har Dr. Kaumaya's laboratorium udviklet peptidcancervacciner og peptidefterligningsrelaterede midler til kræftbehandling, hvoraf nogle er i igangværende kliniske forsøg 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . For eksempel har B-Vaxx med HER-2 kombinationsimmunterapi vist patientfordele mod metastatiske og / eller tilbagevendende solide tumorer i kliniske forsøg12. Laboratoriets nyeste kræftvacciner er PD1-Vaxx 2,13 og PDL1-Vaxx14, som har vist store fordele i prækliniske studier, især i kombinationsbehandling. PD1-Vaxx har gennemført kliniske forsøg med dosiseskalering i USA og Australien. PD1-Vaxx vil blive kombineret med atezolizumab i fase 1b-studiet, der starter i maj 2023. Denne rapport fokuserer på at evaluere PDL1-Vaxx-inducerede antistoffers evne til at blokere PD-1/PD-L1-interaktionen.
PDL1-Vaxx kræftvaccinen er en ny B-celle peptidepitopvaccine med PD-L1 aminosyrer 130-147 bundet til det promiskuøse T-celle mæslingevirus fusion (MVF) peptid via en GPSL peptid linker. Prækliniske undersøgelser har vist, at PDL1-Vaxx er stærkt immunogen til stimulering af anticancerantistofproduktion i forskellige dyremodeller, forlænger overlevelsen og reducerer tumorbyrden14. Disse antistoffer genereret mod PD-L1-peptidet kan med succes blokere PD1 / PD-L1-interaktionen, hvilket resulterer i anti-neoplastisk aktivitet. Denne rapport introducerer et assay, der analyserer blokaden af PD1 / PD-L1-kompleksdannelse ved PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer ved hjælp af et magnetisk perlebaseret format med en dobbeltreporteraflæsning på et flowcytometriinstrument.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

Hæmningen af checkpoint-receptorer (PD-1, PD-L1 og CTLA-4) med monoklonale antistoffer har vist stor fordel i kliniske forsøg til behandling af kræftpatienter og er blevet en grundpille i moderne kræftimmunterapi. Imidlertid reagerer kun en delmængde af patienter på checkpoint monoklonal antistofimmunterapi. Derfor er det presserende at udvikle nye terapeutiske strategier mod kræft. En ny B-celle peptidepitop PDL1 (programmeret dødsligand 1) kræftvaccine er blevet udviklet, med aminosyrer 130-147 bundet til MVF-peptidet ("promiskuøs" T-celle mæslingevirus fusionsprotein) via en GPSL-linker. Prækliniske test har vist, at denne PDL1-vaccine (PDL1-Vaxx) effektivt stimulerer stærkt immunogene antistoffer hos dyr. Dyr immuniseret med PDL1-Vaxx viser reduceret tumorbyrde og udvidede overlevelsesrater i forskellige dyrecancermodeller. Virkningsmekanismerne indikerer, at vaccinefremkaldte antistoffer hæmmer tumorcelleproliferation, inducerer apoptose og blokerer PD-1 / PD-L1-interaktionen. Dette manuskript introducerer et magnetisk perlebaseret assay, der bruger et dual-reporter flowanalysesystem til at evaluere PD-1 / PD-L1-interaktionen og dens blokade af anti-PDL1-antistofferne hævet mod PDL1-Vaxx.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Assayet var i stand til præcist at kvantificere hæmningen af PD-1 / PD-L1-interaktionen med fire unikke polyklonale antistoffer, genereret mod rhPD-L1-vaccinepeptiderne, der undersøges som potentielle kræftterapeutiske midler. Skemaet for dette assay er vist i figur 1. Mængden af biotinyleret rhPD-L1, der bandt til rhPD-1-konjugerede perler, og hæmningen af denne binding af de fire PLD1-Vaxx-inducerede antistofkandidater blev målt i Reporter Channel 1 ved hjælp af et streptavidin-PE-detektionsreagens, der direkte bandt rhPD-L1 (figur 2).
Alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer blokerede rhPD-L1-interaktionen med PD-1, der var blevet immobiliseret på mikrosfærer i varierende omfang. Hæmningsprocenten for de forskellige anti-PDL1-peptidantistoffer varierede fra 48 % til 74 % ved den maksimalt testede koncentration på 1.000 μg/ml. Det positive monoklonale kontrolantistof atezolizumab opnåede 92 % blokade af PD-1/PD-L1-interaktionen ved den maksimale testede koncentration14 på 4 μg/ml (figur 2). Alle de eksperimentelle PDL1-Vaxx-antistoffer viste koncentrationsafhængig hæmning af rhPD-L1-binding til rhPD-1-konjugerede perler sammenlignet med trastuzumab, det negative kontrolantistof, der ikke forventedes at interagere med PD-1/PD-L1-systemet.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figur 2: Blokade af rhPD-L1-interaktion med rhPD-1 koblet til magnetiske perler af anti-PDL1-peptidantistoffer, som vist ved et nyt fluorescerende perlebaseret immunoassay. Rekombinant human PD-1 blev koblet til magnetiske mikrosfærer, og perlerne blev derefter inkuberet med biotinyleret rhPD-L1, der var blevet præinkuberet med forskellige anti-PDL1-peptidantistoffer. Et streptavidin-phycoerythrindetektionsreagens blev anvendt til at binde biotinet og dermed vurdere den relative mængde rhPD-L1, der var tilgængelig til at binde til PD-1. Polyklonale antistoffer rejst hos kaniner mod PDL1-peptidvaccinerne (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] og anti-PDL1[130]) blev testet for hæmmende aktivitet og viste 48%-74% blokade af rekombinante PD-1/PD-L1-interaktioner ved den højeste testede koncentration. Atezolizumab (et andet anti-PDL1 monoklonalt antistof) blev anvendt som den positive kontrol. Det ikke-relaterede kommercielle monoklonale antistof trastuzumab (anti-HER2) blev anvendt som en negativ kontrol. Denne figur er tilpasset fra Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figur 3: Sammenlignende binding af forskellige PDL1-Vaxx-inducerede antistoffer mod rhPD-L1 kompleksbundet til rhPD1-belagte magnetiske perler. Brilliant violet 421-konjugeret sekundært detektionsantistof blev brugt til at sammenligne bindingen af forskellige kaninpolyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer til rhPD-L1 via rhPD-1-coatede perler. BV421 blå fluorescenssignal blev optaget i Reporter Channel 2 i dobbeltreporterinstrumentet; dette signal korrelerer med den relative bindingseffektivitet af de eksperimentelle anti-PDL1-peptidantistoffer. Trastezumab (anti-HER2), et monoklonalt antistof, der er rettet mod et andet kontrolpunkt end PD-1 / PD-L1, blev brugt som en negativ kontrol. MFI repræsenterer den gennemsnitlige perlemedian fluorescensintensitet, som blev målt i dobbeltreaktionsbrønde pr. Tilstand. Denne figur er tilpasset fra Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
De relative evner af de fire eksperimentelle PDL1-Vaxx-inducerede kandidatantistoffer til at binde rhPD-L1 blev sammenlignet ved hjælp af et separat detektionssystem (BV421-konjugeret anti-kanin IgG), der blev evalueret på instrumentets anden reporterkanal. Disse resultater indikerede, at alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer bundet til rhPD-L1 på en koncentrationsafhængig måde14 (figur 3). Anti-PDL1(130)-antistoffet viste det højeste rhPDL1-bindingssignal af de fire PDL1-Vaxx-inducerede antistofkandidater.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Checkpoint-hæmmere er vigtige mål i udviklingen af terapier til kampen mod kræft. Denne rapport introducerer en ny PDL1-peptidbaseret kræftvaccine, PDL1-Vaxx, som inducerer neutraliserende polyklonal antistofproduktion, der blokerer PD-1/PDL1-kompleksdannelse. Dette arbejde beskriver også udviklingen og testningen af et fluorescerende perlebaseret assay til analyse af denne aktivitet.

Magnetisk fluorescerende perlebaseret dual-reporter flowanalyse af PDL1-vaxx peptidvaccineinduceret antistofblokade af PD-1 / PD-L1-interaktionen

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Vores projekt ledet af professor Pravin Kaumaya er fokuseret på at udvikle B-celle epitoppeptidvacciner, der kan bruges til at styrke immunsystemet til bedre at bekæmpe kræften. Vi mener, at peptidvacciner rettet mod immunkontrolpunktsmål endda kan kombineres med andre terapier for at forbedre patientresultaterne. Vi ønskede at teste blokeringsevnen af vores anti PD-L1-antistoffer i et traditionelt mikroperleassay, hvor humant rekombinant PD-L1-protein var bundet til MagPlex-perler.Vi fandt ud af, at når PD-L1 var bundet til perlerne, havde de en lav bindingskapacitet for sin PD-1-ligand. Dette forhindrede os i at bruge denne mulighed for at teste blokering. Når binding af protein til perler hæmmer binding til ligand eller antistoffer, er forbehandling med testantistofferne i opløsning en mulighed, senere tilsætning af ligandbelagte perler til målblokkerblandingen.Deres samspil kan undersøges. Dette kan være en anden vej til at studere den samme mål-ligandbindende interaktion Vi har udviklet kræftvacciner mod B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx og CTLA4-Vaxx. Disse vacciner er rettet mod HER2, og flere immunkontrolpunktmarkører er involveret i forskellige former for kræft.B-Vaxx og PD1-Vaxx er i igangværende kliniske forsøg i Australien og USA. Vi håber, at vores immuncheckpoint-vacciner vil gavne flere patienter. I tidligere mikrosfæreeksperimenter fandt vi, at PD-1 interagerede godt med sin ligand PD-L1. Derfor rekonstruerede vi protokollen og præbindende anti-PD-L1-peptidantistofferne til biotinyleret PD-L1-protein, før vi tilføjede PD-1-mærkede MagPlex-perler.Dette gjorde det muligt for os at teste vores antistoffer for deres evne til at blokere PD-1/PD-L1-interaktion. Vi vil fortsat fokusere på kombinationsimmunterapier, der overvinder behandlingsresistens. Vi ønsker også at udforske mere effektive kombinationsbehandlinger, der bedre hæmmer tumorvækst, forhindrer metastaser og forlænger patientens overlevelsesrater.